Thaulin-1多肽對耐藥金黃色葡萄球菌的抗耐藥性實驗

趙恩亮

上世紀(jì)20 年代末，國外英國細菌學(xué)家、生物化學(xué)家、微生物學(xué)家亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)了青霉素[1]，作為一種極具滅菌作用的抗生素藥物[2]，為人類的傳染病控制開啟了新的篇章[3]。近年來，抗生素的廣泛應(yīng)用為患者帶來了諸多臨床獲益，但隨著抗生素濫用引發(fā)的耐藥情況也逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點關(guān)注問題[4-6]?，F(xiàn)階段臨床認(rèn)為抗生素耐藥性是影響醫(yī)院感染以及重癥患者感染死亡的主要影響因素[7-9]，而耐萬古霉素、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌為臨床常見抗性菌株[10-11]?？咕闹饕獮樯锾烊环烙到y(tǒng)中的重要組成部分，主要存在于動植物及微生物組織中[12-13]，當(dāng)前所發(fā)現(xiàn)抗菌肽種類已超過3 000 種，研究人員對抗菌肽結(jié)構(gòu)分類的重視程度逐年升高[14-15]。研究觀察了人工合成Thaulin-1 多肽對臨床耐藥金黃色葡萄球菌的抗耐藥性，根據(jù)研究結(jié)果明確Thaulin-1 肽對多種臨床常見菌的殺菌、抑菌作用，促進Thaulin-1 肽類物質(zhì)作為新型抗生素基質(zhì)的研究，為抗菌多肽藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采用多肽固相合成法合成Thaulin-1

（1）Rink amide MBHA 樹脂的處理：使用天平準(zhǔn)確稱取250 mg 的Rink amide MBHA 樹脂，用5 mL 的經(jīng)脫水處理的二氯甲烷（dichloromethane，DCM）過夜浸泡，浸泡時間要超過12 h；

（2）Rink amide MBHA 樹脂上Fmoc 保護基脫除：將過夜浸泡處理的Rink amide MBHA 樹脂加入到多肽合成管中，采用真空減壓抽濾系統(tǒng)徹底除去二氯甲烷（DCM）。加入10 mL 含有20%哌啶的二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）剪切溶液，在恒溫?fù)u床以50 轉(zhuǎn)/min 速度震蕩20 min，采用真空減壓抽濾系統(tǒng)除去合成管中的二甲基甲酰胺（DMF）剪切液。依次用二氯甲烷（DCM），異丙醇和二甲基甲酰胺（DMF）洗3 次。氨基酸保護基（Fmoc 保護基）脫除效率和多肽產(chǎn)率的密切相關(guān)，因此脫保護過程一定要重復(fù)進行。后面的連接過程中Fmoe 保護基脫除過程皆按照該步進行。

（3）活化氨基酸羧基及連接反應(yīng)：使用天平準(zhǔn)確稱取0.8 mmol Fmoc-AA-OH，分別加入0.45 mmol HBTU，0.45 mmol HOBT 和220ulDIEA 后，在恒溫?fù)u床以50 轉(zhuǎn)/min 速度震蕩20 min 活化。將活化后的Fmoc-AA-OH 加入到合成管后，加入少量的DMF，再滴入幾滴DCM，使樹脂懸浮，在恒溫?fù)u床以50 轉(zhuǎn)/min 速度震蕩反應(yīng)，（具體反應(yīng)時間視氨基酸進行調(diào)整）

（4）茚三酮法檢測：反應(yīng)結(jié)束后，采用真空減壓抽濾系統(tǒng)抽濾除去反應(yīng)溶液，依次用二氯甲烷（DCM），異丙醇和二甲基甲酰胺（DMF）洗3 次。用不銹鋼取樣簽蘸取少量的樹脂加入到1.5 mL EP 管中，加入50 uL檢測溶液A、B、C 混勻后，水浴加熱5 min 后觀察檢測結(jié)果。若樹脂為透亮黃色，則表明連接反應(yīng)（3）反應(yīng)完全，若樹脂為藍紫色，則表明反應(yīng)不徹底，需要重復(fù)進行連接反應(yīng)（3）。

