鉤枝藤總生物堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系表達(dá)譜及免疫微環(huán)境的影響

李中玉，趙一燃，門 磊，弓曉杰，李珂珂

鉤枝藤總生物堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系表達(dá)譜及免疫微環(huán)境的影響

李中玉1, 2, 3，趙一燃1, 2, 3，門 磊1, 2, 3，弓曉杰1, 2, 3，李珂珂1, 2, 3*

1. 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600 2. 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600 3. 遼寧省民族藥功效成分開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600

研究鉤枝藤總生物堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系表達(dá)譜的影響，篩選出差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）并對(duì)功能基因進(jìn)行分析和挖掘，以期為鉤枝藤抗肺癌的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。將非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞分為對(duì)照組和鉤枝藤總生物堿處理組，使用RNA-Seq技術(shù)開展全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲取DEGs；對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；篩選差異基因核心模塊并分析其影響功能，進(jìn)一步分析關(guān)鍵基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌生存期的影響；通過分析鉤枝藤總生物堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)的情況，確定關(guān)鍵基因表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。對(duì)照組和藥物組共檢測(cè)到2976個(gè)DEGs，其中藥物組664個(gè)DEGs上調(diào)，2312個(gè)DEGs下調(diào)。鉤枝藤總生物堿對(duì)鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體、溶酶體、細(xì)胞間隙連接、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）樣受體等介導(dǎo)的信號(hào)通路產(chǎn)生重要影響。在DEGs核心模塊中，白細(xì)胞介素11（interleukin 11，）的高表達(dá)可顯著影響非小細(xì)胞肺癌患者的生存期，是非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后的關(guān)鍵因素之一；角形四肽重復(fù)干擾素誘導(dǎo)蛋白3（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3，）、白細(xì)胞介素7受體（interleukin 7 receptor，）、2′,5′-寡腺苷酸合成酶2（2′,5′-oligoadenylate synthetase 2，）、-腺苷甲硫氨酸基結(jié)構(gòu)域蛋白2（radical-adenosyl methionine domain containing 2，）、受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（receptor transporter protein 4，）、不育α基序結(jié)構(gòu)域9樣（sterile alpha motif domain containing 9-like gene，）、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1（X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1，）的表達(dá)水平影響了非小細(xì)胞肺癌組織的純度和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的類型，可能改變非小細(xì)胞肺癌的免疫微環(huán)境。鉤枝藤總生物堿能夠影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，具有潛在的抗非小細(xì)胞肺癌活性作用。

鉤枝藤；非小細(xì)胞肺癌；生物堿；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；免疫浸潤(rùn)

癌癥已成為全球范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題，據(jù)預(yù)測(cè)，未來20年內(nèi)全球癌癥負(fù)擔(dān)將繼續(xù)增加[1]。我國肺癌的發(fā)病率與死亡率均居前列[2-3]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌病例的85%[4]。化療藥在NSCLC的治療中發(fā)揮了重要作用，但由于耐藥及不良反應(yīng)等問題，依然沒有取得令人滿意的治療效果[5]?；熕幾鳛橹委烴SCLC的有效手段，醫(yī)療需求巨大，國內(nèi)外藥物學(xué)家研制新型抗NSCLC藥物的潮流方興未艾，是NSCLC治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重要發(fā)展方向。

鉤枝藤屬植物在全世界共有約20種，我國僅分布1種，即鉤枝藤(Lour.) Merr.，生長(zhǎng)于海南島。鉤枝藤在我國的藥用歷史悠久，是海南黎族人民的常用藥物之一[6]。據(jù)《黎族藥志》記載，鉤枝藤具有軟堅(jiān)散結(jié)、消炎、止瀉、行氣等功效，民間常用于治療瘧疾、寄生蟲感染等疾病[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鉤枝藤具有抗腫瘤活性。早在1981年，我國學(xué)者已研究發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤總生物堿對(duì)大鼠W256肉瘤、小鼠S180肉瘤和艾氏腹水瘤有抑制作用[8]，并且其生物堿類單體化合物對(duì)人胃癌SGC-7721細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞及人白血病K562細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制活性[9-10]。近年來，Bringmann等[11-12]、Seupel等[13]研究顯示，鉤枝藤中的生物堿類化合物對(duì)人急性淋巴白血病CCRF-CEM細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞CEM/ADR5000具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤提取物在體外對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抑制活性，特別是可以選擇性地抑制肺癌細(xì)胞增殖，對(duì)NSCLC細(xì)胞NCI-H1975的敏感性最強(qiáng)[14]。以上研究表明鉤枝藤具有一定的抗癌活性，在作為抗腫瘤或輔助治療藥物方面具有較大潛力。本研究通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)研究鉤枝藤總生物堿對(duì)NSCLC細(xì)胞表達(dá)譜的影響，旨在全面分析鉤枝藤總生物堿對(duì)NSCLC細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)功能及免疫微環(huán)境產(chǎn)生的潛在影響，為進(jìn)一步揭示鉤枝藤總生物堿抗NSCLC的可能機(jī)制提供新的切入點(diǎn)，也為鉤枝藤應(yīng)用于NSCLC治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.2 藥材

