稻瘟病菌假定核糖體生成因子MoRei1功能研究

湯帥，徐喆，呂務(wù)云，童琪，肖宇，王政逸

（浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

真核生物的蛋白質(zhì)合成過(guò)程發(fā)生在80S核糖體上，而80S核糖體由60S核糖體大亞基和40S核糖體小亞基構(gòu)成[1]。其中在60S 核糖體大亞基合成過(guò)程中，細(xì)胞核內(nèi)完成組裝修飾的Pre-60S 核糖體需在核輸出因子與核孔復(fù)合體的作用下實(shí)現(xiàn)由細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，并在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步成熟[2-3]；而結(jié)合在Pre-60S亞基表面的核輸出因子在完成核輸出后，則需在核糖體生成因子的作用下及時(shí)從核糖體亞基表面解離下來(lái)，重復(fù)利用。目前在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中 已 鑒 定 出Nmd3[4]、Arx1[5]、Alb1[6]、Mex67[7]、Bud20[8]等 多 種 輔 助Pre-60S核糖體亞基跨膜運(yùn)輸?shù)暮溯敵鲆蜃?，以及Rei1、Jjj1[9]、Yvh1[10]等核糖體生成因子。

稻瘟病（rice blast）由真菌界子囊菌門(mén)的稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染所致，每年因稻瘟病導(dǎo)致的水稻產(chǎn)量損失達(dá)到水稻總產(chǎn)量的10%～30%[11]。由于防治稻瘟病對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的重要性以及稻瘟病菌在分子遺傳上的可操作性，稻瘟病菌已成為研究植物病原真菌致病機(jī)制的模式真菌[12]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌核糖體生成因子MoYvh1可通過(guò)影響活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除的胞外蛋白合成與分泌，從而影響稻瘟病菌的致病性[13]。CAO等通過(guò)對(duì)稻瘟病菌C2H2鋅指結(jié)構(gòu)蛋白基因成員進(jìn)行基因敲除發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌MoREI1基因缺失可影響稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、無(wú)性孢子產(chǎn)生和致病性[14]。然而，MoRei1在病菌形態(tài)分化和致病過(guò)程中的其他生物學(xué)功能尚不明確。本研究通過(guò)MoREI1基因敲除、ΔMorei1突變體表型分析、基因互補(bǔ)及MoRei1 互作蛋白鑒定，進(jìn)一步明確稻瘟病菌假定核糖體生成因子MoRei1 的生物學(xué)功能，為解析稻瘟病菌致病分子機(jī)制和研發(fā)新型殺菌劑提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和寄主植物

稻瘟病菌（M. oryzae）野生型菌株Guy11 及有性生殖測(cè)試菌株TH3 由英國(guó)劍橋大學(xué)Talbot 教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。稻瘟病菌MoREI1基因缺失突變體（ΔMorei1-22、ΔMorei1-23）及回補(bǔ)菌株（ΔMorei1-C）由本實(shí)驗(yàn)室獲得。用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌（Escherichia coli）菌株（Trans T1）購(gòu)于杭州創(chuàng)試生物科技有限公司。釀酒酵母野生型菌株BY4741由浙江大學(xué)馬忠華教授惠贈(zèng)，酵母突變體菌株Δrei1由浙江大學(xué)陳云教授惠贈(zèng)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中的酵母菌株AH109購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Clontech公司。

感病水稻品種為CO-39，感病大麥品種為黃金大麥（Golden Promise）。

1.2 供試質(zhì)粒與培養(yǎng)基

用于基因敲除的pKOV21質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，用于基因回補(bǔ)的pCB1532質(zhì)粒由英國(guó)劍橋大學(xué)Talbot 教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，用于酵母異源互補(bǔ)的pYES2載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