溶液A：0.5 g 水合茚三酮溶于10 mL 乙醇中配制。

溶液B：8 g 熔融苯酚溶解在2 mL 乙醇中。

溶液C：9.8 mL 吡啶與0.2 mL KCN 溶液混勻。

（5）肽鏈上的Fmoc 保護基的脫除，具體操作同步驟2。

（6）重復(fù)3～5 步驟的反應(yīng)，連接下一個氨基酸。

（7）Thaulin-1 肽N 端乙?；簽樘岣叨嚯牡姆€(wěn)定性，我們在合成的過程中，對Thaulin-1 肽進行N 端乙酰化處理。當(dāng)Thaulin-1 肽序列連接完成之后，向合成管中加入10 mL 多肽剪切溶液，在恒溫?fù)u床以50 轉(zhuǎn)/min 速度震蕩20 min，真空減壓抽濾系統(tǒng)除去合成管中的剪切溶液。依次用DCM.異丙醇和DMF 洗Rink amide MBHA 樹脂3 次。加入4 mL DMF 后，再加入DCM 充分Rink amide MBHA 樹脂。按0.2 mmol 樹脂中加入500 uL乙酸酐，800 uL DIEA；在恒溫?fù)u床以50 轉(zhuǎn)/min 速度震蕩20 min，用DCM 沖洗3 次，用茚三酮方法檢測乙?；磻?yīng)是否完全；檢測反應(yīng)完全后，依次用DCM（5 mL）、DMF（5 mL）、DCM（5 mL）、MeOH（5 mL）、DCM（5 mL）沖洗Rink amide MBHA 樹脂3 次。采用氮氣吹干方式，徹底除去樹脂中的有機溶劑。

（8）Rink amide MBHA 樹脂上Thaulin-1肽側(cè)鏈保護基及多肽鏈的剪切：向氮氣徹底吹干的Rink amide MBHA樹脂中分別加入10 mL TFA/TIS／水（90%/5%/5%），在恒溫?fù)u床以50 轉(zhuǎn)/min 速度震蕩3 h。用G5 砂芯漏斗過濾剪切混合液到無水乙醚中沉淀多肽，通過真空冷凍干燥，得到Thaulin-1 肽粗品。利用制備型高效液相色譜反相柱技術(shù)進行分離純化。利用WIDEPORE XB-C18 柱（4.6 mm×150 mm；3.6 μm particle size），應(yīng)用AB 線性梯度（0.1% 乙腈/min），流速為1 mL/min,溶液A 是蒸餾水（0.1%三氟乙酸），溶液B 是色譜乙腈（0.1%三氟乙酸）。對制備得到的Thaulin-1 肽純品進行質(zhì)譜鑒定。

1.2 采用圓二色譜技術(shù)測定Thaulin-1 肽的二級結(jié)構(gòu)

Thaulin-1 肽分子在不同介質(zhì)中的結(jié)構(gòu)將用圓二色譜來測定。50 mol/L 的磷酸緩沖液同時包含100 mol/L氯化鉀（KP buffer:50 mol/L 磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀，100 mol/L 氯化鉀，pH 7.4）的溶液將用來代表溫和生理條件下的水介質(zhì)。疏水介質(zhì)用在50 mol/L 的磷酸緩沖液同時包含100 mol/L 氯化鉀（pH 7.4）的溶液中加入三氟乙醇（TFE）（KP buffer：KCl=1:1）來代表。多肽分子的平均殘基摩爾橢圓率用[θ]=θ/10lcMn 公式來計算，利用其在222 nm 的平均殘基摩爾橢圓率來獲得多肽的相對螺旋度。