鉤枝藤采自海南省樂東縣，經(jīng)大連民族大學(xué)弓曉杰教授鑒定為鉤枝藤科鉤枝藤屬植物鉤枝藤(Lour.) Merr.的枝葉。

1.3 藥品與試劑

胎牛血清（批號(hào)10270106）、RPMI 1640完全培養(yǎng)基（批號(hào)12633012）購自美國Gibco公司；Trizol試劑（批號(hào)10296010）購自美國Invitrogen公司；Qubit RNA試劑（批號(hào)Q32852）購自美國Life Technologies公司；NEBNext Ultra RNA庫制備試劑盒（批號(hào)E7765S）購自美國New England Biolabs公司。

1.4 儀器

N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；Alpha 1-4 LDplus型冷凍干燥機(jī)（德國Martin Christ公司）；Steri-Cycle型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Qubit?3.0型Qubit熒光定量?jī)x（美國Life Technologies公司）；Novaseq 6000型測(cè)序儀（美國Illumina公司）。

2 方法

2.1 鉤枝藤總生物堿的制備

取新鮮干燥的鉤枝藤枝葉，用95%乙醇回流提取，濃縮所得浸膏用2%鹽酸溶解，濾過，將濾液用環(huán)己烷萃取后分得酸水層藥液，在酸水層中加入二氯甲烷萃取，氨水調(diào)pH至10，分離得到二氯甲烷層藥液，將其減壓濃縮至膏狀，再冷凍干燥，得到棕黃色粉末，即為鉤枝藤總生物堿。采用酸性染料比色法，以溴甲酚綠為酸性染料，通過測(cè)定條件優(yōu)化及方法學(xué)考察，計(jì)算得到鉤枝藤總生物堿中生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.6%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NCI-H1975細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天更換新鮮培養(yǎng)基，2～3 d傳代1次。傳代時(shí)PBS潤(rùn)洗，胰酶消化，用完全培養(yǎng)基終止消化，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1975細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 藥物處理

根據(jù)本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定以接近鉤枝藤總生物堿對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentratin，IC50）＝77.2 μg/mL為給藥質(zhì)量濃度。將NCI-H1975細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105個(gè)，培養(yǎng)12 h。取鉤枝藤總生物堿，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基溶解使其終質(zhì)量濃度為80 μg/mL，將含藥培養(yǎng)基加入給藥組細(xì)胞中，對(duì)照組加入等量不含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

加入TRI試劑提取細(xì)胞總RNA，使用Qubit熒光定量?jī)x測(cè)定RNA純度和濃度，通過電泳跑膠確定樣本總量和質(zhì)量滿足建庫要求。進(jìn)行RNA測(cè)序文庫構(gòu)建，通過PCR富集得到cDNA文庫。為了提高測(cè)序準(zhǔn)確性，減少測(cè)序過程中的風(fēng)險(xiǎn)，測(cè)序前用定量PCR進(jìn)行文庫質(zhì)檢，測(cè)定文庫樣品的濃度和片段大小分布，檢測(cè)文庫質(zhì)量滿足要求，確定合適的上機(jī)混合測(cè)序方案。文庫質(zhì)檢要求為主峰300～600 bp，有效濃度≥10 nmol/L。使用Illumina Novaseq 6000型測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。Illumina文庫上機(jī)測(cè)序前進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，文庫測(cè)序時(shí)的狀態(tài)其實(shí)是擴(kuò)增后的狀態(tài)，而以Illumina文庫兩側(cè)接頭引物做qPCR，其擴(kuò)增后的產(chǎn)物狀態(tài)和文庫測(cè)序時(shí)的狀態(tài)是最接近的。

2.5 差異基因的篩選

將測(cè)序得到的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，得到干凈序列，使用短序列比對(duì)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用比對(duì)結(jié)果文件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建，通過Cufflinks程序計(jì)算各個(gè)基因的表達(dá)量用于后續(xù)分析。通過DESeq2算法進(jìn)行差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs）的篩選分析，篩選條件為|log2(fold change)|＞2和校正后＜0.05；使用R包“ggplot2”繪制聚類圖和火山圖。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）功能與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

基于基因注釋數(shù)據(jù)庫，檢測(cè)差異基因顯著通路。使用R包“clusterProfiler”和“enrichplot”進(jìn)行DEGs的GO功能及KEGG通路富集分析，＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org）構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape程序開展進(jìn)一步分析。選擇包含做多節(jié)點(diǎn)數(shù)的基因集，對(duì)模塊進(jìn)行排序，確定排序最前為關(guān)鍵模塊，進(jìn)一步對(duì)關(guān)鍵模塊中基因進(jìn)行KEGG通路與GO功能富集分析。PPI分析時(shí)，置信度為0.4，隱藏所有孤立的蛋白，無限制詞，使用MCODE插件確定PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心模塊（degree cutoff＝2，node score cutoff＝0.2，-core＝2，max.depth＝100），前3個(gè)模塊得分分別為9.727、7.429、5。

