雙黃連注射劑中異綠原酸C致敏兔抗體效價測定

鄧穎穎，徐麗婷，趙曉佳，張恩戶，陳世忠

（1.陜西省西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院藥學部，西安 710100；2.陜西中醫(yī)藥大學藥理教研室，咸陽 712046；3.北京大學藥學院天然藥物學系，北京 100083）

雙黃連注射劑的主要組成成分為金銀花、黃芩、連翹，具有抑菌、抗炎等藥理作用，臨床用于外感風熱所致發(fā)熱、咳嗽等疾病的治療[1-5]。然而，隨著臨床的廣泛應用，有關其不良反應的報道也隨之增多。崔盈盈等[6]應用關聯(lián)規(guī)則Apriori算法發(fā)現(xiàn)，患者在使用雙黃連注射劑后不良反應發(fā)生率占比約為5.62%。馬婷[7]對遼寧某醫(yī)院254例中藥不良反應病例做了調查報道，發(fā)現(xiàn)病例所累及的器官、系統(tǒng)中以皮膚損害最為常見，占比高達53.87%，共計146例，臨床表現(xiàn)多為皮疹、瘙癢等。雙黃連注射劑組成成分復雜，導致過敏反應的具體成分至今尚不明確，有研究[8]指出，致敏成分的存在，是引起過敏反應的主要原因之一。北京大學陳世忠教授團隊采用“在線化合物-牛血清白蛋白（BSA）熒光檢測活性篩選”系統(tǒng)對雙黃連注射劑中的化合物進行在線BSA結合活性篩選，通過對結合常數(shù)、結合位點、化合物與BSA結合強度等的測定和計算，分析出異綠原酸C具有疑似半抗原活性。本實驗是在體外制得異綠原酸C抗血清，模擬雙黃連注射劑進入家兔體內的致敏過程。運用ELISA法檢測原理考證雙黃連注射劑中疑似半抗原物質異綠原酸C是否具有致敏性。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 酶標儀（美國BioTek公司，型號Synergy LX）；異綠原酸C（中國科學院成都生物研究所，生產批號：MUST-14111414）；金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白A交聯(lián)的辣根過氧化物酶（HRP-SPA，北京博爾西科技有限公司，GP：2020.11.02）；弗氏佐劑（美國SIGMA公司，10 mL，SLBD0736）；兔免疫球蛋白E（IgE）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，GP：2020.12.30）；牛血清白蛋白（BSA，上海順勃生物工程技術有限公司，GP：2020.11.28）等。

1.1.2 實驗動物 第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供的體質量在2.5～3.5 kg的普通級雄性新西蘭白兔，實驗動物質量合格證號：No.61000400000021，生產許可證號：SCXK（軍）20120007。動物分籠飼養(yǎng)，保持12 h晝夜節(jié)律，自由飲水攝食。

1.2 實驗方法

1.2.1 異綠原酸C-血漿蛋白全抗原的制備 制備致敏前血清，先將家兔置于兔固定桶內固定，用乙醇擦拭耳朵，使其上的動脈擴張、清晰，采血10 mL。精密稱取2 mg的異綠原酸C，用0.6 mL生理鹽水將其溶解，制成每毫升生理鹽水含有3.3 mg異綠原酸C的溶液，將0.4 mL的致敏前血清與配制好的異綠原酸C溶液混合，37℃溫育2 h，然后將溫育后的溶液與1 mL弗氏佐劑用漩渦混合器震蕩，使其充分乳化混合。

1.2.2 異綠原酸C特異性抗體的測定 對家兔首次免疫使用的是現(xiàn)制備好的抗原液，用剃毛機將距離兔子背部脊柱線3 cm處的毛發(fā)處理干凈，露出粉色皮膚，事先在脊柱兩側用標記筆每隔2 cm均勻地標記10個點，然后用注射器在標記處每點注射0.2 mL抗原液，注射完成后皮膚處有皮丘出現(xiàn)則代表免疫成功，第2天發(fā)現(xiàn)，家兔皮膚表面皮丘轉變?yōu)榻Y痂，隨著時間的更迭，家兔皮膚逐漸恢復。10 d以后，對家兔進行加強免疫，使用與首次免疫劑量相同的弗氏不完全佐劑乳化的抗原液，之后每間隔1周對家兔進行1次加強免疫，加強免疫進行5次后，間隔7 d時間，麻醉家兔進行手術，用注射器自其腹主動脈采血，高速離心機分離全血，取上清液即制得異綠原酸C-血漿蛋白全抗原的抗血清。