1.3 采用微量肉湯稀釋法測定Thaulin-1 肽抗菌活性

微量肉湯稀釋法是測定抗菌肽的最低抑菌濃度MIC最常用的方法，相比紙片法和牛津杯法而言，微量肉湯稀釋法操作簡單，結(jié)果重現(xiàn)性高。從-80℃冰箱中取出凍存的細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株，涂布LB 固體培養(yǎng)基平板，37℃倒置培養(yǎng)24 h。挑取細菌單克隆菌落用MH 培養(yǎng)基180 轉(zhuǎn)/min 培養(yǎng)，待細菌OD600 nm 達到0.4 以上后，用培養(yǎng)基稀釋細菌的終濃度為5×105 CFU/mL。按90 μL/孔加入到96 孔板內(nèi)，將抗菌肽梯度稀釋（2 000μg/mL，1 800 μg/mL，1 600 μg/mL，1 400 μg/mL，1 200 μg/mL，1 000 μg/mL，800 μg/mL，600 μg/mL，400 μg/mL，200 μg/mL，100 μg/mL，50 μg/mL）后，按10 μL/孔加入，37℃培養(yǎng)24 h，測定OD590 nm，計算MIC。MIC 定義為殺死全部耐藥細菌和標(biāo)準(zhǔn)株細菌的最低多肽濃度。

1.4 采用Thaulin-1 肽對人臍靜脈內(nèi)皮細胞作用測定細胞毒性

將凍存于液氮中的人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUV-EC 取出，用37℃溫水迅速化開后，無菌條件下（超凈工作臺紫外燈照射30 min 以上）接種到含20%血清（杭州四季青生物科技有限公司生產(chǎn)低內(nèi)毒素、無支原體血清）的DMEM 高糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察，待細胞貼壁并正常分裂生長后，改用含10%血清進行培養(yǎng)。取指數(shù)生長期的HUV-EC 細胞用血球計數(shù)板計數(shù)，按0.5×105/L 細胞/孔接種到Corning 96 孔細胞培養(yǎng)板中，3 孔一組；培養(yǎng)24 h 后，待鏡下觀察細胞鋪滿80%以上后，加入Thaulin-1 肽（濃度同MIC 測定）作用24 h；吸取多肽藥物，每孔再加入20 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h；輕輕吸出MTT 溶液，加入150 μL 二甲基亞砜來溶解活細胞產(chǎn)生的顆粒；用ELISA Reader 于550 nm 處測定各孔光密度；Thaulin-1 肽對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUV-EC 的毒性用抑制50%細胞存活率的多肽濃度（IC50）來衡量。未加入多肽溶液的孔作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 多肽固相合成法合成Thaulin-1

Fmoc 固相合成是合成多肽的最高效方法之一。Thaulin-1 肽具有26 個氨基酸，按照其序列從C 端到N端合成（NGNLLGGLLRPVLGVVKGLTGGLGKK），記錄每個氨基酸的連接時間。起始的7 個氨基酸合成，每步連接反應(yīng)需要2 h 左右。中間部分的氨基酸連接，由于自聚集效應(yīng)的存在，因此時間延長到8～12 h 左右，見表1。后續(xù)隨著氨基酸鏈的延伸，反應(yīng)時間有所減短，這與以往的合成時間類似。對合成完畢的Thaulin-1 肽，從樹脂上切除下來并凍干后，使用HPLC 制備并通過質(zhì)譜鑒定，見圖1。Thaulin-1 肽理論分子量為2 572.11，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為2 571.40，表明序列合成無誤，見表2。

圖1 Thaulin-1 肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表1 Thaulin-1 肽Fmoc 固相合成中氨基酸反應(yīng)時間（h）

表2 Thaulin-1 肽合成粗品的液相分析結(jié)果

2.2 Thaulin-1 肽對耐藥菌的抗菌活性

人工合成Thaulin-1 肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行初步活性測試，Thaulin-1 肽對兩株菌株均表現(xiàn)出活性，Thaulin-1 肽具有正凈電荷，根據(jù)實驗結(jié)果分析，Thaulin-1 肽具有較高的抗菌活性，見表3。合成純化和定量的Thaulin-1 肽和Gly-Thaulin-1 肽顯示出相同的最小抑制濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）值，證明其作用機理主要是殺菌劑，不涉及明顯的抑制階段。通過MIC 和MBC 測定表現(xiàn)，Thaulin-1 肽及其類似物Gly-Thaulin-1 肽的活性沒有差異，體現(xiàn)N-末端甘氨酸的存在不影響蛋白質(zhì)的表達，不會改變Thaulin-1 肽的抗菌性能，見表4。