2.8 關(guān)鍵DEGs的預(yù)后分析

通過TCGA數(shù)據(jù)庫的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)人群中DEGs的情況進(jìn)行分析，使用GEPIA中的預(yù)后分析模塊驗(yàn)證非小細(xì)胞肺癌預(yù)后與關(guān)鍵基因表達(dá)的相關(guān)性，評(píng)估關(guān)鍵基因?qū)︻A(yù)后的影響，＜0.05認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.9 關(guān)鍵DEGs影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的分析

使用TIMER數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Spearman相關(guān)性計(jì)算，分析與預(yù)后相關(guān)的DEGs與免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）浸潤(rùn)之間的相關(guān)性；相關(guān)條件為相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值≥0.3，＋/?分別表示正/負(fù)相關(guān)性，＜0.05認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 NCI-H1975細(xì)胞表達(dá)譜分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選濾過處理，除去低質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果，共得到30 031個(gè)基因。首先利用檢驗(yàn)，分析得到各個(gè)值以及倍數(shù)變化（fold change）值，對(duì)倍數(shù)變化值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，然后將值進(jìn)行?lg轉(zhuǎn)化。由于值越小越顯著，所以進(jìn)行?lg的轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化值越大其差異就越顯著。以必須滿足|log2(fold change)|＞2和校正后＜0.05，即當(dāng)以上2種條件同時(shí)符合的情況交集出的基因群為顯著性高并且穩(wěn)定的DEGs。通過表達(dá)量差異分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鉤枝藤總生物堿處理后轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平有明顯差異，火山圖直接反映DEGs分布情況，藍(lán)色為下調(diào)，紅色為上調(diào)（圖1-A）。統(tǒng)計(jì)約10%的基因表達(dá)發(fā)生了改變，共計(jì)2976個(gè)DEGs。DEGs中表達(dá)下調(diào)基因明顯多于表達(dá)上調(diào)基因，其中2312個(gè)下調(diào)，664個(gè)上調(diào)。

為反映藥物影響的DEGs情況，對(duì)不同表達(dá)模式的基因通過基因表達(dá)聚類熱圖顯示（圖1-B）。結(jié)果顯示，給藥組NCI-H1975細(xì)胞表達(dá)譜與對(duì)照組差異明顯，并能夠聚類，顯示2組表達(dá)譜具有異質(zhì)性，直觀可見給予鉤枝藤總生物堿后影響細(xì)胞內(nèi)基因的差異變化情況。表明鉤枝藤總生物堿對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的表達(dá)譜有顯著影響。

A-DEGs火山圖 B-DEGs熱圖

3.2 DEGs功能分析

差異基因功能富集分析是通過不同的數(shù)據(jù)庫對(duì)基因功能進(jìn)行歸類，對(duì)差異基因的生物途徑進(jìn)行注釋及分類并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以進(jìn)一步尋找藥物的主要作用靶點(diǎn)。通過GO功能分析，確定DEGs在細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）3個(gè)層面上的影響。分別將所有上調(diào)及下調(diào)的DEGs作為前景基因，進(jìn)行差異基因分析的所有基因?yàn)楸尘盎?，進(jìn)行GO功能富集。GO功能富集結(jié)果＜0.05，被定義為差異基因在給定基因集中顯著富集的GO條目和通路。在此分析中，對(duì)值取負(fù)對(duì)數(shù)（?lg），值越小，?lg越大，富集程度越大，該GO條目越有意義，進(jìn)一步按照值進(jìn)行排序，表達(dá)上調(diào)組和下調(diào)組各取前10進(jìn)行展示（圖2）。結(jié)果顯示，在MF層面表達(dá)上調(diào)的DEGs影響了核糖結(jié)合、RNA催化活性、連接酶活性等；表達(dá)下調(diào)的DEGs影響了微管運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合等。在CC層面表達(dá)上調(diào)的DEGs影響了核糖體與線粒體等，表達(dá)下調(diào)的DEGs影響了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、溶酶體、收縮纖維、細(xì)胞-細(xì)胞黏附連接、胞質(zhì)區(qū)等。在BP層面表達(dá)上調(diào)的DEGs影響了細(xì)胞對(duì)核糖體生物合成、rRNA加工與代謝的作用等；表達(dá)下調(diào)的DEGs影響了細(xì)胞骨架組織的調(diào)控、細(xì)胞連接、整合素及干擾素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)等。這些表達(dá)水平改變最顯著的相關(guān)基因，與影響NSCLC細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。

