壯藥材紅根草的化學(xué)成分及生物活性研究

陳興廣，黃園園，閔建國，袁經(jīng)權(quán)，周艷林

壯藥材紅根草的化學(xué)成分及生物活性研究

陳興廣1, 2，黃園園1，閔建國2*，袁經(jīng)權(quán)1*，周艷林2

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)藥科學(xué)實驗中心，廣西 南寧 530200 2. 桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004

研究紅根草（黃埔鼠尾草全草）的化學(xué)成分，并對部分化合物進行初步的抗炎、抗腫瘤活性篩選。應(yīng)用正、反相硅膠，Sephadex LH-20，制備液相色譜等方法分離純化，并結(jié)合核磁共振氫譜、碳譜和質(zhì)譜等技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。采用Griess法和MTT法對分離得到的部分三萜化合物進行初步的抗炎活性篩選和抗腫瘤活性研究。從紅根草50%乙醇提取物中分離得到15個化合物，分別鑒定為8,11,14-三烯-松香烷（1）、柳杉酚（2）、淚杉醇（3）、狗脊蕨酸（4）、白樺脂酸（5）、白樺脂醇（6）、樺木酮酸（7）、齊墩果酸（8）、3-表齊墩果酸（9）、23-羥基齊墩果酸（10）、常春藤皂苷元（11）、3α,24-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸（12）、2α,3α,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（13）、熊果酸（14）、α-香樹脂醇（15）。化合物8、14對NO生成抑制率達(dá)到60%以上；化合物8、13對人膀胱癌EJ細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為（24.32±1.60）、（44.23±0.82）μmol/L；化合物8對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的IC50值為（25.13±7.07）μmol/L?；衔?、7、10、14、15為首次從該植物中分離得到；其中化合物8、14抗炎活性較強；化合物8、11、13對EJ細(xì)胞有較強抑制作用；化合物8、10、11對PANC-1細(xì)胞有良好抑制作用。

紅根草；三萜；抗炎；抗腫瘤；狗脊蕨酸；樺木酮酸；齊墩果酸；2α,3α,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸；熊果酸

紅根草為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物黃埔鼠尾草Hance的干燥全草，分布在廣西、江西、福建、廣東等省區(qū)。紅根草味微苦，性涼，主入肺、肝、胃、大腸經(jīng)，具有疏風(fēng)清熱、利濕、止血、安胎等功效，臨床用于感冒發(fā)熱、肺炎咳喘、咽喉腫痛、腹瀉、痢疾和腎炎等[1-3]。收錄于《廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第二卷[4]，壯醫(yī)認(rèn)為其味微苦，性涼，具有清熱毒，調(diào)氣道、谷道的功效，常用于治療貨煙媽（咽炎）、埃?。人裕⒁膺洌〖玻┑取，F(xiàn)代研究表明，紅根草具有抗凝血[5]、抑菌抗炎[6]、抗癌[7]等藥理作用，主要含有二萜[8-9]、三萜[10]、酚性類[8]等化學(xué)成分。

民族醫(yī)藥是中國少數(shù)民族的傳統(tǒng)醫(yī)藥，是中醫(yī)藥的重要組成部分，在保障少數(shù)民族群眾健康方面發(fā)揮著重要作用，需要在民族醫(yī)學(xué)體系指導(dǎo)下不斷傳承創(chuàng)新[11]。復(fù)方紅根草片是桂林三金藥業(yè)股份有限公司在廣西民間驗方基礎(chǔ)上研制開發(fā)的獨家中成藥，處方由紅根草、魚腥草、穿心蓮等5味組成，具有清熱解毒之功，臨床用于急性咽喉炎、扁桃體炎、腸炎、痢疾等疾病，并列為富有特色的廣西壯成藥品種。紅根草作為處方君藥，是發(fā)揮抗炎作用的主要藥味之一。近年來，紅根草資源調(diào)查[12]表明受生態(tài)環(huán)境破壞影響，野生資源日趨緊張，紅根草有關(guān)化學(xué)成分、藥理活性研究基礎(chǔ)薄弱，也限制了該資源可持續(xù)利用。本實驗對壯藥紅根草的化學(xué)成分進行系統(tǒng)研究，從其50%乙醇提取物中分離得到15個化合物，分別鑒定為8,11,13-三烯-松香烷（abieta-8,11,13-trien，1）、柳杉酚（sugiol，2）、淚杉醇（manoo1，3）、狗脊蕨酸（woodwardic acid，4）、白樺脂酸（betulinic acid，5）、白樺脂醇（betulin，6）、樺木酮酸（betulonic acid，7）、齊墩果酸（oleanic acid，8）、3-表齊墩果酸（3-epioleanolic acid，9）、23-羥基齊墩果酸（23-hydroxy-oleanolic acid，10）、常春藤皂苷元（hederagenin，11）、3α,24-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸（3α,24-dihydroxy-12-en-28-oleanolic acid，12）、2α,3α,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（2α,3α,24-trihydroxy-12-en-28-ursic acid，13）、熊果酸（ursolic acid，14）、α-香樹脂醇（α-amyrin，15）。其中，化合物4、7、10、14、15為首次從該植物中分離得到；初步探究了其中三萜類化合物的抗炎及抗腫瘤生物活性，可為紅根草及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升，民族藥用資源合理開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

