A型肉毒素對肌腱成纖維細胞增殖和TGF-β1、bFGF、MMP-2表達水平的影響

王 楠，許 良，吳國明

(杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 311201)

在常規(guī)手術(shù)修復肌腱損傷的肌腱愈合過程中，受外源性愈合、炎性反應及肌腱細胞自身增殖的影響，常發(fā)生肌腱粘連，影響關節(jié)功能的恢復及患者預后。近年來，針對不同粘連發(fā)生的病理機制，布洛芬、6-磷酸果糖、5-氟尿嘧啶等藥物被先后證明具有不同程度的防治肌腱粘連的作用，但目前臨床應用較為局限，尚未找到肌腱粘連的有效解決辦法。A型肉毒素(botulinum toxin type A, BTXA)是最早應用于美容整形外科的具有神經(jīng)毒理作用的生物制劑，現(xiàn)階段廣泛應用于除皺、瘦臉等美容產(chǎn)業(yè)中，此外有研究表明BTXA能夠通過抑制成纖維細胞增殖、減少膠原合成發(fā)揮抑制瘢痕增生的作用。本研究通過體外誘導培養(yǎng)兔肌腱成纖維細胞，觀察相關細胞因子表達變化，旨在探究BTXA對肌腱粘連的作用及機制，為擴大BTXA治療范圍和臨床防治術(shù)后肌腱粘連提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 注射用A型100單位肉毒素購自蘭州生物制品研究所有限公司(國藥準字S10970037)；I型膠原酶(Worthington, Lakewood, NJ)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen(Rockville, MD, USA)；Actin-tracker Green、DAPI熒光染料購自CST(Danvers, MA, USA)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Aladdin公司；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、牛堿性成纖維細胞生長因子(bovine basic fibroblast growth factor，bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2) 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 兔肌腱成纖維細胞提取及培養(yǎng)

1.2.1 實驗動物 普通級成年雌性新西蘭兔5只，體質(zhì)量(3.5±0.5)kg，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(SYXK(浙)2019-0026)，動物實驗操作嚴格遵守動物倫理保護法等相關規(guī)定，由我院倫理道德委員會監(jiān)督開展。

1.2.2 細胞提取及培養(yǎng) 8 mg/100 g濃度氯胺酮肌肉注射麻醉動物，無菌切取前肢中跖趾深屈肌腱10條，參照文獻報道方法采用組織塊法進行原代培養(yǎng)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，細胞穩(wěn)定傳代3代后用于后續(xù)實驗操作。

1.3 細胞檢測

1.3.1 細胞增殖檢測 將上述穩(wěn)定傳代的細胞分為對照組(Ctrl組)、低劑量組、中劑量組及高劑量組，分別給予0、10、30、50 U/mL BTXA。接種各組細胞1×10個于96孔板中，每組設置6個平行對照孔，常規(guī)培養(yǎng)至細胞貼壁后更換含對應濃度BTXA的DMEM培養(yǎng)基200 μL，對照組給予等量空培。繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h后向孔內(nèi)加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，靜置孵育4 h。棄上清液，加入200 μL DMSO溶解震蕩細胞結(jié)晶產(chǎn)物15 min，酶標儀檢測各組細胞在490 nm處的吸光值(OD 值)。

1.3.2 細胞周期檢測 分組接種細胞于6孔板中，加入對應濃度BTXA的DMEM培養(yǎng)基1 mL，對照組給予等量空培，置于培養(yǎng)箱中誘導干預48 h。消化收集上述處理后的細胞，加入70%乙醇重懸細胞4 ℃固定過夜，離心收集細胞沉淀，參照細胞周期檢測試劑盒染色處理后采用流式細胞儀檢測各組細胞周期分布變化。

1.4 細胞免疫熒光觀察 分組接種細胞于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，每孔100個細胞，待細胞貼壁后給予不同濃度BTXA干預48 h，吸去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定細胞30 min。去固定液，加入0.1% Triton-X室溫處理10 min，5% BSA封閉30 min后加入Actin-tracker Green細胞骨架抗體(工作濃度1∶100)，避光孵育2 h。PBS洗滌培養(yǎng)皿2次，DAPI避光核染5 min后采用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集照片。