A-上調(diào)DEGs的GO功能富集分析 B-下調(diào)DEGs的GO功能富集分析

3.3 DEGs信號(hào)通路分析

KEGG通路富集分析是東京大學(xué)和京都大學(xué)共同研制的數(shù)據(jù)庫，可查詢通路，進(jìn)一步尋找活性成分作用靶點(diǎn)顯著富集的體內(nèi)通路[15]。體內(nèi)不同基因通過相互作用行使復(fù)雜的生物學(xué)功能，進(jìn)行信號(hào)通路分析可確定DEGs參與的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生化代謝途徑。分別將所有上調(diào)及下調(diào)的DEGs作為前景基因，進(jìn)行差異基因分析的所有基因?yàn)楸尘盎?，分別對(duì)DEGs表達(dá)上調(diào)組和表達(dá)下調(diào)組進(jìn)行KEGG通路分析（圖3），通路富集＜0.05。結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)的DEGs主要影響了鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬、錯(cuò)配修復(fù)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)與降解、聚糖降解等途徑；表達(dá)下調(diào)的DEGs主要影響了病毒致癌、蛋白聚糖、溶酶體、細(xì)胞間隙連接、NOD樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路等。

以上結(jié)果表明，使用鉤枝藤總生物堿處理NCI-H1975細(xì)胞后，與細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲密切相關(guān)的鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬、溶酶體、細(xì)胞間隙連接、NOD樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路等受到顯著影響。提示鉤枝藤總生物堿可能通過作用于這些通路影響了NCI-H1975細(xì)胞的增殖和凋亡，并有潛力抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

A-上調(diào)DEGs的KEGG通路分析 B-下調(diào)DEGs的KEGG通路分析

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵模塊分析

PPI網(wǎng)絡(luò)是從生物化學(xué)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳網(wǎng)絡(luò)的角度來可視化構(gòu)建藥物和疾病相關(guān)蛋白分子之間的相關(guān)性，能更好地理解基因編碼的蛋白直接或間接的參與細(xì)胞的生物學(xué)功能。設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小代表度值（degree），節(jié)點(diǎn)越大，表示其度值越大，最終獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建并進(jìn)行分析，通過MCODE確定PPI網(wǎng)絡(luò)中的前3個(gè)模塊（圖4），將排序第1的模塊為核心模塊。核心模塊1包含23個(gè)節(jié)點(diǎn)和107條邊，所含基因包括白細(xì)胞介素11（interleukin 11，）、2′,5′-寡腺苷酸合成酶2（2′,5′-oligoadenylate synthetase 2，）、白細(xì)胞介素7受體（interleukin 7 receptor，）、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物（myelocytomatosis viral oncogene homolog，）、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1（X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1，）、腫瘤壞死因子超家族成員10（tumor necrosis factor superfamily 10，）、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，）、無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族3A（wingless-type MMTV integration site family, member 3A，）、細(xì)胞因子受體樣因子2（cytokine receptor-like factor 2，）、激酶插入域受體（kinase insert domain receptor，）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，）、SRY相關(guān)高遷移率族盒蛋白轉(zhuǎn)錄因子2（sry-related high-mobility-group box-containing 2，）、受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（receptor transporter protein 4，）、角形四肽重復(fù)干擾素誘導(dǎo)蛋白3（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3，）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8（fibroblast growth factor 8，）、不育α基序結(jié)構(gòu)域9樣（sterile alpha motif domain containing 9-like gene，）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，）、、、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，）、、等。

通過對(duì)核心模塊中基因進(jìn)行分析，包括KEGG通路和GO功能富集分析，顯示核心模塊1中基因可影響細(xì)胞因子受體相互作用、Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）及叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)OXO）相關(guān)信號(hào)通路（圖5-A），同時(shí)還可影響I型干擾素信號(hào)通路及STAT受體信號(hào)通路等的調(diào)節(jié)功能（圖5-B）。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖5 核心模塊基因的KEGG通路(A) 和GO功能(B) 富集分析

3.5 關(guān)鍵基因?qū)SCLC預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

腫瘤浸潤(rùn)是指腫瘤細(xì)胞分裂增生進(jìn)入到周圍的組織間隙、淋巴瘤血管內(nèi)，并破壞周圍的組織，對(duì)NSCLC治療和患者預(yù)后有重要影響。首先研究核心模塊中關(guān)鍵基因?qū)SCLC預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)基因在NSCLC中的表達(dá)水平明顯高于肺正常組織的表達(dá)水平，且基因的高表達(dá)與NSCLC不良預(yù)后相關(guān)（圖6）。進(jìn)一步通過TIMER 2.0分析6種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的情況，以確定相關(guān)基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。如表1所示，與中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)；與中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)；與NSCLC細(xì)胞純度呈負(fù)相關(guān)，與6種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平均呈正相關(guān)；與中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)；與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)；與CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)；與NSCLC細(xì)胞純度呈負(fù)相關(guān)，與B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)；與NSCLC細(xì)胞純度呈負(fù)相關(guān)，與中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)。