溶菌肉湯（lysogeny broth,LB）培養(yǎng)基包括5 g/L NaCl、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、15 g/L 瓊脂粉，用10 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 至7.0[15]；完全培養(yǎng)基（complete medium,CM）配制、稻瘟病菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和突變體篩選均參照先前報(bào)道的方法[16-17]；PTC 緩沖液包括60% PEG 4000、10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、10 mmol/L CaCl2；酵母菌尿嘧啶合成缺陷培養(yǎng)基（synthetic dropout medium-uracil,SD-URA）包括8 g/L URA、20 g/L 葡萄糖、15 g/L 瓊脂粉，用10 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 至5.8[15]；燕麥培養(yǎng)基（oatmeal agar, OMA）為將50 g 燕麥片煮沸15 min，過(guò)濾得到的濾液定容至1 000 mL，然后添加15 g瓊脂粉。

1.3 突變體表型測(cè)定與分析

有性生殖參數(shù)測(cè)定：將稻瘟病菌的野生型菌株Guy11 及突變體菌株ΔMorei1-22分別與對(duì)應(yīng)交配型的測(cè)試菌株TH3 接種于燕麥培養(yǎng)基（OMA）上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，于25 ℃條件下光照14 h/黑暗10 h 培養(yǎng)至菌絲相互接觸時(shí)，轉(zhuǎn)移至19 ℃條件下持續(xù)光照培養(yǎng)30 d，檢測(cè)菌落交界處的子囊殼形成情況。

大麥表皮穿透實(shí)驗(yàn)：收集生長(zhǎng)10 d的各待測(cè)菌株的分生孢子，制備濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液，吸取15 μL孢子懸浮液滴加于生長(zhǎng)7 d的大麥葉片背面，于28 ℃、黑暗條件下保濕培養(yǎng)48 h后，撕取大麥表皮置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)穿透與侵染菌絲擴(kuò)展情況。

附著胞形成率統(tǒng)計(jì)：待統(tǒng)計(jì)的分生孢子懸浮液濃度同上，每次吸取15 μL 懸浮液滴加于疏水玻片表面，于25 ℃、黑暗條件下保濕培養(yǎng)24 h，隨后置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)附著胞形成情況。

致病性測(cè)定：待測(cè)定的分生孢子懸浮液濃度同上，將孢子懸浮液均勻噴霧于生長(zhǎng)2 周的感病水稻品種CO-39 葉片表面，于25 ℃條件下光照14 h/黑暗10 h 交替培養(yǎng)5 d 后，觀察水稻葉片表面的發(fā)病情況。上述每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 細(xì)胞壁完整性脅迫及氧化脅迫實(shí)驗(yàn)

在CM 中分別添加質(zhì)量濃度為200、400 μg/mL剛果紅（congo red,CR）或5、10 mmol/L H2O2。將各測(cè)試菌株接種于脅迫培養(yǎng)基表面，于25 ℃條件下光照14 h/黑暗10 h交替培養(yǎng)10 d后，測(cè)量菌株菌落直徑并統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)抑制率。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，每處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 糖原染色實(shí)驗(yàn)

收集生長(zhǎng)10 d的各待測(cè)菌株的分生孢子，并將分生孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)為5×104個(gè)/mL，吸取15 μL孢子懸浮液滴加于疏水玻片表面，分別于黑暗條件下保濕培養(yǎng)0、2、4、8、12、24、48 h 后用KI/I2（60 mg/mL KI 和10 mg/mL I2）溶液染色，在顯微鏡下觀察糖原分布情況并拍照。

1.6 異源基因互補(bǔ)與酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)

異源基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)：以稻瘟病菌Guy11 菌株cDNA為模板，利用特異性引物擴(kuò)增獲得MoREI1基因的完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）。所用引物MoREI-F1 和MoREI-R1 信息見(jiàn)表1。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增片段并與酵母pYES2載體相連，在PTC介導(dǎo)下將構(gòu)建好的回補(bǔ)載體導(dǎo)入釀酒酵母Δrei1突變體菌株，涂板于SD-URA上進(jìn)行篩選。

酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)：同樣以稻瘟病菌Guy11 菌株cDNA 為模板，利用特異性引物對(duì)MoREI1-F2/MoREI1-R2 和MoALB1-F1/MoALB1-R1（表1）分別擴(kuò)增獲得MoREI1和MoALB1基因完整開(kāi)放閱讀框序列。PCR 擴(kuò)增片段分別與pGBKT7 和pGADT7 載體相連，再將對(duì)應(yīng)質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化至酵母AH109 菌株中，挑選在酵母菌亮氨酸-色氨酸合成缺陷培養(yǎng)基（synthetic dropout medium-leucinetryptophan,SD-Leu-Trp）（二缺培養(yǎng)基）上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子于酵母菌亮氨酸-色氨酸-腺嘌呤-組氨酸合成缺陷培養(yǎng)基（synthetic dropout medium-leucinetryptophan-adenine-histidine, SD-Leu-Trp-Ade-His）（四缺培養(yǎng)基）上再生長(zhǎng)2～3 d，觀察酵母菌落生長(zhǎng)情況。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 MoAlb1亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建的C 端帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的MoALB1-GFP融合載體分別導(dǎo)入野生型Guyl1和ΔMorei1突變體菌株，獲得轉(zhuǎn)化子。待轉(zhuǎn)化子在CM上生長(zhǎng)10 d后分別收集分生孢子，并在孢子懸浮液中添加質(zhì)量濃度為10 μg/mL 4'，6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染料，同時(shí)添加等體積的1%Triton。避光染色30 min 后在激光共聚焦顯微鏡（Zeiss Lsm 780）下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌MoREI1基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，稻瘟病菌MoREI1基因（MGG_02505）序列全長(zhǎng)為2 251 bp，包含2 個(gè)內(nèi)含子，外顯子序列長(zhǎng)度為1 722 bp，編碼包含573個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中分別在30～54、95～119、235～258、286～310氨基酸位點(diǎn)上含有一個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域。氨基酸多序列比對(duì)分析結(jié)果表明，稻瘟病菌MoRei1 蛋白與釀酒酵母（S. cerevisiae）Rei1 蛋白質(zhì)序列一致性為24.53%，與禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）這類(lèi)絲狀真菌的同源蛋白質(zhì)氨基酸序列一致性分別為55.71%、43.73%、38.39%。同時(shí)，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，稻瘟病菌的MoRei1 蛋白質(zhì)與禾谷鐮刀菌、粗糙脈孢菌等同源蛋白質(zhì)的遺傳關(guān)系較近（圖1）。

圖1 不同真菌Rei1同源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Rei1 homologs from different fungal species

2.2 稻瘟病菌MoREI1 基因?qū)湍甫ei1 突變體部分表型的恢復(fù)

為探究稻瘟病菌的MoREI1基因與釀酒酵母（S.cerevisiae）REI1基因（YBR267W）是否在功能上具有同源性，本研究將稻瘟病菌MoREI1基因?qū)脶劸平湍窻EI1基因缺失突變體Δrei1。有研究表明，釀酒酵母Δrei1突變體對(duì)低溫環(huán)境敏感，在低溫環(huán)境下不能正常生長(zhǎng)[18]，因此，可通過(guò)比較各測(cè)試菌株在低溫環(huán)境下的生長(zhǎng)來(lái)判斷稻瘟病菌MoREI1基因是否可恢復(fù)酵母Δrei1突變體的表型。通過(guò)觀測(cè)各參試菌株在酵母正常生長(zhǎng)溫度（37 ℃）及低溫環(huán)境（21 ℃）中的生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入稻瘟病菌MoREI1基因的酵母REI1基因缺失突變體Δrei1在低溫環(huán)境下恢復(fù)了部分生長(zhǎng)缺陷表型（圖2），說(shuō)明稻瘟病菌MoRei1 與酵母Rei1 在功能上具有同源性，并可能具有與Rei1類(lèi)似的核糖體生成因子功能。