Bruker 600 MHz、Bruker 500 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Waters 2535型制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Thermo C18柱（150 mm×10 mm，5 μm）；ICP-MS質(zhì)譜儀（美國THERMO公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛公司）；高速冷凍微型離心機（美國SCILOGEX公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（新加坡Esco公司）；AL204精密電子天平（上海托利多儀器有限公司）。

柱色譜硅膠（100～200、200～300、300～400目，青島海洋化工有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純），其余試劑為國產(chǎn)分析純。DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、胰酶溶液（均購自美國Gibco公司）；PBS緩沖液、二甲亞砜、MTT（均購自Solabio公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，Sigma公司）；一氧化氮檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；順鉑（美國MedChemExpress公司）。

1.2 材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7（購自中科院上海生科院細(xì)胞資源中心）；人膀胱癌EJ細(xì)胞、人食管癌ECA-109細(xì)胞、人胰腺癌PANC-1細(xì)胞均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

紅根草藥材于2018年4月采自廣西桂林臨桂區(qū)，經(jīng)桂林三金藥業(yè)股份有限公司正高級工程師鐘小清鑒定為唇形科鼠尾草屬植物黃埔鼠尾草Hance的干燥全草，藥材標(biāo)本（20180516001）保存于該公司中藥研究所標(biāo)本室。

2 方法

2.1 提取與分離

取紅根草10 kg，破碎，用50%乙醇回流提取3次，減壓回收溶劑，得到總提取物。用水分散后，以石油醚、醋酸乙酯、正丁醇依次反復(fù)萃取，回收溶劑，得到石油醚部位（140.4 g）、醋酸乙酯部位（72.8 g）和正丁醇部位（17.2 g）。

石油醚部位浸膏140.4 g，用正相硅膠柱色譜（100～200目）分離，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→1∶100）梯度洗脫，分得PE1～11組分。組分PE1（3.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜法，以石油醚-二氯甲烷（100∶1→1∶100）梯度洗脫，得到化合物1（195 mg）；組分PE3（41.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜法，以石油醚-醋酸乙酯（50∶1→1∶100）梯度洗脫，得到流分PE3-1～15，其中PE3-5（2.2 g）經(jīng)多次硅膠柱色譜法分離得到化合物3（11.3 mg），PE3-10（50 mg）、PE3-13（108 mg）分別經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脫，得到化合物15（9.5 mg）和2（8.6 mg）；PE3-4（17 g）依次經(jīng)硅膠、Sephadex LH-20和制備液相柱色譜分離得到化合物8（92 mg）。

