蓮子抗性淀粉體外消化的結(jié)構(gòu)變化對(duì)短雙歧桿菌增殖的影響

黃雅萍，劉 霞，楊書捷，盧 旭，繆 松，鄧凱波*，鄭寶東

（1 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002 2 中愛(ài)國(guó)際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究中心 福州 350002 3 福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350002 4 愛(ài)爾蘭農(nóng)業(yè)與食品發(fā)展局 Teagasc 食品研究中心 愛(ài)爾蘭科克 999014）

抗性淀粉 （Resistant starch，RS） 作為益生元，被譽(yù)為影響人體健康的“第七大營(yíng)養(yǎng)因素”，具有可被以雙歧桿菌為主的結(jié)腸細(xì)菌選擇性利用而降解為短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物的特性[1]。在Englyst 對(duì)淀粉的經(jīng)典分類中，抗性淀粉被定義為“在37 ℃消化酶體系培養(yǎng)120 min 時(shí)仍存在非水解殘基的淀粉部分”[2]，這也是目前大多數(shù)III 型抗性淀粉（RS3）制備時(shí)酶解純化步驟普遍參考的方法[3-4]。然而，在多營(yíng)養(yǎng)素及不同加工方式的食物體系中，淀粉的來(lái)源和分布，人體的咀嚼和胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，以及體內(nèi)消化酶分泌情況等均存在個(gè)體差異，表明這種受時(shí)間限定的“抗性”存在相對(duì)性[5]。研究表明，在用人工胃液和腸液消化處理后，馬鈴薯抗性淀粉的結(jié)構(gòu)越來(lái)越疏松，大塊晶體多轉(zhuǎn)變?yōu)樾☆w粒并進(jìn)一步裂化成具有較大比表面積和堆積密度的結(jié)構(gòu)[4]。該過(guò)程發(fā)生在抗性淀粉經(jīng)120 min 初次酶解制備后的二次消化階段，說(shuō)明在動(dòng)物消化道中，初次酶解后的抗性淀粉仍可能因胃腸液作用而導(dǎo)致部分晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對(duì)其消化后構(gòu)效關(guān)系的研究將更有助于抗性淀粉的開(kāi)發(fā)和利用。

抗性淀粉是腸道細(xì)菌的碳源物質(zhì)，其晶體結(jié)構(gòu)與促進(jìn)細(xì)菌增殖的能力相關(guān)。其中，RS3 比RS2更有利于細(xì)菌的發(fā)酵[6]，對(duì)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和乳鏈球菌4 種益生菌最適添加量和最大促增殖水平的影響顯著不同[7]。與A 型相比，B 型RS3 還可將近段結(jié)腸中雙歧桿菌的數(shù)量維持在更高的水平，并生成更多的丁酸鹽產(chǎn)物[8]。在細(xì)菌對(duì)植物多糖的降解過(guò)程中，菌體與作用底物之間的接觸性黏附被認(rèn)為是首要條件[9]。淀粉結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)菌增殖水平產(chǎn)生影響的原因，很可能與二者之間的黏附能力相關(guān)。RS3 表面的粗糙溝壑狀表面和空腔凹陷可能具有黏附雙歧桿菌的作用[10]。這種黏附作用不僅可以提高菌體的膽鹽耐受性，而且還通過(guò)碳源利用實(shí)現(xiàn)促進(jìn)菌株增殖的目的[3]。

蓮子淀粉（Lotus seed starch）中直鏈淀粉含量高達(dá)40%左右，是制備RS3 的良好原料[11]。與其它植物來(lái)源抗性淀粉的形成機(jī)制和結(jié)構(gòu)特性類似，蓮子淀粉糊化后，其直鏈淀粉聚合物發(fā)生回生反應(yīng)，形成蓮子抗性淀粉（LRS3），具有由氫鍵連接的穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)、B 型晶體特征和很高的熱穩(wěn)定性[3]。壓熱、微波和超聲波壓熱等不同制備方法導(dǎo)致LRS3 產(chǎn)生結(jié)構(gòu)差異[12]。該階段LRS3 還具有比其它碳源（高直鏈玉米淀粉、葡萄糖等）更好的促雙歧桿菌增殖效果，推測(cè)這可能與其結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。消化后LRS3 的結(jié)構(gòu)變化以及對(duì)雙歧桿菌增殖和黏附的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)物性結(jié)構(gòu)測(cè)定技術(shù)比較微波法和水浴法制備的兩種LRS3 在體外模擬消化過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，闡明各消化階段LRS3 對(duì)短雙歧桿菌的促增殖能力和黏附能力，探討由體外消化環(huán)境介導(dǎo)的LRS3 結(jié)構(gòu)變化對(duì)短雙歧桿菌增殖的影響，以了解抗性淀粉在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮蓮，由綠田（福建）食品有限公司提供，產(chǎn)自福建建寧。

