HPLC-MS法檢測鹽酸美金剛片中N-（二甲基金剛烷）甘氨酸的含量

黃引，蔡國偉，鐘瑩，肖穎，秦飛，賴燁才*，林順權（1.廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，廣州 510515；2.廣東省化學藥原料與制劑關鍵技術研究企業(yè)重點實驗室，廣州 510515；.廣州牌牌生物科技有限公司，廣州 51050）

鹽酸美金剛（memantine hydrochloride），化學名為1-氨基-3，5-二甲基金剛烷鹽酸鹽，是一類新的通過阻斷

N

-甲基-

D

-天門冬氨酸（NMDA）受體作用于谷氨酸能系統(tǒng)從而治療阿爾茨海默病的藥物。鹽酸美金剛可抑制興奮性神經(jīng)傳遞遞質谷氨酸的過度釋放，減輕鈣離子過多所致的神經(jīng)元細胞中毒、損傷和死亡，從而改善阿爾茨海默病患者的癥狀，具有耐受性良好、用藥安全的特點。隨著仿制藥一致性評價工作的開展，國內對藥品雜質研究的重視程度越來越高，對于雜質控制與評價的先進理念、關鍵技術的需求也越來越大，藥品儲存過程中降解雜質會隨著儲存時間的延長而增加，有效控制降解雜質是亟需解決的問題。鹽酸美金剛片在長期儲存過程中，與輔料微晶纖維素會發(fā)生美拉德反應，產(chǎn)生降解雜質

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸，化學名為（3，5-二甲基-1-金剛烷）氨基乙酸，分子式為CHNO，化學結構見圖1。制劑中輔料硬脂酸鎂的存在，會使pH 升高從而促進美拉德反應，使

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的含量增高。同時，在本文中影響因素試驗堿性破壞條件下，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量明顯增高，進一步證明堿性條件對美拉德反應有促進作用。

圖1 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸的化學結構式Fig 1 Chemical formula of N-（dimethyl-monosane）glycine

為了更好地控制藥品質量，保證用藥安全，建立快速有效的檢測方法對雜質

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行嚴格控制至關重要。鹽酸美金剛及其相關雜質的結構式和紫外吸收全波長掃描光譜圖均顯示無特征吸收和末端吸收，因此無法采用紫外-可見光檢測器對雜質進行定量；另外，TLC法存在分離能力差、重現(xiàn)性差、靈敏度低等缺點，目前鹽酸美金剛含量測定及雜質的定量檢測多采用氣相色譜（GC）法。前期研究發(fā)現(xiàn)，GC 法對于降解雜質

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸并不適用，推測此雜質在GC 中容易發(fā)生高溫降解而影響檢測。進口注冊標準中以0.1%三氟乙酸水溶液作為流動相，梯度洗脫30 min，單離子模式（SIM）同時對美金剛乳糖加合物和

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行檢測。因本文研究的鹽酸美金剛片工藝中未涉及乳糖的使用，無需對美金剛乳糖加合物進行研究控制；同時為減少長期使用三氟乙酸對質譜儀造成的損傷，擬采用甲酸水溶液替換三氟乙酸水溶液并在質譜多反應監(jiān)測模式（MRM）下等度洗脫（運行時間10 min），對目標雜質

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行快速、準確的定量控制。最低本文建立了一種高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS）分析方法對鹽酸美金剛片中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行定量檢測，并對方法進行了驗證，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1260-AB Sciex 4000 液相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；Sartorius CPA 225D 型分析天平（德國Sartorius 公司）；Merck Millipore Milli-Q 實驗室超純水系統(tǒng)（德國Merck Millipore公司）。

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品（TRC，批號：6-NSR-122-1，含量：98%）；鹽酸美金剛片（廣州醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，批號：01171202、01171203、01171204，規(guī)格：10 mg）；甲醇、甲酸（美國Merck 公司，色譜純）；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 液相色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex Luna C（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%（