A-IL11基因在NSCLC癌組織中的表達(dá)情況箱線圖 B-IL11基因表達(dá)對(duì)NSCLC預(yù)后的影響 ***P＜0.001

表1 關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性分析

Table 1 Analysis of correlation between key genes and immune infiltration

基因NSCLC細(xì)胞純度B細(xì)胞CD8+ T細(xì)胞CD4+ T細(xì)胞 相關(guān)系數(shù)P值相關(guān)系數(shù)P值相關(guān)系數(shù)P值相關(guān)系數(shù)P值 IFIT2?0.2541.00×10?80.1471.22×10?30.2915.44×10?110.3335.05×10?14 IFIT3?0.2841.29×10?100.0983.18×10?20.3242.11×10?130.2658.37×10?9 IL7R?0.4621.96×10?270.3741.65×10?170.5282.29×10?360.4095.64×10?21 OAS2?0.2878.26×10?110.1062.01×10?20.2511.84×10?80.3363.19×10?14 RSAD2?0.2737.08×10?100.0973.37×10?20.2026.68×10?60.2822.63×10?10 RTP4?0.2869.14×10?110.2757.34×10?100.2624.08×10?90.3787.50×10?18 SAMD9L?0.3965.49×10?200.3161.11×10?120.8658.82×10?170.5031.91×10?32 XAF1?0.3664.23×10?170.2822.63×10?100.1816.11×10?50.5404.68×10?38 基因巨噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞樹突狀細(xì)胞 相關(guān)系數(shù)P值相關(guān)系數(shù)P值相關(guān)系數(shù)P值 IFIT20.3112.64×10?120.4971.62×10?310.5498.66×10?40 IFIT30.2322.48×10?70.4999.40×10?320.5031.18×10?52 IL7R0.4839.24×10?300.6585.49×10?610.6466.87×10?59 OAS20.2064.65×10?60.4591.44×10?260.4364.42×10?24 RSAD20.2246.59×10?70.4341.25×10?230.4481.65×10?25 RTP40.0943.90×10?20.4178.72×10?220.4348.48×10?24 SAMD9L0.2701.61×10?90.6224.29×10?580.6221.54×10?53 XAF10.1323.68×10?30.4431.40×10?240.4311.53×10?23

4 討論

目前，治療NSCLC藥物的機(jī)制研究大部分僅針對(duì)少數(shù)幾個(gè)基因、蛋白的比較分析，對(duì)免疫微環(huán)境影響的探索也比較局限，一般僅在通路水平上進(jìn)行探討，因此提供的信息較為單一，難以系統(tǒng)全面地認(rèn)識(shí)相關(guān)基因的表達(dá)狀況[16]。大量的研究表明，基因和蛋白質(zhì)較少單獨(dú)起作用，它們往往通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)交互作用共同影響生物系統(tǒng)的功能，這些功能高度相關(guān)的基因構(gòu)成基因群[17]。轉(zhuǎn)錄組研究能夠全面地反映基因表達(dá)譜，從基因功能以及基因結(jié)構(gòu)的整體水平揭示體內(nèi)生物學(xué)的特定過程與疾病發(fā)生發(fā)展過程中的可能分子機(jī)制[18]。研究藥物對(duì)特定細(xì)胞系表達(dá)譜的影響可以為藥物開發(fā)提供更為詳實(shí)的理論依據(jù)[19]。鉤枝藤具有潛在的抗腫瘤活性，具有開發(fā)成NSCLC治療藥物的潛力，但其分子機(jī)制尚不明確。本研究采用二代測(cè)序技術(shù)，深入挖掘分析了鉤枝藤總生物堿處理NSCLC細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤總生物堿能夠改變NCI-H1975細(xì)胞的表達(dá)譜，其中2312個(gè)基因下調(diào)，664個(gè)基因上調(diào)。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)水平的變化，反映表型的差異。對(duì)于表達(dá)量高且差異很大的基因，或者共有的差異基因，都將是后續(xù)研究中重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象。進(jìn)一步通過KEGG通路和GO功能富集分析，確定這些DEGs影響了鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬、錯(cuò)配修復(fù)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)與降解、聚糖降解、病毒致癌、蛋白聚糖、溶酶體、細(xì)胞間隙連接、NOD樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路等，表明鉤枝藤總生物堿可能影響NCI-H1975細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲。已有研究證實(shí)鉤枝藤對(duì)胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞均具有一定的抑制增殖及促進(jìn)凋亡作用[9-10]。這些差異基因顯著富集的通路，是反映藥物發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵通路，目前這些基因與鉤枝藤在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的相互關(guān)系鮮有相關(guān)研究報(bào)道，可以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中直接對(duì)這些通路展開分析和討論。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析，發(fā)現(xiàn)核心模塊中關(guān)鍵基因的高表達(dá)是NSCLC預(yù)后不良因素，這與前期研究相符[20-21]，說明鉤枝藤總生物堿具有改善NSCLC預(yù)后的潛力。可介導(dǎo)纖維炎癥性疾病[22]，突變導(dǎo)致的信號(hào)丟失可預(yù)防肺纖維化，這與肌成纖維細(xì)胞中自分泌的活性降低有關(guān)[23-26]，提示能夠作為肺纖維化治療的潛在靶標(biāo)。還能對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的黏附和遷移產(chǎn)生重要影響[27]，并能促進(jìn)結(jié)腸炎進(jìn)一步發(fā)展為結(jié)腸癌[28]。的高表達(dá)也有利于增強(qiáng)STAT3，促進(jìn)胃癌的發(fā)展[29]。也有研究證實(shí)，/和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化/E盒結(jié)合鋅指蛋白1的信號(hào)協(xié)同通過S100蛋白表達(dá)的差異調(diào)節(jié)，驅(qū)動(dòng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲[30]。當(dāng)前在NSCLC中研究尚較少，有深入探索的價(jià)值。