短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve，B.breve），德國(guó)DSMZ 微生物菌種保藏中心。

葡萄糖（GLU）基礎(chǔ)培養(yǎng)基、高直鏈玉米淀粉（HAMS） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、耐熱α-淀粉酶，美國(guó)ANKOM 科技公司；糖化酶、胃蛋白酶、胰酶，美國(guó)Sigma 公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 蓮子抗性淀粉的制備和純化

1） 微波法制備蓮子抗性淀粉 （Microwavepower LRS3，MP-LRS3） 將150 g 鮮蓮破碎后分散于1 L 蒸餾水中，將淀粉懸浮液在微波功率640 W 下加熱3 min，冷卻至室溫后，4 ℃下保存24 h。隨后，將糊化淀粉置于50 ℃烘箱中干燥6 h，80 μm 篩網(wǎng)過(guò)篩，根據(jù)Zhang 等[3]的方法純化。

2） 水浴法制備蓮子抗性淀粉 （Water-bath LRS3，WB-LRS3） 將300 g 鮮蓮破碎后分散于1 L 蒸餾水中，將淀粉懸浮液在80 ℃水浴鍋中隔水放置20 min。冷卻、干燥和純化步驟同MPLRS3 制備方法。

1.3 體外消化過(guò)程

1） 唾液消化 將0.16 g NaCl，0.02 g KCl 和0.02 g α-淀粉酶加至100 mL PBS 緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0）中制成模擬唾液。將未經(jīng)消化的兩種LRS3（MP-LRS3-0 與WB-LRS3-0）分別與唾液以質(zhì)量比1 ∶1 混合后，37 ℃搖床振蕩5 min（100 r/min），離心處理（4 000×g，10 min），熱風(fēng)干燥2 h 后取LRS3 樣記為MP-LRS3-1 與WBLRS3-1，剩余混合液繼續(xù)胃液消化試驗(yàn)。

2） 胃液消化[13-15]將0.32%胃蛋白酶和0.2% NaCl 溶解于10 mmol/L PBS 緩沖液（pH 2.5）中制成模擬胃液。將唾液完成樣與胃液以質(zhì)量比1∶1 混合后，37 ℃搖床振蕩4 h （100 r/min），離心（4 000×g，10 min），熱風(fēng)干燥2 h 后取LRS3樣記為MP-LRS3-2 與WB-LRS3-2，剩余混合液用于小腸液消化試驗(yàn)。

3） 小腸液消化[13-15]將1 g 豬胰α-淀粉酶（24 U/mg） 溶于100 mL 醋酸鈉-鹽酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.2） 中制成胰酶液。將2 g 糖化酶（105U/g） 溶于相同緩沖液后移入25 mL 容量瓶中搖勻、定容，紗布過(guò)濾后濾液為糖化酶液。將0.4 g 膽鹽溶于10 mL 醋酸鈉-鹽酸緩沖液 （0.1 mol/L，pH 5.2）中制成膽鹽溶液。然后，將胰酶液、糖化酶液和膽鹽溶液以質(zhì)量比16 ∶2 ∶1 的比例混合制成模擬小腸液。取8 mL 小腸液轉(zhuǎn)入同體積含LRS3的胃液完成樣中，混合物于37 ℃搖床振蕩16 h（100 r/min）后離心處理（4 000×g，10 min），熱風(fēng)干燥2 h 后取LRS3 樣記為MP-LRS3-3 與WBLRS3-3。

1.4 各消化階段LRS3 結(jié)構(gòu)測(cè)定

以上各消化階段LRS3 的環(huán)境掃描電鏡（Environmental scanning electron microscope，ESEM）觀察、固態(tài)13C-NMR 核磁共振掃描和X-射線衍射測(cè)定參照Z(yǔ)hang 等[3]的方法。