醋酸乙酯部位浸膏72.8 g，經(jīng)D101大孔樹脂柱色譜分離，水及30%、50%、70%、95%乙醇梯度洗脫，分得EA1～7個組分。組分EA5（19.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜法，以二氯甲烷-甲醇（100∶1→1∶100）梯度洗脫，得到流分EA5-1～10，其中EA5-6（53 mg）、EA5-7（27 mg）經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱色譜分離，分別以二氯甲烷-甲醇（1∶1）和甲醇等度洗脫，分別得化合物11（27 mg）和12（7.3 mg），EA5-8（200 mg）經(jīng)過ODS柱色譜分離，以甲醇-水（0～100%）梯度洗脫，得到化合物13（6.6 mg）；組分6（17.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜法，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→1∶100）梯度洗脫，得到流分EA6-1～11，EA6-4（800 mg）、EA6-5（820 mg）、EA6-8（560 mg）經(jīng)過Sephadex LH-20柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脫，得到化合物4（200 mg）、9（11.3 mg）和14（78 mg），EA6-7（210 mg）經(jīng)過制備高效液相色譜（甲醇-水83∶17）分離得到化合物10（9.6 mg）；EA7（12.1 g）經(jīng)ODS柱色譜分離，用水及30%、60%、70%、80%、90%、甲醇梯度洗脫，得到流分EA7-1～7，其中EA7-6（15.9 mg）、EA7-8（25.6 mg）和EA7-10（2 g）分別經(jīng)過Sephadex LH-20柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脫，經(jīng)過TLC分析合并相同流分，得到化合物6（5.5 mg）、7（7 mg）、5（1.4 g）。

2.2 抗炎、抗腫瘤活性篩選

2.2.1 紅根草中單體化合物對RAW264.7細(xì)胞生長活力的影響 參考文獻(xiàn)方法[13]，應(yīng)用MTT法評估化合物4～5、7～14均在50.0 μmol/L濃度下對RAW264.7細(xì)胞生長活力的影響。

2.2.2 紅根草中單體化合物對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響 參考文獻(xiàn)方法[13]，采用Griess法測定吸光度（）值，考察化合物4～5、7～14在50.0 μmol/L濃度下抑制LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO能力。

NO生成抑制率＝(LPS－LPS+樣品)/(LPS－空白)

2.2.3 抗腫瘤活性測定 參考文獻(xiàn)方法[14]，采用MTT法測定化合物4～5、7～14在不同濃度下（終濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）對ECA-109細(xì)胞、EJ細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞的抑制活性。使用 Graphpad Prism8軟件計算其半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀物。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.16 (1H, d,= 8.2 Hz, H-11), 6.97 (1H, dd,= 8.2, 1.6 Hz, H-12), 6.88 (1H, d,= 1.6 Hz, H-14), 2.87～2.79 (1H, m, H-15), 2.93～2.77 (2H, m, H-7), 1.39 (1H, td,= 13.1, 3.6 Hz, H-1α), 2.26 (1H, d,= 12.7 Hz, H-1β), 1.58 (1H, m, H-2α), 1.64-1.77 (1H, m, H-2β), 1.46 (1H, d,= 13.2 Hz, H-3β), 1.34 (1H, dd,= 12.5, 2.3 Hz, H-5), 1.85 (1H, ddd,= 7.4, 6.6, 3.7 Hz, H-6α), 1.77～1.70 (1H, m, H-6β), 1.21 (6H, d,= 7.0 Hz, 16, 17-CH3), 1.17 (3H, s, 20-CH3), 0.93 (3H, s, 18-CH3), 0.92 (3H, s, 19-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 39.0 (C-1), 19.5 (C-2), 41.9 (C-3), 33.6 (C-4), 50.6 (C-5), 19.3 (C-6), 30.7 (C-7), 135.0 (C-8), 147.7 (C-9), 37.7 (C-10), 124.4 (C-11), 123.9 (C-12), 145.5 (C-13), 126.9 (C-14), 33.6 (C-15), 24.2 (C-16), 24.2 (C-17), 33.5 (C-18), 21.8 (C-19), 25.1 (C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[15]，故鑒定化合物1為8,11,14-三烯-松香烷。

化合物2：白色細(xì)針狀結(jié)晶（三氯甲烷）。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6):10.17 (1H, s, 12-OH), 7.66 (1H, s, H-14), 6.79 (1H, s, H-11), 3.18-3.10 (1H, m, H-15), 1.16 (3H, s, 20-CH3), 1.17 (3H, d,= 6.9 Hz, 16-CH3), 1.14 (3H, d,= 6.9 Hz, 17-CH3), 0.95 (3H, s, 19-CH3), 0.89 (3H, s, 18-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 37.4 (C-1), 18.4 (C-2), 40.8 (C-3), 32.7 (C-4), 49.0 (C-5), 35.4 (C-6), 196.3 (C-7), 122.5 (C-8), 155.7 (C-9), 40.4 (C-10), 109.2 (C-11), 160.0 (C-12), 132.4 (C-13), 124.9 (C-14), 26.0 (C-15), 22.1 (C-16), 22.2 (C-17), 32.2 (C-18), 21.0 (C-19), 22.9 (C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[16]，故鑒定化合物2為柳杉酚。