1.2.3 試劑的配制1）制備Na2CO3緩沖溶液：取1.465 g Na2CO3和0.795 g NaHCO3置于50 mL量瓶中，用雙蒸水將其完全溶解并定容至刻度處；2）制備2%BSA液：取一個50 mL量瓶，稱取1 g BSA置于其中，用濃度為0.15 mol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）將其溶解并定容至刻度處；3）制備磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）：取一個100 mL量瓶，量取0.05 mL Tween20置于其中，用濃度為0.15 mol·L-1pH 7.4的PBS將其溶解并定容至刻度處；4）制備HRP-SPA、底物液、終止液。

1.2.4 抗體效價的檢測方法[9]1）包被：將異綠原酸C-血漿蛋白全抗原用Na2CO3緩沖液稀釋4倍作為包被原，取一塊96孔板，將制備好的包被原用移液槍每孔滴加110 μL，置于冰箱4℃溫度中包被過夜，取出96孔板，甩盡孔內的液體，然后用PBST洗滌，3次/4 min，每孔滴加2%BSA 130 μL，置于4℃冰箱中封閉過夜；2）加抗血清：洗滌結束后，每孔加入抗血清100 μL（用0.15 mol·L-1pH 7.4的PBS按1∶1～1∶128的比例逐倍稀釋），37℃溫育2 h；3）加酶標二抗：洗滌結束后，每孔加入100 μL HRP-SPA，37℃水預鍋內孵育1 h；4）顯色、終止、測定；5）判定：加致敏前血清的孔設置為陰性對照孔，不加血清的孔設置為空白對照孔，每個樣品設置5個平行對照孔，陽性的評判準則為：相對于陰性對照孔OD≥2倍。

1.2.5 間接競爭ELISA測定抗體特異性 每孔滴加1 mg·mL-1的異綠原酸C-血漿蛋白110 μL作為包被原，封閉洗滌，用0.9%的NaCl2溶液將配制好的4 mg·mL-1的異綠原酸C溶液逐倍稀釋至0.25 mg·mL-1，然后將稀釋后的不同濃度溶液每孔加入50 μL，每孔再加入按1∶1稀釋的抗血清100 μL，37℃孵育2 h；洗滌3次結束后，每孔加入100 μL按1∶200稀釋的酶標抗體HRPSPA，37℃孵育1 h；洗滌、顯色、終止、測定。加稀釋液的孔設置為陽性對照孔，不加異綠原酸C的孔設置為陰性對照孔，并設置5個平行對照孔。應用公式I=（陰性對照孔OD－樣品OD）/（陰性對照孔OD－陽性對照孔OD）×100%[10]計算異綠原酸C的抑制率I（%）。繪制抑制曲線的依據(jù)是，取異綠原酸C濃度的對數(shù)值作為橫坐標，抑制率作為縱坐標。通過回歸分析，建立回歸方程并計算相關系數(shù)R2、IC5（0即指抑制率為50%時所對應的異綠原酸C濃度）、檢測限（IC10）。

1.2.6 測定IgE型抗體濃度 本實驗中，家兔IgE的水平由IgE ELISA試劑盒測定所得，詳細操作依據(jù)說明書步驟進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兔抗異綠原酸C抗血清的效價測定

將兔抗異綠原酸C抗血清按1∶1逐倍稀釋至1∶128，結果仍顯示為陽性，說明外源性的抗體在家兔血清中已經(jīng)產生。將稀釋后的各組兔抗異綠原酸C血清抗體效價值與致敏前血清效價（OD值）進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），從結果分析中得出，異綠原酸C具有致敏性，見表1。