圖2 酵母野生型BY4741、突變體Δrei1及回補(bǔ)菌株Δreil/MoREI1在不同溫度下的生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth status of the wild type BY4741, mutant Δrei1 and complementation strains Δreil/MoREI1 of S. cerevisiae at different temperatures

2.3 缺失MoREI1 對(duì)稻瘟病菌有性生殖的影響

通過(guò)同源重組的方法，獲得了稻瘟病菌MoREI1基因敲除突變體（ΔMorei1-22和ΔMorei1-23），并將MoREI1基因重新導(dǎo)入ΔMorei1-22突變體得到回補(bǔ)菌株（ΔMorei1-C）。為探究MoREI1基因缺失是否影響稻瘟病菌的有性生殖，將ΔMorei1-22突變體及野生型菌株（Guy11）分別與不同的交配型測(cè)試菌株（TH3）進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)。結(jié)果表明：Guy11菌株與TH3菌株在菌落交界處形成了大量子囊殼，內(nèi)含子囊和子囊孢子，而相同培養(yǎng)條件下在ΔMorei1-22與TH3菌株的菌落交界處未見(jiàn)有子囊殼的形成（圖3），說(shuō)明MoREI1對(duì)稻瘟病菌的有性生殖是必需的。

圖3 稻瘟病菌野生型Guy11與ΔMorei1-22突變體的有性生殖測(cè)定Fig.3 Sexual reproduction tests of the wild type strain Guy11 and ΔMorei1-22 mutant of M.oryzae

2.4 缺失MoREI1 對(duì)稻瘟病菌致病性及附著胞形成率的影響

采用分生孢子懸浮液噴霧水稻幼苗葉片的方法來(lái)測(cè)定稻瘟病菌MoREI1基因缺失突變體ΔMorei1對(duì)水稻葉片的致病性，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)：野生型菌株Guy11 和回補(bǔ)菌株ΔMorei1-C處理的水稻葉片表面形成典型的稻瘟病病斑，而ΔMorei1突變體處理的水稻葉片形成小點(diǎn)狀、非擴(kuò)展病斑（圖4A）；在疏水玻片表面，野生型菌株Guy11 和回補(bǔ)體菌株ΔMorei1-C的附著胞平均形成率為85%，而ΔMorei1突變體的附著胞形成率僅為6%，且突變體菌株在附著胞形成過(guò)程中產(chǎn)生的芽管較長(zhǎng)，為彎曲狀，附著胞大小相對(duì)于野生型菌株也更小，說(shuō)明MoREI1基因缺失可影響稻瘟病菌的附著胞發(fā)育（圖4B～C）。同時(shí)，大麥表皮穿透實(shí)驗(yàn)表明，接種了野生型和回補(bǔ)體菌株分生孢子的大麥表皮所形成的4 級(jí)（類(lèi)型4）侵染菌絲占總的侵染菌絲比例約為80%，而接種突變體菌株分生孢子形成的4級(jí)侵染菌絲比例僅為22%（圖4D～E），說(shuō)明MoREI1基因缺失使稻瘟病菌侵染菌絲在寄主組織內(nèi)的擴(kuò)展受到抑制。

圖4 MoREI1基因缺失對(duì)稻瘟病菌致病性、附著胞形成及侵染過(guò)程的影響Fig.4 Influence of MoREI1 deletion on pathogenicity,appressorium formation and penetration of M.oryzae

2.5 缺失MoREI1 對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞壁完整性及氧化脅迫因子敏感性的影響

