茶葉中脂質含量檢測及其方法比較

陳韻揚，趙航曄，張承銘，王卓異，崔艷，蔡梅生，張青碧，胡金祥，何普明*，屠幼英

（1.浙江大學農業(yè)與生物技術學院茶學系，杭州 310058；2.福鼎市茶業(yè)發(fā)展領導小組辦公室，福建 寧德 355200；3.福鼎市茶業(yè)管理局，福建 寧德 355200）

茶和咖啡、可可并稱為世界三大無酒精飲料，它不僅色、香、味俱全，還具有一定的保健作用。我國古代即有關于茶的記載，“神農嘗百草，日遇七十二毒，得荼而解之”，說明茶在古代藥用方面具有顯著地位?，F(xiàn)代生物化學和醫(yī)學研究表明，茶葉含有450 種以上的有機化合物，15 種以上的無機礦物營養(yǎng)元素。由此可見，茶對人體既有較高的營養(yǎng)價值，又有不錯的藥理效果，對人體健康起著保健作用[1]。

脂質作為生物體的初級代謝產物，是六大營養(yǎng)素（碳水化合物、脂質、蛋白質、維生素、水和無機鹽）之一。植物中的脂質既存在于細胞膜中，也以液滴形式存在于細胞中，即稱脂滴。脂滴主要存在于含油植物的種子或者果實的果皮中，例如油菜籽、鱷梨等[2]，而干茶幾乎不含脂滴。在衰老期或響應非生物脅迫時，脂質也同樣會在葉片中積累，其積累程度受細胞內質網中的脂質相關蛋白（AtLDAP1）和脂質互作蛋白（AtLDIP）調控[3]。茶葉中的脂質主要包含脂肪、磷脂、甘油酯、硫脂和糖脂[4]。根據(jù)其化學組成，脂質可分為單脂類、復合脂類和衍生脂類。其中，人們通常將脂肪稱為真脂，而把其他脂質統(tǒng)稱為類脂[5]。

茶葉中的脂質是茶葉香氣成分的重要前體物質之一[6]。在茶葉加工過程中，脂質降解生成的脂肪酸含量變化與組成差異往往影響成品茶香氣的種類[7-8]。有研究表明，通過搖青能夠加劇青葉的脂質過氧化作用，促進茶葉中青草味物質的散發(fā)，有利于茶葉香氣的形成[9]。在綠茶加工研究中，有學者共檢測到283種脂質，其中磷脂酸、糖脂含量在加工后顯著降低，推測其可能是通過熱誘導反應和酶促水解促進綠茶香氣的形成[10]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏過程中綠茶受到溫度、光照、氧氣含量的影響，其中脂質化合物發(fā)生水解和自動氧化，釋放出部分不飽和脂肪酸，再經過自動氧化、酸敗進而引起綠茶香氣成分的改變，產生陳味[11]。因此，控制脂質氧化是減少茶葉陳味的關鍵。茶葉中的脂質還具有較高的抗血栓活性。有研究發(fā)現(xiàn)，從氧化的茶葉中提取的極性脂質能夠有效對抗炎癥介質的血小板激活因子，例如腺苷二磷酸、凝血酶等，具有抗血小板凝集的特點[12]?？梢?，茶葉脂質與茶葉香氣形成、茶葉貯藏品質、人體健康等息息相關。

脂質作為茶葉加工、茶葉健康研究的重要成分之一，在干茶中的含量及其測定方法卻沒有明確的研究。目前還沒有專門檢測茶葉中脂質含量的國際標準，國內也鮮有測定干茶中脂質含量方法的報道，同時對茶葉中脂質的化學組成也缺乏相關的研究。故本研究參考食品中的2 種脂肪含量測定方法，通過對六大茶類脂質含量的測定，為茶葉脂質含量檢測和脂質組成分析提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

試驗共收集了20 款茶樣（表1），所有茶樣磨碎以備用，試驗所用白茶樣由福建省大沁茶業(yè)有限公司、福建省隆合茶業(yè)有限公司及福建省天湖茶業(yè)有限公司（綠雪芽品牌）提供，其余茶樣均來自浙江大學茶學系加工與審評教研組。