1.5 各消化階段LRS3 源培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵短雙歧桿菌

分別配制碳源質(zhì)量濃度為20 g/L 的GLU 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、HAMS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各消化階段LRS3試驗(yàn)培養(yǎng)基，均為以TPY 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其中碳源分別以GLU、HAMS 和LRS3 替代。將短雙歧桿菌以體積分?jǐn)?shù)2%接種后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)36 h，在培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)取樣，測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm 處的吸光值。

1.6 各消化階段LRS3 與短雙歧桿菌的黏附能力測(cè)定

將對(duì)數(shù)期短雙歧桿菌菌體用10 mL 0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，重懸于相同緩沖液中至細(xì)胞終濃度為107CFU/mL。取其中2 mL 細(xì)胞重懸液與LRS3 重懸液（10 g/L，所用PBS 緩沖液條件同上）在直徑1 cm 試管中同體積混勻，室溫靜置1 h，至淀粉沉淀后，在液面下0.5 cm 處吸取兩份150 μL 樣液，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)540 nm 處的吸光值，以PBS 為空白對(duì)照。為計(jì)算黏附于淀粉上而后共沉淀于試管底部的細(xì)胞比例，將上述吸光值結(jié)果與以下兩個(gè)對(duì)照試管中的樣品OD540nm值作比較：1）不添加淀粉的細(xì)菌重懸液；2）不添加細(xì)菌的淀粉重懸液。黏附于抗性淀粉上細(xì)菌比例的計(jì)算公式[16]：

式中：a——既有抗性淀粉又有細(xì)菌的吸光值；b——有抗性淀粉而無(wú)細(xì)菌的吸光值；c——無(wú)抗性淀粉而有細(xì)菌的吸光值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品檢測(cè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。采用MDI Jade 6.5 和Peakfit 4.12 進(jìn)行圖譜分析，Origin 8.5 繪制圖像，DPS 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LRS3 在體外消化后的ESEM 觀察結(jié)果

由ESEM 結(jié)果（圖1和圖2）可知，MP-LRS3和WB-LRS3 經(jīng)消化液作用后均發(fā)生明顯的形態(tài)變化。消化前，MP-LRS3-0 顆粒呈薄片堆積的片層結(jié)構(gòu)，表面較粗糙（圖1a）。這是因?yàn)槭芪⒉ㄝ椪蘸蟮牡矸鄯肿釉诶鋮s過(guò)程中，直鏈淀粉分子相互靠近形成新的雙螺旋并沉降，而且純化作用加速了無(wú)定形部分的酶解，剩下高度結(jié)晶的直鏈淀粉[17]。WB-LRS3-0 片層特性雖不明顯，但也呈較大粒徑的晶體形態(tài)（圖2a）。

隨著消化的進(jìn)行，各階段MP-LRS3 和WBLRS3 顆粒的尺寸均呈明顯漸小趨勢(shì)，晶體層崩裂解體，棱角逐漸圓潤(rùn)；在模擬胃液和小腸液作用階段均可看出，晶體表面出現(xiàn)凹坑，且蜂窩狀孔洞的數(shù)量逐漸增加（圖1c 和d，圖2c 和d），這些可能是由于消化酶或酸性消化液導(dǎo)致抗性淀粉結(jié)構(gòu)解聚。此外，從圖1和圖2中還可看出，MP-LRS3 與相同消化階段的WB-LRS3 相比，顆粒粒徑普遍偏小，且晶體表面片層更多，說(shuō)明MP-LRS3 在消化環(huán)境中更易發(fā)生結(jié)構(gòu)性解聚[18]。

圖1 各消化階段MP-LRS3 環(huán)境掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 ESEM micrographs of MP-LRS3 at each digestive stage

圖2 各消化階段WB-LRS3 環(huán)境掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 ESEM micrographs of WB-LRS3 at each digestive stage