為探究MoREI1基因缺失是否影響稻瘟病菌對(duì)細(xì)胞壁完整性和氧化脅迫因子的敏感性，本研究測(cè)試了ΔMorei1突變體在含細(xì)胞壁和氧化脅迫因子培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示：ΔMorei1突變體在含200、400 μg/mL 剛果紅（CR）的細(xì)胞壁脅迫因子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)抑制率分別為13%、32%，顯著高于野生型菌株（Guy11）的9%和13%的生長(zhǎng)抑制率（圖5A～B）。類(lèi)似地，ΔMorei1突變體在含5、10 mmol/L H2O2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)抑制率分別為29%、53%，同樣顯著高于野生型菌株的9%和38%的生長(zhǎng)抑制率（圖5A～B）。上述結(jié)果表明，MoREI1基因缺失導(dǎo)致稻瘟病菌對(duì)細(xì)胞壁完整性和氧化脅迫因子的敏感性增強(qiáng)。

圖5 稻瘟病菌野生型菌株Guy11 與ΔMorei1-22 突變體在含細(xì)胞壁及氧化脅迫因子條件下的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth status of the wild type strain Guy11 and ΔMorei1-22 of M. oryzae on the stress media that contain the cell wall or oxidative stress factors

2.6 缺失MoREI1 對(duì)稻瘟病菌附著胞發(fā)育過(guò)程中糖原移動(dòng)和降解的影響

為探究MoREI1基因缺失是否影響稻瘟病菌附著胞形成過(guò)程中糖原的移動(dòng)和降解，本研究對(duì)ΔMorei1突變體附著胞形成過(guò)程中的糖原進(jìn)行KI/I2染色（圖6A）。結(jié)果顯示，在疏水玻片上誘導(dǎo)24 h后，野生型菌株（Guy11）中已有82%的分生孢子和95%的附著胞內(nèi)觀察不到糖原，而在突變體菌株（ΔMorei1-22）中仍有76%的分生孢子和82%的附著胞內(nèi)存在糖原（圖6A～C）。上述結(jié)果表明，MoREI1基因缺失導(dǎo)致稻瘟病菌附著胞發(fā)育過(guò)程中糖原的移動(dòng)和降解速率減緩。

圖6 MoREI1基因缺失對(duì)稻瘟病菌附著胞形成過(guò)程中糖原移動(dòng)及降解速率的影響Fig.6 Influence of MoREI1 deletion on mobilization and degradation of glycogens during appressorium formation of M.oryzae

2.7 MoRei1 互作蛋白的鑒定

在釀酒酵母中，核糖體生成因子Rei1蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中并與核輸出因子Alb1 存在直接互作[6]，進(jìn)而促進(jìn)Alb1 從Pre-60S 核糖體亞基表面解離。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在稻瘟病菌基因組中存在酵母Alb1的同源蛋白MoAlb1（MGG_04322）。為探究稻瘟病菌中MoRei1 與MoAlb1 蛋白是否同樣存在互作，進(jìn)行了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在稻瘟病菌中MoRei1 與MoAlb1 蛋白間同樣存在物理互作（圖7）。

圖7 MoRei1互作蛋白的鑒定Fig.7 Identification of the interaction protein of MoRei1

2.8 缺失MoRei1 對(duì)MoAlb1 細(xì)胞核定位的影響

在釀酒酵母中，Alb1 在核糖體生成因子Rei1的協(xié)助下從Pre-60S 核糖體亞基上解離后，需再次被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中參與下一輪Pre-60S 核糖體亞基的核輸出。有研究表明，在酵母野生型菌株中Alb1 主要定位于細(xì)胞核中，而在Δrei1突變體中Alb1 因無(wú)法從核糖體亞基上解離而主要定位于細(xì)胞質(zhì)中[6]。為了探究稻瘟病菌MoREI1基因缺失是否影響MoAlb1 的亞細(xì)胞定位，將C 端帶有GFP 標(biāo)簽的MoAlb1 融合蛋白（MoAlb1-GFP）載體分別導(dǎo)入稻瘟病菌野生型菌株（Guy11）和突變體菌株（ΔMorei1-22）。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果（圖8）表明：在表達(dá)MoAlb1-GFP 的Guy11 菌株，綠色熒光主要集中于細(xì)胞核區(qū)域，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)中也有分布；而在表達(dá)MoAlb1-GFP 的ΔMorei1-22突變體中，綠色熒光則彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明MoREI1基因缺失阻礙了MoAlb1 在稻瘟病菌細(xì)胞核中的定位。