表1 茶樣信息Table 1 Information of tea samples

1.1.2 試劑

鹽酸（HCl）、乙醇（C2H5OH）、無水乙醚（C4H10O）、石油醚（CnH2n+2），沸程30～60 ℃。

1.1.3 儀器與設備

FW80 高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-S28 電熱恒溫水浴鍋（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；ACS-H1 電子計重秤（浙江省凱豐集團有限公司）；AL104 分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；DGX-9073B-2 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海福瑪實驗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同茶類脂質含量的測定

參考《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016），采取酸（鹽酸）水解法及索氏提取法進行茶樣中脂質含量的測定。酸水解法按如下步驟進行：準確稱取0.300 0 g磨碎茶樣，置于50 mL 試管內，加入4 mL H2O，混勻后再加入5 mL HCl。將試管放入70～80 ℃水浴鍋中，每隔5～10 min用玻璃棒攪拌1次，至試樣消化完全為止，用時40～50 min。抽提。取出試管，加入5 mL 乙醇，攪拌混勻。冷卻后將再次攪拌后的混合物快速移入100 mL具塞量筒，以15 mL無水乙醚分數(shù)次洗滌試管，洗液一并倒入量筒。加塞振搖1 min，小心開塞，放出氣體，再塞好，靜置12 min；小心開塞，并用無水乙醚沖洗塞及量筒口附著的脂肪。靜置15 min，待上部液體清澈，吸出上清液于已恒量的燒杯內，再加5 mL無水乙醚于具塞量筒中并振搖，靜置后，仍將上層乙醚吸出，放入燒杯，稱量。取出燒杯，回收無水乙醚或石油醚，待燒杯內溶劑剩余1～2 mL 時在水浴鍋內蒸干，再于（100±5）℃條件下干燥1 h，隨后放于干燥器內冷卻0.5 h，稱量。重復以上操作直至恒量（即相鄰2次稱量之差不超過2 mg）。脂質含量按公式（1）計算。

索氏提取法按如下步驟進行：稱取磨碎后的干燥茶樣4.000 0 g，放入濾紙筒。將索氏提取器的接收瓶于105 ℃下烘干2 h至恒量，稱量。將濾紙筒放入抽提筒中，燒瓶內加沸石防爆沸，連接裝置，在冷凝管上端加入石油醚至抽提筒2/3 處。把接收瓶移至65～70 ℃水浴鍋中加熱，使石油醚保持6～8 次/h 不斷回流抽提，抽提時間約8 h。用磨砂玻璃棒接取一滴提取液，待蒸發(fā)后若玻璃棒上無油斑即表明提取完畢。回收石油醚，取下圓底燒瓶，在水浴鍋上蒸干剩余的少量石油醚。將燒瓶放至105 ℃干燥箱中干燥1 h，再置于玻璃干燥皿內冷卻0.5 h，重復上述操作至恒量并稱量。脂質含量按公式（1）計算。

式中：X表示茶樣中脂質含量，%；m2表示恒量后燒杯的質量，g；m1表示燒杯本身的質量，g；m0表示茶樣干物質量，g。

1.2.2 茶葉脂質類型的組成分析

所用試驗材料為表1 中的各種茶樣，脂質提取方法為1.2.1 中所述酸水解法。按以下方法對其脂質的組成成分進行分析。

脂肪檢測（蘇丹Ⅲ染色法）：取適量提取得到的脂質均勻拌于水中，用膠頭滴管向其中加幾滴蘇丹Ⅲ染色液，染色2～3 min，觀察杯內液體顏色，若變?yōu)殚冱S色，說明有脂肪，反之則無。

糖脂檢測（蒽酮法）：取適量提取得到的脂質均勻拌于水中，制得樣品液；取8.0 mL樣品液與20.0 mL 2 mg/mL硫酸蒽酮試劑混勻，沸水浴10 min，取出冷卻至室溫并觀察溶液顏色變化，若有藍綠色物質產生，說明該脂質中含有糖脂，反之則無。