2.2 間接競爭ELISA結果

2.2.1 建立回歸方程I=0.430 lgC+0.319，R2=0.997，半數(shù)抑制濃度IC50=2.628 mg·mL-1，IC10=0.309 mg·mL-1，見圖1。異綠原酸C隨著濃度的增大對抗血清的抑制率逐漸升高，提示抗血清中的抗體是針對該藥物產生的，具有特異性，見表2、圖1。

圖1 異綠原酸C抑制率曲線

表1兔抗異綠原酸C血清效價測定（±s）

表1兔抗異綠原酸C血清效價測定（±s）

*為與致敏前血清效價（OD值）比較。

組別 n 效價（OD值） t值* P值*致敏前血清 異綠原酸C抗血清1∶1稀釋 異綠原酸C抗血清1∶2稀釋 異綠原酸C抗血清1∶4稀釋 5 0.136±0.010兔抗5 0.856±0.030 49.803 ＜0.01兔抗5 0.769±0.020 56.891 ＜0.01兔抗5 0.757±0.020 58.415 ＜0.01兔抗異綠原酸C抗血清1∶8稀釋 5 0.725±0.010 81.680 ＜0.01兔抗異綠原酸C抗血清1∶16稀釋 5 0.639±0.010 61.635 ＜0.01兔抗異綠原酸C抗血清1∶32稀釋 5 0.571±0.020 41.264 ＜0.01兔抗異綠原酸C抗血清1∶64稀釋 5 0.535±0.010 52.265 ＜0.01兔抗異綠原酸C抗血清1∶128稀釋 5 0.524±0.010 54.003 ＜0.01

表2異綠原酸C對抗血清的特異性研究（±s）

表2異綠原酸C對抗血清的特異性研究（±s）

組別 n 效價（OD值） I/%空白對照 5 0.125±0.010 100.00異綠原酸C濃度/（mg·mL-1） 0.00 5 0.402±0.030 0.00 0.25 5 0.386±0.010 5.78 0.50 5 0.349±0.020 18.84 1.00 5 0.313±0.010 32.18 2.00 5 0.273±0.020 46.57 3.00 5 0.261±0.010 52.22 4.00 5 0.245±0.020 56.64?

2.2.2 依據(jù)回歸方程計算樣本對應的IgE型抗體濃度 通過回歸分析，建立曲線方程：Y=1.849X2+13.344X-0.308，R2=0.999，其中X代表效價（OD值），Y代表對應IgE型抗體濃度?？瞻捉M效價（OD值）為0.172，IgE型抗體濃度為2.038 μg·mL-1，異綠原酸C組效價（OD值）為0.398，IgE型抗體濃度為5.295 μg·mL-1，依據(jù)IgE型抗體濃度提高率=（C-C空白）/C空白，C空白代表未經(jīng)過免疫的正常家兔血清檢測出的濃度值，C代表異綠原酸C抗血清中IgE型抗體的濃度，計算得出，提高率達159.81%。

3 討論

中藥有組成成分復雜，致敏成分不確切，致敏機制不同的特性[11-12]。中藥注射劑的有效成分通常為小分子物質而不具有免疫原性，但可能與體內的活性代謝產物蛋白質結合而形成超分子化合物，直接或通過藥物代謝酶分解后與蛋白類載體連接形成載體復合物-超分子半抗原，進而通過抗原處理、提呈及免疫細胞的識別、增殖和反應等一系列機制誘發(fā)免疫應答發(fā)生[13]，本實驗應用該原理在體外制得異綠原酸C抗血清，模擬雙黃連注射劑進入家兔體內所發(fā)生的一系列致敏過程，結果表明，異綠原酸C的抗體效價高于致敏前血清OD值的2倍，說明異綠原酸C有潛在的致敏性。間接競爭ELISA法測定抗體特異性結果表明，異綠原酸C免疫后的家兔抗血清中的抗體具有一定的特異性。IgE型抗體濃度的測定結果表明，經(jīng)過多次免疫后的家兔體內產生了外源性IgE型抗體。綜上所述，在本實驗條件下雙黃連注射劑中疑似半抗原物質異綠原酸C具有致敏性。運用ELISA法具有一定的通用性和可操作性，為日后研究雙黃連注射劑中的致敏成分提供了借鑒方法。