2.2 LRS3 在體外消化后的X-射線衍射結(jié)果

抗性淀粉的結(jié)構(gòu)包括結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)，其中結(jié)晶區(qū)又可分為微晶區(qū)和亞微晶區(qū)[19]。結(jié)晶區(qū)主要由直鏈淀粉雙螺旋疊加而成，無(wú)定形區(qū)主要由無(wú)序淀粉組成[20]。由于淀粉的結(jié)構(gòu)解聚通常始于無(wú)定形區(qū)而非亞微晶區(qū)[21]，因此LRS3 的形態(tài)變化主要為消化液對(duì)其無(wú)定形區(qū)的作用。由圖3可以看出，MP-LRS3-0 和WB-LRS3-0 表現(xiàn)出相似的圖譜趨勢(shì)，表明微波法和水浴法LRS3 具有相似的晶體結(jié)構(gòu)，且分別在2θ 為17°，22°，19.77°和25.60°時(shí)出現(xiàn)饅頭峰，均為B-型晶體[22]。經(jīng)消化后，MP-LRS3-1 和WB-LRS3-1 仍為B-型結(jié)晶；而MP-LRS3-2、MP-LRS3-3 和WB-LRS3-2 和WB-LRS3-3 分別在2θ 為11.62°，22°，23.26°，29°，31°和35°時(shí)出現(xiàn)尖銳的衍射峰，這可能是消化液中的有機(jī)物、鹽等物質(zhì)，也有可能為消化過(guò)程中游離的直鏈淀粉單螺旋在體系中發(fā)生分子間雙螺旋重排，以結(jié)晶形式對(duì)消化具有高抗性，從而成為RS 一部分[23-24]。

圖3 各消化階段MP-LRS3（a）和WB-LRS3（b）的X-射線衍射圖譜Fig.3 X-ray diffractogram characteristics of MP-LRS3 （a） and WB-LRS3 （b） at each digestive stage

隨著消化的進(jìn)行，MP-LRS3 和WB-LRS3 呈結(jié)晶度整體上升、無(wú)定形度整體下降趨勢(shì)（表1和表2），其中MP-LRS3 微晶度普遍高于WBLRS3，說(shuō)明MP-LRS3 的結(jié)構(gòu)比WB-LRS3 更穩(wěn)定[18]?？剐缘矸鄣目姑附饽芰χ饕獊?lái)自支鏈淀粉晶體，消化酶水解MP-LRS3 的無(wú)定形區(qū)，使其直鏈淀粉溶出，體系中的直鏈淀粉含量增加[25]。胃腸液消化后MP-LRS3 微晶度與亞結(jié)晶度有較大提高，說(shuō)明經(jīng)胃液強(qiáng)酸環(huán)境的侵蝕與分散，腸液的作用被進(jìn)一步增強(qiáng)，淀粉中無(wú)定形區(qū)的結(jié)構(gòu)被完全破壞，體系中支鏈淀粉含量增大，從而增加了淀粉的結(jié)晶度。此外游離的直鏈淀粉單螺旋重排并聚集為更穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)[18]。然而，WB-LRS3-3 的無(wú)定形度高于WB-LRS3-2，小腸階段的亞結(jié)晶度不升反降，說(shuō)明小腸液作用阻礙了WB-LRS3 完全結(jié)晶的生長(zhǎng)[18]，這可能與二者制備方式不同導(dǎo)致的空間結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

表1 各消化階段MP-LRS3 結(jié)晶特性Table 1 Crystallinity characteristics of MP-LRS3 at each digestive stage

表2 各消化階段WB-LRS3 結(jié)晶特性Table 2 Crystallinity characteristics of WB-LRS3 at each digestive stage

2.3 LRS3 在體外消化后的核磁共振檢測(cè)結(jié)果

由X-射線衍射結(jié)果可知，MP-LRS3-0 與WB-LRS3-0 具有相似的波譜特征，然而，經(jīng)消化處理后二者的結(jié)晶度和無(wú)定形度卻呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。本研究通過(guò)核磁共振掃描技術(shù)研究此過(guò)程中MP-LRS3 和WB-LRS3 的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化（圖4）。淀粉晶體結(jié)構(gòu)的改變主要是由CH 和CH2基團(tuán)分子間移動(dòng)，以及直鏈和支鏈淀粉不同的葡萄糖殘基分布引起的[26-27]。碳化學(xué)位移在106～96 處晶體峰與葡萄糖單元C1 有關(guān)，位移的多樣性反映淀粉結(jié)晶度和雙螺旋對(duì)稱性，B-型晶體在101 和100 處有兩個(gè)C1 共振峰；72～76 范圍的峰與C2、C3、C5 的無(wú)序結(jié)構(gòu)有關(guān)，主要表示直鏈淀粉殘基形成的B-型雙螺旋結(jié)構(gòu)；79～85 范圍的峰與C4有關(guān)，若82 處出現(xiàn)寬共振，表明無(wú)定形區(qū)增加；59～62 范圍的峰與C6 有關(guān)[26，28]。