磷脂檢測[13]：取適量提取得到的脂質，用丙酮萃取該樣品（樣品全部溶于丙酮中）。若該樣品萃取后有物質殘留，則說明該樣品中有磷脂的存在，反之則無。

脂蛋白檢測（雙縮脲法）：將適量提取得到的脂質均勻拌于水中，制得樣品液，在樣品液中依次加入雙縮脲試劑A、B（配制方法如下：將1 g氫氧化鈉固體溶于10 mL水中，制得雙縮脲試劑A；將0.1 g硫酸銅固體溶于10 mL水中，制得雙縮脲試劑B）。若溶液中有紫色物質產生，則說明該樣品中含有蛋白質，進而證明該脂質中有脂蛋白的存在，反之則無。

游離脂肪酸檢測：配制乙醚-95%乙醇混合液（體積比1∶1）；臨用前于每40 mL 混合溶劑中加入0.5 mL酚酞指示劑，并用低濃度的氫氧化鈉溶液滴定剛好至中性（呈現(xiàn)微紅色），得到乙醚-95%乙醇指示劑。取適量提取得到的脂質于燒杯中，加入少量乙醚-95%乙醇指示劑，充分振蕩燒杯，使樣品溶解。若乙醚-95%乙醇指示劑在該脂質溶入后褪去微紅色，則說明該脂質中含有游離脂肪酸，反之則無。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016 進行處理與分析，結果以平均值±標準差表示。使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，兩兩比較采用配對樣本t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05和P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 酸水解法測定不同茶類中的脂質含量

2.1.1 不同鹽酸濃度對茶葉脂質提取的影響

以西湖龍井為試驗材料，配置濃度梯度為2、4、6、8、10 mol/L的鹽酸溶液，按1.2.1節(jié)中的方法提取脂質，鹽酸濃度對茶葉中脂質提取率的影響結果如圖1所示。從中可知，隨著鹽酸濃度的升高，脂質含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢。其中，使用6 mol/L鹽酸提取時脂質得率最高，此后降低；故后續(xù)脂質酸解試驗中均采用6 mol/L鹽酸酸解茶樣。

圖1 不同鹽酸濃度對茶葉脂質提取的影響Fig.1 Effects of different HCl concentrations on tea lipids’extraction

2.1.2 不同茶類脂質含量的差異比較

以表1中的六大茶類（其中，白茶為福鼎大沁品牌白牡丹）為試驗材料，按1.2.1 節(jié)中所述的酸水解法測定其脂質含量，探究六大茶類中脂質含量的差異，結果如圖2 所示。各大茶類的脂質含量由高到低排序為綠茶（炒青、烘青、曬青法所制綠茶脂質質量分數(shù)均在5%左右）＞黃茶（莫干黃芽的脂質質量分數(shù)為4.65%）＞紅茶（九曲紅梅為4.11%）＞烏龍茶（東方美人為3.06%）＞白茶（白牡丹為2.61%）＞黑茶（熟普為2.32%）。由此可知，茶葉中脂質含量與加工工藝有一定關系，即不發(fā)酵茶脂質含量高于微發(fā)酵茶、全發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶、后發(fā)酵茶，說明加工過程中有一定量的脂質轉化或損耗。

由于試驗茶樣中所用烏龍茶（東方美人）與白茶（白牡丹）具有多茶毫的品質特征，因此試驗同時測定了鐵觀音以及去毫白牡丹中的脂質含量。圖2顯示，相比于東方美人和未去毫白牡丹，烏龍茶（鐵觀音）和去毫白牡丹的脂質含量有一定程度的上升，提示茶毫可能會影響茶葉中脂質含量的測定。試驗結果顯示，脂質含量高低為綠茶（如黃山毛峰）＞黃茶（莫干黃芽）＞烏龍茶（鐵觀音）＞紅茶（九曲紅梅）＞白茶（去毫白牡丹）＞黑茶（熟普）。該結果大致與茶葉的發(fā)酵程度吻合，僅白茶脂質含量與其發(fā)酵程度不吻合，提示茶葉脂質含量除了與發(fā)酵程度及茶毫有關外，還可能與其他因素有關。從制茶工藝來看，六大茶類中只有白茶沒有揉捻工序，其細胞壁破碎程度最低，使得細胞上的脂質不易被提取，進而導致白茶脂質含量偏低。故可推測：茶葉的發(fā)酵程度可能會影響成品茶的脂質含量，且隨茶葉發(fā)酵程度的提高，其成品茶的脂質含量下降；成品茶有無茶毫及有無揉捻工序均可影響茶葉脂質含量，且有茶毫和無揉捻工序均會使其脂質含量的測定結果偏低。