1.5 檢測TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白及mRNA表達 各組細胞給藥處理48 h后，ELISA檢測各組細胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表達量，嚴格按照試劑盒說明書操作。收集給藥處理后的各組細胞，qRT-PCR檢測 TGF-β1、bFGF、MMP-2 mRNA相對表達量。引物序列：GAPDH，上游：CAATTGGCTCGAATACAGCA，下游：AGGACATGACGCATGGTCT；TGF-1，上游：CCTTAACAGGATGTGACC，下游：GGCTGCCCAGAGTTCGTAA；bFGF，上游：GCCGCCTCATCGGACGAC，下游：CCTTCTCAAGGTCG ACGGT；MMP-2，上游：TTCTGGGACCTGACCGACC，下游：AGGTCTGCTGAATCCGTCC。

1.6 統(tǒng)計學方法 上述實驗結(jié)果均采用Graph Pad Prism 5進行數(shù)據(jù)處理，經(jīng)正態(tài)分析和方差齊性檢驗后行方差分析，以<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BTXA抑制兔肌腱成纖維細胞體外增殖 經(jīng)BTXA處理的各組細胞培養(yǎng)48 h后，細胞增殖活力均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(=95.573，<0.05)。如圖1所示：BTXA處理24 h后，高劑量組(50 U/mL)細胞體外增殖活力顯著低于其他3組；BTXA處理36 h后，中劑量組(30 U/mL)細胞增殖活力顯著低于對照組和低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)。

注: a與Ctrl 組比較，b與10 U/mL組比較，c與30 U/mL組比較，均P<0.05。圖1 各組細胞生長曲線Figure 1 Cell growth curves of each group

2.2 BTXA調(diào)節(jié)兔肌腱成纖維細胞周期分布 給予0、10、30、50 U/mL BTXA干預誘導后，細胞周期分布阻滯在G0/G1期的細胞比例分別為(38.74±4.21)%、(43.13±6.36)%、(48.37±7.58)%、(61.03±7.63)%，S期停留細胞比例分別為(18.27±3.14)%、(15.23±2.84)%、(11.37±2.51)%、(8.14±1.92)%；高劑量組G0/G1期細胞所占比例較其他三組顯著升高，S期細胞數(shù)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)。中、高劑量組細胞G2/M期細胞含量較對照組和低劑量組降低，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)，而兩組細胞間差異無統(tǒng)計學意義(>0.05)。見圖2。

注: a與Ctrl 組比較，b與10 U/mL組比較，c與30 U/mL組比較，均P<0.05。圖2 不同濃度BTXA對細胞周期進程的影響Figure 2 Effects of different concentrations of BTXA on cell cycle progression

2.3 BTXA影響細胞骨架形態(tài)及黏附變化 如圖3所示：DAPI核染色呈藍色熒光，Actin-tracker Green結(jié)合細胞骨架蛋白呈亮綠色熒光，與對照組相比，BTXA處理后各組細胞形態(tài)均發(fā)生明顯變化，Actin-tracker Green陽性蛋白分布隨BTXA干預濃度增加而減少。對照組細胞黏附較密集，細胞骨架呈一致性排列鋪開；低、中、高劑量組細胞隨BTXA劑量增加細胞黏附面積逐漸減小并出現(xiàn)皺縮，綠色熒光形態(tài)變化、染色面積較對照組逐漸減弱。

圖3 不同濃度BTXA對細胞骨架形態(tài)影響(×1 000)Figure 3 Effects of different concentrations of BTXA on cytoskeleton morphology (×1 000)

2.4 細胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表達變化 與對照組相比，中、高劑量組細胞TGF-β1、bFGF蛋白表達水平顯著降低，且高劑量組細胞TGF-β1表達水平顯著低于其他3組，差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)；隨BTXA干預濃度增加各組細胞MMP-2表達水平逐漸升高，中、高劑量組細胞MMP-2含量高于對照組和低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)。見表1。

表1 不同濃度BTXA對細胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表達影響(n=6)