對(duì)核心模塊關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG通路和GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)JAK/STAT、I型干擾素、FOXO等相關(guān)信號(hào)通路受到了影響。JAK/STAT通路是胞外細(xì)胞因子啟動(dòng)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)核心，誘導(dǎo)癌癥和炎癥中關(guān)鍵介質(zhì)的表達(dá)，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及炎癥等多個(gè)生理過程[31]；I型干擾素通過多種信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抑制血管生成，可以在肺癌治療中調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)活力及轉(zhuǎn)移性侵襲[32-33]；FOXO轉(zhuǎn)錄因子參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞的增殖、凋亡等過程，可作為治療癌癥藥物的靶點(diǎn)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)其核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要參與細(xì)胞的凋亡、炎癥和免疫信號(hào)通路，處于PPI網(wǎng)絡(luò)中的等關(guān)鍵基因可能是其重要的藥效靶點(diǎn)。這從一定程度上說明鉤枝藤總生物堿抗NSCLC的機(jī)制可能與這些通路密切相關(guān)，提示鉤枝藤總生物堿可能通過參與多條信號(hào)通路來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，后續(xù)將完善實(shí)驗(yàn)，并針對(duì)這些基因進(jìn)行表達(dá)水平分析和功能分析，為發(fā)現(xiàn)新的NSCLC治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

腫瘤組織不只包含腫瘤細(xì)胞，還含有基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等其他不同類型的細(xì)胞，這些細(xì)胞整體構(gòu)成了腫瘤的微環(huán)境。不同的免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮不同的作用，而不同腫瘤的免疫細(xì)胞組成也各有特點(diǎn)，所以分析藥物對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，對(duì)于研究藥物的腫瘤治療作用具有重要的指導(dǎo)意義。本研究發(fā)現(xiàn)核心模塊1中的、、、、、、、對(duì)NSCLC腫瘤組織腫瘤純度和浸潤(rùn)免疫細(xì)胞類型均有影響。CD4+T細(xì)胞在腫瘤免疫響應(yīng)和腫瘤治療中可以發(fā)揮多方面的作用，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域得到了充分認(rèn)可，可以用來控制腫瘤進(jìn)展和預(yù)防患者復(fù)發(fā)[35]。中性粒細(xì)胞可以參與協(xié)調(diào)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，介導(dǎo)促腫瘤和抗腫瘤反應(yīng)，在癌癥生物學(xué)及癌癥預(yù)后中具有重要意義[36]。樹突狀細(xì)胞用于攝取腫瘤抗原和啟動(dòng)不同亞群的抗原特異性T細(xì)胞，能夠啟動(dòng)從頭的抗腫瘤反應(yīng)[37]。這些結(jié)果表明，鉤枝藤總生物堿處理后可能改變了NSCLC所處的免疫微環(huán)境，進(jìn)而影響NSCLC的發(fā)展進(jìn)程并改善預(yù)后。這些核心模塊中的關(guān)鍵基因不僅參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還可能參與了鉤枝藤總生物堿改變NSCLC免疫微環(huán)境的過程。但其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探索，值得在以后的研究中繼續(xù)探討。

本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)我國獨(dú)特的民族藥物鉤枝藤抗NSCLC的分子機(jī)制進(jìn)行探索，獲取了一些與鉤枝藤抗NSCLC相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物和可能作用途徑，為進(jìn)一步研究鉤枝藤抗NSCLC作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究提供思路和線索。從轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，鉤枝藤總生物堿能夠顯著改變NCI-H1975細(xì)胞的表達(dá)譜，對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的鐵死亡、氧化磷酸化、線粒體自噬等與癌癥進(jìn)展關(guān)聯(lián)密切的信號(hào)通路產(chǎn)生了重要影響，同時(shí)還影響了NSCLC的免疫微環(huán)境。本研究已在NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)鉤枝藤總生物堿的影響進(jìn)行了研究，未來需要進(jìn)行更深層次的研究，如進(jìn)一步分析蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行深入探索，系統(tǒng)的分析鉤枝藤總生物堿對(duì)NSCLC細(xì)胞生物功能和免疫微環(huán)境的影響，將有助于進(jìn)一步揭示鉤枝藤抗NSCLC的活性作用，并提供新的防治靶點(diǎn)及策略。綜上所述，鉤枝藤具有潛在的抗NSCLC活性作用，本研究為后續(xù)深入挖掘鉤枝藤抗NSCLC的分子機(jī)制和靶點(diǎn)，進(jìn)一步開發(fā)高效低毒的創(chuàng)新藥物提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Global Burden of Disease 2019 Cancer Collaboration, Kocarnik J M, Compton K,. Cancer incidence, mortality, years of life lost, years lived with disability, and disability-adjusted life years for 29 cancer groups from 2010 to 2019: A systematic analysis for the global burden of disease study 2019 [J]., 2022, 8(3): 420-444.