化合物3：無色油狀物。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 5.90 (1H, dd,= 17.4, 10.8 Hz, H-14), 5.19 (1H, d,= 17.3 Hz, H-15β), 5.04 (1H, d,= 10.7 Hz, H-15α), 4.80 (1H, s, H-17α), 4.50 (1H, s, H-17β), 2.38 (1H, m, H-7α), 1.95 (1H, td,= 12.9, 5.0 Hz, H-7β), 1.26 (3H, s, 16-CH3), 0.86 (3H, s, 19-CH3), 0.79 (3H, s, 18-CH3), 0.67 (3H, s, 20-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 39.2 (C-1), 19.5 (C-2), 42.3 (C-3), 33.8 (C-4), 55.7 (C-5), 24.6 (C-6), 38.5 (C-7), 148.8 (C-8), 57.4 (C-9), 40.0 (C-10), 17.8 (C-11), 41.5 (C-12), 73.7 (C-13), 145.4 (C-14), 111.7 (C-15), 27.8 (C-16), 106.6 (C-17), 33.7 (C-18), 21.9 (C-19), 14.6 (C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[17]，故鑒定化合物3為淚杉醇。

化合物4：白色粉末狀固體，ESI-MS/: 457 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 12.09 (1H, s, 24-COOH), 4.68 (1H, d,= 2.2 Hz, H-29β), 4.56 (1H, d,= 2.1 Hz, H-29α), 4.29 (1H, d,= 5.1 Hz, 3-OH), 3.16 (1H, d,= 4.9 Hz, H-3α), 1.64 (3H, s, 30-CH3), 0.92 (3H, s, 28-CH3), 0.86 (6H, s, 26-CH3, 27-CH3), 0.76 (3H, s, 25-CH3), 0.64 (3H, s, 23-CH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 38.6 (C-1), 27.2 (C-2), 76.8 (C-3), 55.5 (C-4), 54.9 (C-5), 20.5 (C-6), 34.0 (C-7), 40.3 (C-8), 50.0 (C-9), 37.6 (C-10), 18.0 (C-11), 25.1 (C-12), 38.3 (C-13), 42.1 (C-14), 30.1 (C-15), 31.8 (C-16), 48.6 (C-17), 46.7 (C-18), 36.8 (C-19), 29.3 (C-20), 48.7 (C-21), 150.4 (C-22), 15.9 (C-23), 177.3 (C-24), 16.0 (C-25), 15.8 (C-26), 14.4 (C-27), 19.0 (C-28), 109.7 (C-29), 28.2 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[18]，故鑒定化合物4為狗脊蕨酸。

化合物5：白色針狀結(jié)晶（醋酸乙酯），ESI-MS/: 457 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 12.10 (1H, s), 4.68 (1H, brs, H-29α), 4.55 (1H, brs, H-29β), 3.45 (1H, brs, H-3), 4.32 (1H, d,= 5.1 Hz, 3-OH), 3.00～2.90 (1H, m, H-19), 1.63 (3H, s, 30-CH3), 0.92 ( 3H, s, 27-CH3), 0.86 (3H, s, 26-CH3), 0.85 (3H, s, 24-CH3), 0.75 (3H, s, 25-CH3), 0.64 (3H, s, 23-CH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 38.6 (C-1), 27.3 (C-2), 76.9 (C-3), 38.4 (C-4), 55.0 (C-5), 18.1 (C-6), 34.0 (C-7), 40.4 (C-8), 50.1 (C-9), 36.5 (C-10), 20.6 (C-11), 25.2 (C-12), 37.7 (C-13), 42.1 (C-14), 30.2 (C-15), 31.8 (C-16), 55.5 (C-17), 48.7 (C-18), 46.8 (C-19), 150.5 (C-20), 29.3 (C-21), 36.8 (C-22), 28.2 (C-23), 15.8 (C-24), 15.9 (C-25), 16.1 (C-26), 14.5 (C-27), 177.4 (C-28), 109.8 (C-29), 19.0 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[19]，故鑒定化合物5為白樺脂酸。