圖8 MoREI1基因缺失對(duì)MoAlb1細(xì)胞核定位的影響Fig.8 Influence of MoREI1 deletion on the nuclear localization of MoAlb1

3 討論

前人的研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌MoREI1基因在病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、無(wú)性孢子產(chǎn)生和致病性調(diào)控中起重要作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌ΔMorei1突變體的有性生殖能力喪失，附著胞形成率顯著下降，ΔMorei1突變體對(duì)細(xì)胞壁完整性和氧化脅迫因子的敏感性增強(qiáng)，附著胞形成過(guò)程中糖原的移動(dòng)和降解速率減慢。酵母回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MoRei1與酵母Rei1 在功能上具有同源性，MoREI1基因缺失同樣影響稻瘟病菌中MoAlb1 蛋白的亞細(xì)胞定位，說(shuō)明MoRei1可能也作為核糖體生成因子參與稻瘟病菌核糖體的形成。本研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了稻瘟病菌假定核糖體生成因子MoRei1在形態(tài)分化和致病性中的生物學(xué)功能，對(duì)認(rèn)識(shí)稻瘟病菌致病分子機(jī)制有重要意義。

在本研究中，當(dāng)ΔMorei1突變體與對(duì)應(yīng)的測(cè)試菌株（TH3）進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，不產(chǎn)生子囊殼和子囊孢子，說(shuō)明MoREI1基因缺失導(dǎo)致稻瘟病菌的有性生殖能力喪失。有研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母的有性生殖起始于性細(xì)胞間的信息素識(shí)別，在信息素激活細(xì)胞表面受體后，再通過(guò)G蛋白通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子Ste12，從而啟動(dòng)交配型基因的表達(dá)[19-21]，促使有性生殖發(fā)生。而稻瘟病菌的MoREI1基因缺失是否影響信息素的分泌，并通過(guò)稻瘟病菌G蛋白信號(hào)通路和Mst12（Ste12同源蛋白）的磷酸化激活，從而調(diào)控有性生殖相關(guān)基因的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌ΔMorei1突變體相對(duì)于野生型菌株Guy11 對(duì)水稻葉片的致病力減弱，病狀上主要表現(xiàn)為病斑小且為非擴(kuò)展性病斑。該突變體致病力下降的原因可能有以下2方面：1）ΔMorei1突變體的附著胞形成率低。ΔMorei1突變體的附著胞形成率僅為6%，顯著低于野生型菌株的85%，而形成正常的附著胞是稻瘟病菌穿透寄主表皮的關(guān)鍵步驟。此外，ΔMorei1突變體附著胞形成過(guò)程中糖原的移動(dòng)和降解速率減緩也可能影響附著胞的形成及功能。已有研究表明，稻瘟病菌附著胞形成過(guò)程中糖原的移動(dòng)和降解主要受環(huán)腺苷酸蛋白激酶A（cyclic AMP-protein kinase A, cAMP-PKA）信號(hào)途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）途徑調(diào)節(jié)[22]，因此，MoREI1基因的缺失可能影響上述2 條信號(hào)通路。2）ΔMorei1突變體的侵染菌絲生長(zhǎng)受到限制。大麥表皮穿透實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ΔMorei1突變體處理的第3、4 類(lèi)侵染菌絲占總的侵染菌絲比例顯著低于野生型菌株的處理。而根據(jù)ΔMorei1突變體在含H2O2培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，推測(cè)突變體侵染菌絲在寄主植物體內(nèi)的生長(zhǎng)受阻，可能是由于MoREI1基因缺失降低了稻瘟病菌對(duì)氧化脅迫環(huán)境的耐受性。LIU 等發(fā)現(xiàn)，在氧化脅迫條件下，稻瘟病菌核糖體生成因子MoYvh1可在熱激蛋白70 家族成員MoSsb1 和MoSsz1 的輔助下由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，并通過(guò)促進(jìn)核糖體的形成從而加快清除ROS的胞外蛋白的合成與分泌，使得侵染菌絲在寄主組織內(nèi)可正常擴(kuò)展[13]。由此推測(cè)，ΔMorei1突變體的核糖體生成也可能受此影響，進(jìn)而導(dǎo)致用于清除ROS的胞外蛋白合成受阻，使得侵染菌絲在寄主細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)展受抑制。另外，本研究也注意到稻瘟病菌ΔMorei1突變體菌落黑色素合成明顯少于野生菌株。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, qRT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)，ΔMorei1突變體的黑色素合成相關(guān)基因（ALB1、RSY1和BUF1）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著下降（數(shù)據(jù)未顯示），而黑色素合成障礙可能影響附著胞黑色素層的形成和膨壓的產(chǎn)生[23]，從而導(dǎo)致ΔMorei1突變體附著胞功能異常和致病力下降，有關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌假定核糖體生成因子MoRei1 與預(yù)測(cè)的核輸出因子MoAlb1 存在物理互作，且MoREI1基因缺失導(dǎo)致MoAlb1蛋白的亞細(xì)胞定位改變，由細(xì)胞核定位轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)定位，這些研究結(jié)果與釀酒酵母中的結(jié)果[6]一致。同時(shí)，通過(guò)異源互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了稻瘟病菌MoRei1與釀酒酵母Rei1 具有類(lèi)似功能，即MoRei1 可能作為核糖體生成因子參與稻瘟病菌的核糖體形成過(guò)程。在釀酒酵母中，Rei1 通過(guò)促進(jìn)核輸出因子Alb1 從Pre-60S核糖體亞基表面解離，從而使得Pre-60S亞基進(jìn)一步成熟并與40S 亞基結(jié)合，以形成完整的80S 核糖體[9]。然而，我們尚沒(méi)有MoRei1 直接參與稻瘟病菌核糖體生成的證據(jù)，今后有必要提取各菌株的核糖體并進(jìn)行蔗糖梯度離心實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)ΔMorei1突變體的核糖體亞基比例來(lái)直接揭示MoREI1基因缺失對(duì)稻瘟病菌核糖體生成的影響。