[2] Sung H, Ferlay J, Siegel R L,. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]., 2021, 71(3): 209-249.

[3] Feng R M, Zong Y N, Cao S M,. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 Global Cancer Statistics? [J]., 2019, 39(1): 22.

[4] Hirsch F R, Scagliotti G V, Mulshine J L,. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments [J]., 2017, 389(10066): 299-311.

[5] Ramalingam S S, Novello S, Guclu S Z,. Veliparib in combination with platinum-?based chemotherapy for first-?line treatment of advanced squamous cell lung cancer: A randomized, multicenter phase III study [J]., 2021, 39(32): 3633-3644.

[6] 中國科學(xué)院華南植物研究所. 海南植物志 (第一卷) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1964: 515-516.

[7] 戴好富. 黎族藥志(第一冊(cè)) [M]. 北京: 中國科學(xué)技術(shù)出版社, 2008: 124-125.

[8] 陳政雄, 王保德, 秦國偉, 等. 鉤枝藤中生物堿的分離和鑒定[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 1981, 16(7): 519-523.

[9] 蘇志恒. 鉤枝藤化學(xué)成分的研究 [D]. 沈陽: 沈陽藥科大學(xué), 2007.

[10] 蔡彩虹. 鉤枝藤枝條的生物活性成分研究 [D]. ?？? 海南大學(xué), 2013.

[11] Bringmann G, Seupel R, Feineis D,. Ancistectorine D, a naphthylisoquinoline alkaloid with antiprotozoal and antileukemic activities, and further 5,8′- and 7,1′-linked metabolites from the Chinese liana[J]., 2016, 115: 1-8.

[12] Bringmann G, Seupel R, Feineis D,. Antileukemic ancistrobenomine B and related 5,1′-coupled naphthylisoquinoline alkaloids from the Chinese liana[J]., 2017, 121: 76-85.

[13] Seupel R, Hemberger Y, Feineis D,. Ancistrocyclinones A and B, unprecedented pentacyclic N, C-coupled naphthylisoquinoline alkaloids, from the Chinese liana[J]., 2018, 16(9): 1581-1590.

[14] 陳靜, 李珂珂, 弓曉杰. 鉤枝藤抗腫瘤有效部位的制備及活性篩選 [J]. 大連民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 22(5): 396-399.

[15] 羅雪菲, 王偉, 趙曉芳, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桃蓮絞復(fù)方增強(qiáng)全成分腫瘤細(xì)胞疫苗抗結(jié)直腸癌作用分子機(jī)制 [J]. 中草藥, 2021, 52(2): 459-468.

[16] Shen Y L, Cai H J, Ma S J,. Telocinobufagin has antitumor effects in non-small-cell lung cancer by inhibiting STAT3 signaling [J]., 2022, 85(4): 765-775.

[17] 宋敏, 劉濤, 鞏彥龍, 等. 活血定眩膠囊對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3基因表達(dá)譜的影響及生物信息學(xué)分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(8): 1617-1623.

[18] Koeppel F, Bobard A, Lefebvre C,. Added value of whole-exome and transcriptome sequencing for clinical molecular screenings of advanced cancer patients with solid tumors [J]., 2018, 24(4): 153-162.

[19] 楊照環(huán), 胡文倩, 賈禎賢, 等. 根皮苷對(duì)食管癌細(xì)胞系表達(dá)譜的影響 [J]. 中草藥, 2021, 52(23): 7236-7243.

[20] 柳雅慧. IL-11促進(jìn)NSCLC進(jìn)展并與患者不良預(yù)后相關(guān) [D]. 天津: 天津醫(yī)科大學(xué), 2018.

[21] Zhao M, Liu Y H, Liu R,. Upregulation of IL-11, an IL-6 family cytokine, promotes tumor progression and correlates with poor prognosis in non-small cell lung cancer [J]., 2018, 45(6): 2213-2224.

[22] Cook S A, Schafer S. Hiding in plain sight: Interleukin-11 emerges as a master regulator of fibrosis, tissue integrity, and stromal inflammation [J]., 2020, 71: 263-276.

[23] Ng B, Widjaja A A, Viswanathan S,. Similarities and differences between IL11 and IL11RA1 knockout mice for lung fibro-inflammation, fertility and craniosynostosis [J]., 2021, 11(1): 14088.

[24] Dong J R, Viswanathan S, Adami E,. Hepatocyte-specific IL11-signaling drives lipotoxicity and underlies the transition from NAFLD to NASH [J]., 2021, 12(1): 66.

[25] Schafer S, Viswanathan S, Widjaja A A,. IL-11 is a crucial determinant of cardiovascular fibrosis [J]., 2017, 552(7683): 110-115.