圖4 各消化階段MP-LRS3（a）和WB-LRS3（b）的CP/MPS 核磁共振掃描波譜Fig.4 CP/MPS NMR spectra of MP-LRS3 （a） and WB-LRS3 （b） at each digestive stage

由表3和表4可知，MP-LRS3 和WB-LRS3的C1 位均顯示多重共振峰 （除MP-LRS3-3 和WB-LRS3-3），為典型的B-型晶體特征；且兩者的相對(duì)結(jié)晶度隨消化過(guò)程的進(jìn)行而增大，變化趨勢(shì)分別呈先降后升和先降后升再降，這與X-射線衍射結(jié)果一致。而MP-LRS3-3 和WB-LRS3-3 在C1 位僅出單峰（100.03），說(shuō)明形成更穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)[18，29]，這與X-衍射結(jié)果一致。

表3 各消化階段MP-LRS3 的化學(xué)位移和相對(duì)結(jié)晶度Table 3 Chemical shifts and relative crystallinity of MP-LRS3 at each digestive stage

表4 各消化階段WB-LRS3 的化學(xué)位移和相對(duì)結(jié)晶度Table 4 Chemical shifts and relative crystallinity of WB-LRS3 at each digestive stage

淀粉結(jié)構(gòu)中的雙螺旋結(jié)構(gòu)含量與無(wú)定形區(qū)密切相關(guān)，無(wú)定形區(qū)含量越低，雙螺旋結(jié)構(gòu)含量越高；而PPA 為C4 位峰值擬合面積與波譜總面積的比值[30]。在模擬消化液作用下，MP-LRS3 的PPA值逐漸降低，說(shuō)明其雙螺旋結(jié)構(gòu)占比增大，解聚作用主要作用于無(wú)定形區(qū)；而WB-LRS3 未表現(xiàn)出如MP-LRS3 一致的PPA 變化趨勢(shì)，呈先緩慢升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明二者在消化液中解聚區(qū)域的暴露情況不同。WB-LRS3 的PPA 在各階段均高于MP-LRS3，說(shuō)明其雙螺旋結(jié)構(gòu)占比低于MPLRS3，這與ESEM 和X-射線衍射結(jié)果一致，推測(cè)這可能與二者制備方式不同導(dǎo)致的晶體三維結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

2.4 MP-LRS3 和WB-LRS3 對(duì)短雙歧桿菌的增殖作用

為證實(shí)消化后LRS3 的結(jié)構(gòu)特性對(duì)短雙歧桿菌增殖的影響，以各消化階段MP-LRS3 和WBLRS3 為培養(yǎng)基碳源，研究其促短雙歧桿菌增殖作用。

如圖5所示，4 組不同碳源培養(yǎng)的菌株均在8 h 左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，24 h 左右進(jìn)入穩(wěn)定期；MPLRS3-0 和WB-LRS3-0 試驗(yàn)組菌株最大增殖速率和最大生長(zhǎng)量均顯著高于GLU 和HAMS 對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明兩種LRS3 均具有比另兩種碳源更好的促短雙歧桿菌增殖效果，這與Zhang 等[3]結(jié)論一致。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期間，LRS3 表現(xiàn)出與GLU 和HAMS 完全不同的促增殖現(xiàn)象。在菌株生長(zhǎng)的8～16 h，LRS3 組菌株的增殖速率明顯高于對(duì)照組，這表明LRS3 可被短雙歧桿菌更快速、有效的利用；而在16～24 h 則相反，增殖速率更趨于平緩，這可能是由于可被利用的LRS3 營(yíng)養(yǎng)水平逐漸降低，成為菌體增殖速率的關(guān)鍵限制因子所致。此外，在底物濃度一致的前提下，MP-LRS3-0 組菌株的最大增殖速率和最大生長(zhǎng)量也顯著高于WB-LRS3-0 組（P<0.05），說(shuō)明前者更易被短雙歧桿菌快速、徹底地利用，這可能與其制備方式導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。結(jié)合結(jié)構(gòu)特性，發(fā)現(xiàn)MP-LRS3-0 較WB-LRS3-0 結(jié)構(gòu)松散，無(wú)定形程度高，推測(cè)短雙歧桿菌快速增殖的原因是利用了抗性淀粉的無(wú)定形區(qū)。