表3 Thaulin-1 肽對耐藥菌的抗菌活性

表4 Thaulin-1 與Gly-Thaulin-1 的抑菌活性測定（μg/mL）

2.3 Thaulin-1 肽對耐藥菌株細胞毒性作用

Thaulin-1 肽對人細胞的毒性很小，檢測結(jié)果表現(xiàn)Thaulin-1 和Gly-thaulin-1 對革蘭氏陰性菌細胞有選擇性作用，但對人類細胞存在一定保護作用。

3 討論

金黃色葡萄球菌主要為葡萄球菌屬，隸屬于革蘭氏陽性菌，是臨床中比較常見的致病菌。近年來，國內(nèi)外臨床廣泛使用抗生素藥物，致使耐藥性金黃色葡萄球菌問題越來約為嚴(yán)重，而耐藥性金黃色葡萄球菌感染也逐漸成為臨床所面臨的嚴(yán)重問題，部分患者呈現(xiàn)多重耐藥表現(xiàn)，對臨床醫(yī)療形成較大困難。抗菌肽主要為生物天然防御系統(tǒng)中的重要組成部分，主要存在于動植物及微生物組織中，當(dāng)前所發(fā)現(xiàn)抗菌肽種類已超過3 000 種，研究人員對抗菌肽結(jié)構(gòu)分類的重視程度逐年升高。在本次研究中主要分析了人工合成Thaulin-1 多肽對臨床耐藥金黃色葡萄球菌的抗耐藥性，通過獲得結(jié)果評價Thaulin-1 肽對多種臨床常見菌的殺菌、抑菌作用，進而為抗菌多肽藥物的研發(fā)提出可靠建議。

Thaulin-1 肽具有抗質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 29213 和大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922 活性，但Thaulin-1 肽抗臨床耐藥菌株活性和作用機制尚未見諸報道。本文以Fmoc 固相合成Thaulin-1 肽和臨床檢驗工作分離得到的耐藥菌株為對象，探索Thaulin-1 對耐藥菌的抗菌活性和作用機制進行研究。

本項試驗結(jié)果體現(xiàn)，Thaulin-1 肽具有26 個氨基酸，按照其序列從C 端到N 端合成（NGNLLGGLLRPV LGVVKGLTGGLGKK），記錄每個氨基酸的連接時間。起始的7 個氨基酸合成，每步連接反應(yīng)需要2 h 左右。中間部分的氨基酸連接，由于自聚集效應(yīng)的存在，因此時間延長到8～12 h 左右。后續(xù)隨著氨基酸鏈的延伸，反應(yīng)時間有所減短，這與以往的合成時間類似。對合成完畢的Thaulin-1 肽，從樹脂上切除下來并凍干后，使用HPLC 制備并通過質(zhì)譜鑒定。Thaulin-1 肽理論分子量為2 572.11，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為2 571.40，表明序列合成無誤。人工合成Thaulin-1 肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行初步活性測試，Thaulin-1 肽對兩株菌株均表現(xiàn)出活性，Thaulin-1 肽具有正凈電荷，根據(jù)實驗結(jié)果分析，Thaulin-1 肽具有較高的抗菌活性。合成純化和定量的Thaulin-1 肽和Gly-Thaulin-1 肽顯示出相同的最小抑制濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）值，證明其作用機理主要是殺菌劑，不涉及明顯的抑制階段。通過MIC 和MBC 測定表現(xiàn)，Thaulin-1 肽及其類似物Gly-Thaulin-1 肽的活性沒有差異，體現(xiàn)N-末端甘氨酸的存在不影響蛋白質(zhì)的表達，不會改變Thaulin-1 肽的抗菌性能。此外，Thaulin-1 肽對人細胞的毒性很小，檢測結(jié)果表現(xiàn)Thaulin-1 和Gly-thaulin-1 對革蘭氏陰性菌細胞有選擇性作用，但對人類細胞存在一定保護作用。