值得注意的是，本研究中的稻瘟病菌MoALB1基因?qū)儆贏lb家族基因，與目前研究更為深入的參與稻瘟病菌黑色素合成的ALB1基因（MGG_07219）并非相同[23]。為進(jìn)一步探究MoALB1基因在稻瘟病菌形態(tài)分化和致病性中的生物學(xué)功能，我們對(duì)MoALB1基因進(jìn)行了多次敲除，共獲得了1 000多個(gè)轉(zhuǎn)化子，但遺憾的是暫未獲得敲除突變體。今后有必要對(duì)MoALB1基因進(jìn)行繼續(xù)敲除或通過(guò)RNA干擾等方法來(lái)探究MoALB1基因在稻瘟病菌中的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌的MoRei1 與釀酒酵母核糖體生成因子Rei1 具有功能同源性，MoREI1基因缺失導(dǎo)致稻瘟病菌有性生殖能力喪失，附著胞形成率下降，附著胞形成過(guò)程中糖原的移動(dòng)和降解速率減緩，對(duì)氧化脅迫和細(xì)胞壁脅迫因子的敏感性增強(qiáng)，侵染菌絲擴(kuò)展受阻。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)MoRei1蛋白與預(yù)測(cè)的核輸出因子蛋白MoAlb1 間存在物理互作，且MoREI1基因缺失影響MoAlb1 蛋白的細(xì)胞核定位。由此得出，稻瘟病菌假定核糖體生成因子MoRei1 對(duì)稻瘟病菌的有性生殖、脅迫適應(yīng)、致病性及互作蛋白MoAlb1的亞細(xì)胞定位具有重要作用。