化合物6：白色固體粉末，ESI-MS/: 443 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 4.66 (1H, d,= 2.4 Hz, H-29α), 4.53 (1H, dd,= 2.3, 1.3 Hz, H-29β), 3.88 (1H, d,=10.2 Hz, H-28), 3.37 (1H, d,= 10.2 Hz, H-28β), 3.20 (1H, dd,= 10.7, 5.3 Hz, H-3), 2.38 (1H, td,= 10.7, 6.0 Hz, H-19), 1.63 (3H, s, 30-CH3), 0.97 (3H, s, 27-CH3), 0.92 (3H, s, 26-CH3), 0.87 (3H, s, 23-CH3), 0.76 (3H, s, 24-CH3), 0.65 (3H, s, 25-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6):38.2 (C-1), 27.2 (C-2), 78.8 (C-3), 38.5 (C-4), 54.9 (C-5), 18.0 (C-6), 33.8 (C-7), 40.5 (C-8), 49.9 (C-9), 36.9 (C-10), 20.4 (C-11), 24.8 (C-12), 36.8 (C-13), 42.2 (C-14), 26.7 (C-15), 29.0 (C-16), 47.6 (C-17), 47.6 (C-18), 48.6 (C-19), 150.4 (C-20), 29.3 (C-21), 33.8 (C-22), 28.1 (C-23), 15.7 (C-24), 15.8 (C-25), 15.9 (C-26), 14.5 (C-27), 60.2 (C-28), 109.6 (C-29), 18.8 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[20]，故鑒定化合物6為白樺脂醇。

化合物7：白色粉末，ESI-MS/: 455 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 11.96 (1H, s, 28-COOH), 4.70 (1H, s, H-29α), 4.56 (1H, s, H-29β), 2.95 (1H, td,= 10.8, 5.3 Hz, H-19), 1.66 (3H, s, 30-CH3), 0.99 (3H, s, 23-CH3), 0.96 (3H, s, 24-CH3), 0.93 (3H, s, 27-CH3), 0.92 (3H, s, 25-CH3), 0.85 (3H, s, 26-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 40.1 (C-1), 33.5 (C-2), 216.4 (C-3), 46.5 (C-4), 53.8 (C-5), 19.1 (C-6), 33.0 (C-7), 40.1 (C-8), 49.0 (C-9), 36.3 (C-10), 21.0 (C-11), 25.1 (C-12), 38.8 (C-13), 42.0 (C-14), 30.1 (C-15), 31.6 (C-16), 55.4 (C-17), 48.5 (C-18), 46.4 (C-19), 150.2 (C-20), 29.1 (C-21), 37.7 (C-22), 26.4 (C-23), 20.6 (C-24), 15.6 (C-25), 15.4 (C-26), 14.2 (C-27), 177.2 (C-28), 109.5 (C-29), 18.9 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[21]，故鑒定化合物7為樺木酮酸。

化合物8：白色無定形粉末，ESI-MS/: 457 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 12.04 (1H, brs, 28-COOH ), 5.16 (1H, t,= 3.4 Hz, H-12), 4.30 (1H, d,= 5.2 Hz, 3-OH), 3.16 (1H, m, H-3), 2.73 (1H, dd,= 13.6, 4.1 Hz, H-9), 1.09 (3H, s, 27-CH3), 0.89 (3H, s, 26-CH3), 0.87 (6H, s, 23-CH3, 24-CH3), 0.85 (3H, s, 25-CH3), 0.71 (3H, s, 29-CH3), 0.67 (3H, s, 30-CH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 38.9 (C-1), 27.0 (C-2), 76.8 (C-3), 38.1 (C-4), 54.8 (C-5), 18.0 (C-6), 32.1 (C-7), 38.4 (C-8), 47.1 (C-9), 36.6 (C-10), 22.6 (C-11), 121.6 (C-12), 143.9 (C-13), 41.3 (C-14), 27.2 (C-15), 22.9 (C-16), 45.7 (C-17), 40.8 (C-18), 45.5 (C-19), 30.4 (C-20), 33.3 (C-21), 32.4 (C-22), 28.3 (C-23), 16.1 (C-24), 15.1 (C-25), 16.9 (C-26), 25.6 (C-27), 178.6 (C-28), 32.9 (C-29), 23.4 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[22]，故鑒定化合物8為齊墩果酸。