圖5 MP-LRS3-0 和WB-LRS3-0 對(duì)短雙歧桿菌的促增殖作用比較Fig.5 Comparison of the effects of MP-LRS3-0 and WB-LRS3-0 on the proliferation of B.breve

此外，經(jīng)消化液處理的LRS3，極有可能對(duì)短雙歧桿菌的增殖產(chǎn)生不同的影響。如圖6所示，在0～8 h 時(shí)，短雙歧桿菌在所有培養(yǎng)基中的增殖速率相似，僅GLU 組稍高。所有LRS3 試驗(yàn)組菌株在8 h 時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而GLU 和HAMS 對(duì)照組在8 h 時(shí)仍生長(zhǎng)緩慢，20 h 后才開(kāi)始快速增殖。試驗(yàn)組菌株的最終生長(zhǎng)量也顯著 （P<0.05） 或極顯著（P<0.01）高于對(duì)照組。這表明無(wú)論是否經(jīng)消化液處理，LRS3 均較GLU 和HAMS 更易被短雙歧桿菌利用。

圖6 各消化階段MP-LRS3（a）和WB-LRS3（b）對(duì)短雙歧桿菌的促增殖作用Fig.6 Effects of MP-LRS3 （a） and WB-LRS3 （b） at each digestive stage on the proliferation of B.breve

此外，與消化前相比，消化后各MP-LRS3 和WB-LRS3 組菌株的最大增殖速率和最大生長(zhǎng)量均呈顯著升高趨勢(shì)（P<0.05），且隨著口腔、胃和小腸消化過(guò)程的進(jìn)行，各組最大生長(zhǎng)量也升高，即MP-LRS3-3 ＞MP-LRS3-2 ＞MP-LRS3-1 ＞MPLRS3-0，WB-LRS3-3＞W(wǎng)B-LRS3-2＞W(wǎng)B-LRS3-1＞W(wǎng)B-LRS3-0。經(jīng)體外消化的LRS3 更有利于短雙歧桿菌的增殖，且由消化液導(dǎo)致的LRS3 結(jié)構(gòu)性解聚程度影響其促菌株增殖效果，即消化后的抗性淀粉具有更好的益生作用，意味著抗性淀粉結(jié)晶度的提高對(duì)促菌株增殖有利，這與文獻(xiàn)[31-32]報(bào)道一致。

2.5 短雙歧桿菌與MP-LRS3 和WB-LRS3 的黏附作用

研究表明，高直鏈玉米抗性淀粉可提高小鼠腸道雙歧桿菌在低pH 值、膽鹽環(huán)境和腸道通路中的生存能力[1]，菌體對(duì)淀粉的黏附作用可能是提高細(xì)菌活力的可能機(jī)制之一[33-34]；Crittenden 等[16]指出，黏附極有可能對(duì)菌株與淀粉的營(yíng)養(yǎng)互作具有重要作用。本研究采用經(jīng)體外消化處理的各階段MP-LRS3 和WB-LRS3 與短雙歧桿菌進(jìn)行黏附試驗(yàn)，以黏附率為指標(biāo)，結(jié)果如表5所示。

表5 短雙歧桿菌對(duì)各消化階段MP-LRS3 和WB-LRS3 的黏附能力Table 5 Adhesion capacity of B.breve to MP-LRS3 and WB-LRS3 after each digestive stage