[26] Kortekaas R K, Burgess J K, van Orsoy R,. Therapeutic targeting of IL-11 for chronic lung disease [J]., 2021, 42(5): 354-366.

[27] Lay V, Yap J, Sonderegger S,. Interleukin 11 regulates endometrial cancer cell adhesion and migration via STAT3 [J]., 2012, 41(2): 759-764.

[28] Wang H, Wang D H, Yang X,. Colitis-induced IL11 promotes colon carcinogenesis [J]., 2021, 42(4): 557-569.

[29] Zhou R J, Wu Z B, Deng X X,. The long non-coding RNA OLC8 enhances gastric cancer by interaction with IL-11 [J]., 2019, 33(8): e22962.

[30] Al-Ismaeel Q, Neal C P, Al-Mahmoodi H,. ZEB1 and IL-6/11-STAT3 signalling cooperate to define invasive potential of pancreatic cancer cells via differential regulation of the expression of S100 proteins [J]., 2019, 121(1): 65-75.

[31] Hu X Y, Li J, Fu M R,. The JAK/STAT signaling pathway: From bench to clinic [J]., 2021, 6(1): 402.

[32] Bai M, Li W, Yu N Z,. The crosstalk between β-catenin signaling and type I, type II and type III interferons in lung cancer cells [J]., 2017, 9(6): 2788-2797.

[33] Galani V, Kastamoulas M, Varouktsi A,. IFNs-signaling effects on lung cancer: An up-to-date pathways-specific review [J]., 2017, 17(3): 281-289.

[34] Calissi G, Lam E W F, Link W. Therapeutic strategies targeting FOXO transcription factors [J]., 2021, 20(1): 21-38.

[35] Ben Khelil M, Godet Y, Abdeljaoued S,. Harnessing antitumor CD4+T cells for cancer immunotherapy [J]., 2022, 14(1): 260.

[36] Carnevale S, Ghasemi S, Rigatelli A,. The complexity of neutrophils in health and disease: Focus on cancer [J]., 2020, 48: 101409.

[37] Le Gall C M, Weiden J, Eggermont L J,. Dendritic cells in cancer immunotherapy [J]., 2018, 17(6): 474-475.

Effect of total alkaloids ofon expression profiles and immune microenviroment of non-small cell lung cancer cell lines

LI Zhong-yu1, 2, 3, ZHAO Yi-ran1, 2, 3, MEN Lei1, 2, 3, GONG Xiao-jie1, 2, 3, LI Ke-ke1, 2, 3

1. College of Life Sciences, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China 2. Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization, Ministry of Education, Dalian 116600, China 3. Key Laboratory of Development and Application of Functional Components of Ethnic Medicines, Province of Liaoning, Dalian 116600, China

To evaluate the effect of total alkaloids ofon expression profile of non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines, screen out differentially expressed genes (DEGs) for analysis and mining the functional genes, in order to provide a theoretical basis for exploring the molecular mechanism of total alkaloids ofanti-lung cancer.NCI-H1975 cells of NSCLC were treated with total alkaloids of. RNA-Seq technology was used to perform whole transcriptome sequencing to obtain DEGs. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis for DEGs were performed. Key modules of differential genes were screened and their functions were analyzed, the impact of key genes on the survival of NSCLC were further analyzed. By analyzing of total alkaloids ofon NSCLC immune infiltration, correlation of key gene expression and immune infiltration level were determined.Transcriptome sequencing showed that total 2976 DEGs were identified of which 664 were up-regulated and 2312 were down-regulated in NCI-H1975 cells treated with total alkaloids of. Total alkaloids ofhad an important impact on signaling pathways mediated by ferroptosis, oxidative phosphorylation, mitochondria, lysosomes, gap junctions, nucleotide binding oligomerization domain (NOD)-like receptors. In the hub module, high expression of interleukin 11 () could reduce the overall survival rate of NSCLC, and was one of the poor prognostic factors of NSCLC patients; Interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3 (), interleukin 7 receptor (), 2′,5′-oligoadenylate synthetase 2 (), radical-adenosyl methionine domain containing 2 (), receptor transporter protein 4 (), sterile alpha motif domain containing 9-like gene () and X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1 () expression levels could affect the purity of NSCLC tissue and type of immune cell infiltration, which may alter the immune microenvironment of NSCLC.Total alkaloids ofcould affect the transcriptional profile of NSCLC cells and have potential anti-NSCLC activity.

(Lour.) Merr.; non-small cell lung cancer; alkaloids; RNA-Seq; immune infiltration

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5417 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.018

2022-04-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82173913）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82104532）；2020年國家民委中青年英才項(xiàng)目

李中玉，博士，講師，研究方向?yàn)槲⒘骺仄鞴傩酒c天然藥物的研究開發(fā)。Tel: (0411)87188637 E-mail: lizhongyu2019@yeah.net

李珂珂，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥及天然藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。E-mail: like905219@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]