圖2 不同茶樣脂質含量（酸水解法）Fig.2 Contents of tea lipids in different tea samples with acid hydrolysis method

2.2 索氏提取法測定不同茶類中的脂質含量

以表1中的部分茶樣為試驗材料，按1.2.1節(jié)中所述索氏提取法測定其脂質含量，結果如圖3所示。結果表明：索氏提取法所測得西湖龍井脂質質量分數(shù)相比于酸水解法低，為3.08%；大紅袍的焙火工藝可提高其脂質含量；白毫銀針（福鼎，大沁）在這4款受試茶樣中脂質質量分數(shù)最低，為1.92%。

圖3 不同茶樣脂質含量（索氏提取法）Fig.3 Contents of tea lipids in different tea samples with Soxhlet extraction method

2.3 白茶脂質分析

基于在上述試驗中發(fā)現(xiàn)白茶脂質含量與其發(fā)酵程度并不吻合，且白茶工藝特殊，無揉捻工序，制作過程中細胞破碎程度較小，因此對表1 中多款白茶的脂質含量和類型進行深入研究。

2.3.1 不同種類白茶間脂質含量比較

不同種類白茶間脂質含量如圖4所示。從中可知，不同種類的白茶間脂質含量有所差異，總體表現(xiàn)為壽眉脂質含量較高，而白毫銀針與白牡丹之間脂質含量差異不大，其中福鼎產白茶中壽眉脂質質量分數(shù)達4.06%，明顯高于同地區(qū)的白毫銀針（3.19%）與白牡丹（3.11%）。在白茶中，脂質表現(xiàn)出茶樣原料越老，含量越高的趨勢。

圖4 不同種類白茶脂質含量Fig.4 Contents of tea lipids in white tea samples from different types

2.3.2 不同年份白茶脂質含量比較

使用表1中綠雪芽品牌的不同種類白茶來比較不同年份間脂質含量差異，結果（圖5）顯示：白毫銀針組與貢眉組存在顯著性差異，白毫銀針2018年產脂質質量分數(shù)為3.75%，2013 年產則為3.13%；貢眉2018 年產脂質質量分數(shù)為3.98%，2013 年產則為3.64%。試驗結果表明，隨著儲藏年限的增長，白茶脂質含量有一定的下降。

圖5 不同年份白茶脂質含量比較Fig.5 Comparison of contents of tea lipids in white tea samples from different production years

2.3.3 茶葉脂質成分組成

茶葉脂質成分測定結果如圖6 所示。圖6A 中混合液并未出現(xiàn)顏色變化，表明提取液中沒有糖脂。在圖6B 中，丙酮溶液底部仍有黑色固體，表明檢測出磷脂。由圖6C結果可知發(fā)生了雙縮脲反應，溶液呈現(xiàn)淡紫色，表明檢測出脂蛋白。圖6D～E 為游離脂肪酸檢測結果，在混合液加入乙醚-95%乙醇溶液后之前產生的淡紅色褪去，表明檢測出游離脂肪酸。綜上所述，白茶脂質中含有磷脂（細胞膜組成成分）、脂蛋白及游離脂肪酸，未檢出糖脂成分。

圖6 白茶脂質成分定性檢測結果Fig.6 Qualitative test results of tea lipid compositions in white tea samples