2.5 TGF-β1、bFGF、MMP-2 mRNA表達變化 如圖4所示：與對照組相比，中、高劑量組細胞TGF-β1、bFGF mRNA相對表達量顯著降低，且高劑量組細胞TGF-β1 mRNA表達水平顯著低于其他3組；各組細胞MMP-2 mRNA表達水平隨BTXA濃度增加而升高，高劑量組顯著高于其他3組；差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)。

注: a與Ctrl 組比較，b與10 U/mL組比較，c與30 U/mL組比較，均P<0.05。圖4 不同濃度BTXA對細胞內(nèi)相關基因表達的影響Figure 4 Effects of different concentrations of BTXA on intracellular expression of related genes

3 討論

目前研究認為肌腱粘連與肌腱愈合有著重要的聯(lián)系，肌腱成纖維細胞既是外源性肌腱愈合的重要組成部分，也是一類重要的炎癥細胞。術(shù)后損傷處炎性反應導致的局部組織液滲出會進一步加重肌腱粘連，因此抑制腱鞘中成纖維細胞的增殖是目前防治傷后肌腱粘連的重要研究方向。根據(jù)抗原性的不同，肉毒素中BTXA亞型近年來在降低手術(shù)后局部張力、抑制傷口瘢痕增生中得到廣泛應用，提示BTXA可以在肌腱成纖維細胞中發(fā)揮類似作用。

本研究中，細胞免疫熒光結(jié)果顯示BTXA作用于兔肌腱成纖維細胞后其細胞骨架牽張力顯著減少，細胞粘連和爬片減弱，說明BTXA對肌腱成纖維細胞粘連和細胞張力具有明顯抑制作用。MTT和細胞周期兩組實驗結(jié)果表明，中、高劑量BTXA能夠顯著抑制兔肌腱成纖維細胞體外增殖活性和細胞周期進程，提示BTXA能夠顯著抑制細胞周期進程從而抑制肌腱成纖維細胞活性。TGF-β1在成纖維細胞相關的肌腱重塑和細胞因子分泌過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、促進細胞間質(zhì)分化的多重作用，本研究中給予高濃度TBXA刺激肌腱成纖維細胞可顯著抑制細胞內(nèi)TGF-β1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平。提示BTXA能夠通過下調(diào)肌腱成纖維細胞中TGF-β1表達抑制細胞周期進程。

進一步檢測細胞內(nèi)MMP-2表達水平變化，結(jié)果顯示BTXA能夠提高細胞內(nèi)MMP-2 mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平。結(jié)果提示BTXA對TGF-β1表達的抑制能夠削弱TGF-β1介導的MMP-2表達降低，MMP-2加速降解膠原沉積調(diào)控成纖維細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，為肌腱損傷修復、避免細胞粘連和促進組織重塑提供了有力保障。近年來bFGF在肌腱損傷修復中的作用受到廣泛關注，外源給予游離的bFGF能夠促進膠原蛋白的分泌、加速膠原纖維重構(gòu)從而改善肌腱結(jié)構(gòu)，但持續(xù)的bFGF刺激反之會加重肌腱粘連，因此有效地控制bFGF的表達及分泌對肌腱愈合和避免細胞粘連具有重要意義。本研究結(jié)果表明中、高劑量BTXA能夠有效抑制細胞內(nèi)bFGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平，BTXA可以通過干預bFGF表達抑制成纖維細胞過度增殖及膠原蛋白的過度沉積發(fā)揮維持細胞外基質(zhì)穩(wěn)定、促進肌腱重塑的作用。

綜上所述，BTXA可能通過抑制肌腱成纖維細胞增殖有效防治肌腱粘連，且作用效果具有一定的劑量依賴性，其作用機制可能與抑制TGF-β1和bFGF表達、促進MMP-2分泌、抑制細胞增殖活性等相關。本研究雖未直接探討B(tài)TXA與肌腱成纖維細胞膠原表達的相關性，但推測BTXA可分別通過介導TGF-β1和bFGF表達下調(diào)抑制膠原分泌及沉積，為后期進一步開展體內(nèi)實驗研究奠定了理論基礎。同時，體內(nèi)bFGF以結(jié)合形式主要存在于細胞基膜上，這種內(nèi)源性bFGF的表達調(diào)控是否同樣受到BTXA的影響也值得更加深入地探討。