根據(jù)Crittenden 等[16]的研究結(jié)果，與淀粉顆粒黏附的細(xì)菌占比超過(guò)70%被認(rèn)為是高黏附，40%～70%之間為中等黏附，而低于40%為低黏附。由表5可知，消化處理前、后MP-LRS3 組和WB-LRS3組黏附率均高于50%，屬于中等黏附。MP-LRS3對(duì)短雙歧桿菌的黏附率普遍高于WB-LRS3，說(shuō)明微波法較水浴法更有利于LRS3 對(duì)菌株的黏附。其中，短雙歧桿菌與各階段MP-LRS3 的黏附率均在65%以上，總體呈上升趨勢(shì)（P<0.05），且在胃腸消化處理組呈現(xiàn)出超過(guò)70%的高黏附率。短雙歧桿菌與各階段WB-LRS3 的黏附率整體較MPLRS3 組稍低，均在50%以上，同樣總體呈上升趨勢(shì)（P<0.05），僅胃液消化處理組略下降。上述結(jié)果說(shuō)明，口腔和胃腸消化液對(duì)LRS3 的結(jié)構(gòu)性解聚具有促進(jìn)短雙歧桿菌黏附的作用。這可能與大分子淀粉聚合物與細(xì)菌之間的空間位阻有關(guān)[16]。由結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果可知，MP-LRS3 和WB-LRS3 經(jīng)消化液處理后發(fā)生顆粒松散，產(chǎn)生凹坑孔洞，以及無(wú)定形區(qū)解聚等空間結(jié)構(gòu)的變化，均可能使晶體上黏附受體的暴露程度或表面電荷等發(fā)生改變，從而導(dǎo)致黏附效果的差異。MP-LRS3 較WB-LRS3更易解聚成高結(jié)晶度的結(jié)構(gòu)特性，也與該組黏附率較高的結(jié)果一致，驗(yàn)證了由消化介導(dǎo)的LRS3結(jié)構(gòu)解聚利于菌株黏附這一觀點(diǎn)。結(jié)合抗性淀粉體外消化的結(jié)構(gòu)特性，可推測(cè)黏附體系中直鏈淀粉含量的增加，使得菌與淀粉的黏附率增大。

Flint 等[9]認(rèn)為，不溶性顆粒淀粉與細(xì)菌的黏附作用是其降解過(guò)程的首要步驟，也是其有效降解的先決條件。結(jié)合之前結(jié)果，消化進(jìn)程與促增殖作用存在相關(guān)性的原因，可能與LRS3 晶體結(jié)構(gòu)變化使其黏附菌株能力不同有關(guān)，這為抗性淀粉與菌株的營(yíng)養(yǎng)互作提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，即：一方面LRS3表面的溝壑狀結(jié)構(gòu)為雙歧桿菌提供了附著點(diǎn)，是二者黏附的可能機(jī)制之一；另一方面這種聚集態(tài)結(jié)構(gòu)和黏附作用也保護(hù)并促進(jìn)了雙歧桿菌的增殖[3]。這也可能是短雙歧桿菌菌株對(duì)LRS3 底物的利用率高于其它來(lái)源抗性淀粉的原因。

3 結(jié)論

研究體外消化后微波法和水浴法制備蓮子抗性淀粉的晶體特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消化后MP-LRS3和WB-LRS3 顆粒變小，從大塊片層結(jié)構(gòu)變?yōu)楸砻娲植谟邪伎忧依饨菆A潤(rùn)的小顆粒，晶體結(jié)構(gòu)仍為B-型，結(jié)晶區(qū)域和雙螺旋結(jié)構(gòu)占比增大，無(wú)定形區(qū)含量整體降低，推測(cè)隨著消化的進(jìn)行，LRS3發(fā)生結(jié)構(gòu)性解聚，并形成更穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。因制備方式不同，故消化前、后的晶體特性均存在差異，在相同消化階段，MP-LRS3 較WB-LRS3 的解聚程度更高。

各消化階段MP-LRS3 和WB-LRS3 均具有比GLU 和HAMS 更好的促短雙歧桿菌增殖能力，并可與短雙歧桿菌發(fā)生中等以上黏附反應(yīng)。黏附率隨LRS3 消化時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高（P<0.05），且各消化階段的促增殖作用與其黏附能力呈正相關(guān)。這表明由消化液導(dǎo)致的LRS3 結(jié)構(gòu)性解聚影響二者的黏附作用，而其聚集態(tài)結(jié)構(gòu)和黏附作用又促進(jìn)短雙歧桿菌的增殖，推測(cè)這種LRS3 和雙歧桿菌之間的營(yíng)養(yǎng)互作關(guān)系均以抗性淀粉聚集態(tài)結(jié)構(gòu)特性為基礎(chǔ)。此外，MP-LRS3 較WB-LRS3 有更好的黏附能力和促增殖能力，可被短雙歧桿菌更有效利用，這可能與其制備方式導(dǎo)致的空間結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。LRS3 在消化環(huán)境中存在不同程度的晶體結(jié)構(gòu)解聚現(xiàn)象，直接影響其對(duì)短雙歧桿菌的促增殖效果和黏附能力。這一構(gòu)效關(guān)系的建立對(duì)于深入了解抗性淀粉在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過(guò)程提供重要的理論支持，而消化后LRS3 的其它益生作用及內(nèi)在構(gòu)效機(jī)制還有待深入研究。