V

/

V

）甲酸水溶液-甲醇（30∶70）為流動相，等度洗脫；流速：0.5 mL·min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL，運行時間：10 min。2.1.2 質譜條件 采用三重四極桿質譜檢測器，電噴霧離子源（ESI）；電噴霧電壓為3500 V；離子源溫度為500℃；以高純氮氣為干燥氣；二級碰撞能（CE）為2 V；正離子模式下選擇質荷比為（

m

/

z

）238.1/163.3 的離子對進行定性定量檢測，質譜圖見圖2，裂解途徑見圖3。

圖2 全掃描質譜圖（A）和離子對提取質譜圖（B）Fig 2 Full scan mass spectrogram（A）and ion-pair extraction mass spectrogram（B）

圖3 N-（二甲基金剛烷）甘氨酸的裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of N-（dimethyl-monosane）glycine

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 取

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品適量，精密稱定，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋制成1 μg·mL的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液適量，用甲醇-水（50∶50）分別稀釋制成質量濃度為0.01、0.03、0.10、0.20、0.30、0.50、0.70 和1.00 μg·mL的標準曲線系列對照品溶液。2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 稱取適量的

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋成1 μg·mL的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.3 供試品溶液 取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋制成0.1 mg·mL的溶液，作為供試品溶液。

2.2.4 破壞試驗用溶液

① 空白輔料：取空白輔料適量，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋至刻度，作為空白輔料溶液。

② 酸破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，加入0.1 mol·L鹽酸溶液1 mL，于80 ℃水浴加熱2 h，用0.1 mol·L氫氧化鈉溶液中和，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為酸破壞供試品溶液。

③ 堿破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，加入0.1 mol·L氫氧化鈉溶液1 mL，于80 ℃水浴加熱2 h，用0.1 mol·L鹽酸溶液中和，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為堿破壞供試品溶液。

④ 高溫破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，置80℃水浴中加熱2 h 后冷卻至室溫，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為高溫破壞供試品溶液。

⑤ 氧化破壞：取本品1 片，置100 mL 量瓶中，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，加入30%過氧化氫溶液1 mL，置80 ℃水浴中加熱2 h 后冷卻至室溫，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為氧化破壞供試品溶液。

⑥ 光照破壞：取本品1 片，置蒸發(fā)皿內，用適量甲醇-水（50∶50）溶解，于254 nm 紫外波長下照射2 h 后，將溶液移至100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，作為光照破壞供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性要求

取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進樣6 次，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰面積的

RSD

不得大于10.0%，保留時間的

RSD

不得大于2.0%。

2.4 測定法

本文所有色譜圖均由Analyst 軟件1.6.3 版本采集積分產(chǎn)生。標準曲線由MultiQuant 3.0.2 軟件采用二次回歸擬合方程

y

＝a

x

＋b

x

＋c 繪制，其中

y

為對照品溶液中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的峰面積，

x

為

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的質量濃度，相關系數(shù)

r

應不小于0.998。在結果解析方程中，取系列對照品溶液質量濃度范圍內，質量濃度與峰面積成正相關的值作為

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的質量濃度，計算出其相對于鹽酸美金剛的含量。

2.5 系統(tǒng)適用性

取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進樣6 次，記錄

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的峰面積和保留時間，并計算相應

RSD

值，結果

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰面積

RSD

為2.3%，保留時間

RSD

為0.1%，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.6 專屬性試驗

按照“2.1”項下色譜條件，分別測定“2.2.4”項下的酸、堿、高溫、氧化及光照破壞條件下的各供試品溶液，結果空白溶液及空白輔料對檢測無干擾，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰面積在堿破壞的條件下有明顯增加，在酸、高溫、氧化和光照破壞條件下無明顯增加，并且已破壞樣品溶液經(jīng)本檢測方法檢測均只顯

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸峰，表明鹽酸美金剛片經(jīng)酸、堿、高溫、氧化和光照破壞后，均無其他雜質干擾，方法專屬性強，見圖4。

圖4 專屬性試驗色譜圖Fig 4 Chromatograms of specificity test

2.7 線性關系考察

按照“2.2.1”項下方法配制一系列線性溶液，取各線性溶液10 μL 進樣，記錄峰面積。結果顯示

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的擬合方程為

y

＝ －0.5200

x

＋6993

x

－2626，

r

＝0.9998，其在0.0102 ～0.102 00 μg·mL與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關系。