3 討論與結論

本試驗結果表明，不同茶類之間的脂質含量存在一定的差異，除白茶外，整體表現(xiàn)為隨著發(fā)酵程度的提升，成品茶的脂質含量降低，這可能與茶葉加工過程中的揉捻操作有關，揉捻使得茶葉細胞破碎，脂肪氧化酶催化脂質發(fā)生過氧化反應，產生茶葉中的特征香氣，并且這一酶促氧化反應貫穿整個揉捻與發(fā)酵過程[14]。同時，多酚氧化酶參與酶促氧化，這也導致細胞膜的脂質碎片化，在加工過程中更加容易損失或轉化為其他物質，這在鐵觀音與東方美人茶的脂質含量比較中尤為明顯，同樣為半發(fā)酵烏龍茶，東方美人與鐵觀音的原料相近，但前者發(fā)酵程度相比于鐵觀音更重，脂質含量則更低；熟普（含脂質2.50%）與曬青綠毛茶（含脂質4.54%）相比，前者脂質含量明顯較低，而兩者僅相差渥堆熟化這一工藝，因此推測這兩者的差異可能是渥堆過程中微生物的參與導致了部分脂質的降解，普洱茶渥堆發(fā)酵過程有大量黑曲霉的參與[15]，而黑曲霉能夠代謝脂肪，從而對茶葉中的脂質含量產生影響。同一茶類的茶由于加工工藝的不同，其脂質含量也會存在一定的差異，例如西湖龍井與黃山毛峰的脂質含量與曬青綠毛茶相比更高，當然，使得這一差異出現(xiàn)的原因較多，可能是毛茶的品質不同或殺青工藝（炒青、蒸青與曬青）的不同。

試驗還發(fā)現(xiàn)，不同的脂質提取方法得到的結果存在差異，以西湖龍井為例，酸水解法測得其脂質質量分數(shù)為4.94%，而索氏提取法的結果僅為3.08%。有研究人員指出，索氏提取法可導致含有結合脂質的某些樣品結果偏低[16]。同時，由于索氏提取法的特性，即通過物質在相應沸點轉化成氣體進入冷凝管，冷凝后得到單一物質，這一過程通常會持續(xù)一段時間，容易造成一些熱穩(wěn)定性較差的組分丟失[17]，因此，本試驗中索氏提取法所測得的脂質含量相較于酸水解法偏低，茶葉中脂質的真實含量應更接近于本文中所采用的酸水解法測得的數(shù)據(jù)。

以西湖龍井為代表的綠茶的脂質質量分數(shù)為4.94%，未超過5%，同時本試驗中所有茶類的脂質含量測定結果普遍為2%～5%，低于目前《茶葉生物化學》[4]一書中提到的8%；根據(jù)中國營養(yǎng)學會提供的食物成分表，市售茶葉的脂質質量分數(shù)大多為1%～4%[18]，也有研究測得用壓碎、撕裂、揉卷（crush,tear,curl, CTC）工藝制成的紅茶脂質質量分數(shù)為2%～4%[19-20]，本試驗結果與此較為接近。

在本試驗中，壽眉中的脂質含量高于白牡丹以及白毫銀針，這一差異可能與茶葉原料有關，即茶葉原料越老，脂質含量越高。這與印度、中國和柬埔寨的茶葉品質特點相吻合[19,21]。同時，本試驗中對脂質的定性分析結果顯示，茶葉中脂質的組成為磷脂、脂蛋白以及游離脂肪酸，因此推測茶葉中脂質的主要來源為植物細胞的細胞膜與成熟茶葉葉片表面的蠟質成分。這進一步佐證了茶葉脂質含量與茶葉原料的關系。

本試驗還進一步研究了白茶中脂質含量與儲藏年限的關系，結果顯示，隨著儲藏年限的延長，白茶中的脂質含量呈一定的下降趨勢。因此推測脂質含量的變化與老白茶的品質滋味形成也有一定的聯(lián)系。

總之，脂質在茶葉沖泡過程中很難溶出，因此不必擔心在日常飲用過程中其脂質成分對人體健康產生不利影響，但是其干茶中2%～5%的含量足以在加工過程中對茶葉品質的形成產生影響，例如其對香氣成分的影響以及對黑茶渥堆發(fā)酵過程中微生物生長代謝的影響。截至目前，相較于茶葉中的其他成分，對脂質的研究仍然較少，以至茶葉中脂質含量的多少在業(yè)內還有所爭議。由本試驗結果可知，索氏提取法測得的脂質含量比酸水解法測得的結果更低。而脂質含量高低受到鮮葉嫩度和加工工藝的影響，其含量大致隨著發(fā)酵程度的升高、原料年份的延長而降低。同時，測得茶葉脂質物質的組成成分為磷脂、脂蛋白和游離脂肪酸，總體質量分數(shù)在5%以下。本研究初步探明了不同茶類中脂質含量的特點以及組成，可為后續(xù)相關研究提供一定參考。