2.8 檢測限與定量限

精密稱取

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品適量，用甲醇-水（50∶50）溶解并定量稀釋制成一定濃度的樣品溶液，按“2.1”項下條件測定。信噪比（

S

/

N

）約為3 作為檢測限，

S

/

N

約為10 作為定量限，結果

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的檢測限為3.2 pg，定量限為14.7 pg。

2.9 加樣回收試驗

將鹽酸美金剛片劑1 片置于100 mL 量瓶中，用甲醇-水（50∶50）適量溶解，再精密加入

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸對照品溶液（102 μg·mL）250 μL，用甲醇-水（50∶50）稀釋至刻度，搖勻，作為50%限度測試溶液。同法配制100%和150%限度測試溶液。每個濃度配制3 份，分別按“2.1”項下條件測定，計算回收率。結果顯示，

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的加樣回收率在92.5%～105.7%，

RSD

＜6.5%，符合方法學要求，見表1。

表1 加樣回收率結果
Tab 1 Recovery of standard addition

限度測試溶液加入量/（μg·mL－1）實測量/（μg·mL－1）回收率/%平均回收率/%RSD/%50%0.2550.2925102.0103.81.8 0.2550.3020105.7 0.2550.2971103.8 100%0.5100.5377 99.1 99.03.9 0.5100.5172 95.1 0.5100.5564102.8 150%0.7650.8158102.4 99.7 6.3 0.7650.8297104.2 0.7650.7403 92.5

2.10 重復性

取同一批樣品，按“2.2.3”項下方法配制6份供試品溶液，測定其中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的含量，結果

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸的含量

RSD

為2.9%，保留時間

RSD

為0.30%，表明方法重復性好。

2.11 耐用性

通過改變流動相流速、柱溫來評估測定條件有微小變動時，對測定結果的影響，結果在各個色譜條件參數(shù)下，測得的6 份待測樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量

RSD

均≤10.0%，符合要求，見表2。

表2 耐用性結果
Tab 2 Durability test

系統(tǒng)適用性峰面積RSD（n ＝6）/%參數(shù)含量/%RSD/%保留時間RSD（n ＝6）/%標準曲線柱溫/℃280.0278.22.50.20y ＝－0.0466x2 ＋6272x ＋4485，r ＝0.9998 300.0312.30.14y ＝－0.5200x2 ＋6993x－2626，r ＝0.9998 320.0271.00.24y ＝－0.2971x2 ＋6597x ＋2404，r ＝0.9997流速/（mL·min－1） 0.4860.0318.82.10.060y ＝－1.2271x2 ＋7535x－3015，r ＝0.9999 0.5000.0322.30.14y ＝－0.5200x2 ＋6993x－2626，r ＝0.9998 0.5150.0274.10.30y ＝0.0777x2 ＋5888x ＋3434，r ＝0.9998

2.12 樣品檢測結果

取鹽酸美金剛片3 批0 d 樣品和3 批30℃長期試驗樣品（36 個月），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，結果3 批0 d樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸均未檢出，3 批30℃長期試驗樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量均為0.2%，樣品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸含量均符合限度要求（＜0.5%），結果見表3。

表3 -(二甲基金剛烷)甘氨酸的含量測定結果
Tab 3 Content of -(dimethyl-monosane) glycine

批號含量/%01171202（0 d）0 01171203（0 d）0 01171204（0 d）0 01171202（30℃，36 個月） 0.2 01171203（30℃，36 個月） 0.2 01171204（30℃，36 個月） 0.2

3 總結

降解雜質

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸在放置過程中會隨著時間的延長而增加，目前針對此雜質定量研究的文獻報道較少，僅有鹽酸美金剛片的進口藥品注冊標準對此雜質進行了定量控制。本研究采用HPLC-MS 法對

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸進行定量檢測，有效解決了因目標物紫外吸收弱而無法使用液相色譜法、因易發(fā)生高溫降解而無法使用氣相色譜法檢測的難題。該方法可操作性強、靈敏度高、檢測時間短，可應用于鹽酸美金剛產(chǎn)品中

N

-（二甲基金剛烷）甘氨酸雜質的檢測與控制。