化合物9：白色無定形粉末，ESI-MS/: 457 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.04 (1H, brs, 28-COOH ), 5.25 (1H, brs, H-12), 4.26 (1H, brs, 3-OH), 3.38 (1H, s, H-3), 1.19 (3H, s, 27-CH3), 1.09 (3H, s, 23-CH3), 0.98 (6H, s, 29-CH3, 30-CH3), 0.71 (3H, s, 25-CH3), 0.85 (3H, s, 26-CH3), 0.95 (3H, s, 24-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 36.4 (C-1), 24.9 (C-2), 75.8 (C-3), 37.4 (C-4), 48.6 (C-5), 18.0 (C-6), 32.4 (C-7), 38.9 (C-8), 47.1 (C-9), 36.9 (C-10), 22.6 (C-11), 122.3 (C-12), 143.9 (C-13), 41.3 (C-14), 27.3 (C-15), 23.4 (C-16), 46.1 (C-17), 40.8 (C-18), 45.5 (C-19), 30.4 (C-20), 32.4 (C-21), 30.1 (C-22), 28.3 (C-23), 15.1 (C-24), 15.1 (C-25), 16.9 (C-26), 25.8 (C-27), 184.6 (C-28), 32.9 (C-29), 23.3 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[23]，故鑒定化合物9為3-表齊墩果酸。

化合物10：白色無定形粉末，ESI-MS/: 473 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.02 (1H, brs, 28-COOH), 5.16 (1H, t,= 3.5 Hz, H-12), 4.39 (1H, s, 3-OH), 4.16 (1H, s, 23-OH), 3.43 (1H, dd,= 10.4, 3.7 Hz, H-23), 3.07 (1H, d,= 10.4 Hz, H-3), 2.73 (1H, dd,= 13.7, 4.1 Hz, H-18), 1.91 (1H, td,= 13.4, 3.7 Hz, H-19), 1.09 ( 3H, s, 27-CH3), 0.87 (9H, s, 25, 29, 30-CH3), 0.71 (3H, s, 24-CH3), 0.53 (3H, s, 26-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 37.9 (C-1), 26.6 (C-2), 70.3 (C-3), 41.4 (C-4), 47.1 (C-5), 17.5 (C-6), 32.1 (C-7), 38.8 (C-8), 46.4 (C-9), 36.3 (C-10), 22.6 (C-11), 121.6 (C-12), 143.9 (C-13), 41.9 (C-14), 27.2 (C-15), 22.9 (C-16), 45.5 (C-17), 40.8 (C-18), 45.7 (C-19), 30.4 (C-20), 33.3 (C-21), 32.0 (C-22), 64.4 (C-23), 12.7 (C-24), 15.5 (C-25), 16.9 (C-26), 25.7 (C-27), 178.6 (C-28), 32.9 (C-29), 23.4 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[24]，故鑒定化合物10為23-羥基齊墩果酸。

化合物11：白色無定形粉末，ESI-MS/: 473 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6):12.01 (1H, s, 28-COOH), 5.16 (1H, t,= 3.5 Hz, H-12), 4.40 (1H, t,= 5.1 Hz, 3-OH), 4.16 (1H, d,= 4.9 Hz, 23-OH), 3.45～3.40 (1H, m, H-23α), 3.37～3.30 (1H, m, H-23β), 3.07 (1H, dd,= 10.5, 4.8 Hz, H-3 ), 2.73 (1H, dd,= 13.7, 3.8 Hz, H-18), 1.90 (1H, td,= 4.0, 14.5 Hz, H-19), 1.09 (3H, s, 27-CH3), 0.87 (9H, s, 29, 30, 25-CH3), 0.71 (3H, s, 26-CH3), 0.53 (3H, s, 24-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 37.9 (C-1), 26.6 (C-2), 70.3 (C-3), 41.4 (C-4), 47.1 (C-5), 17.5 (C-6), 32.1 (C-7), 38.8 (C-8), 46.4 (C-9), 36.3 (C-10), 22.6 (C-11), 121.6 (C-12), 143.9 (C-13), 41.9 (C-14), 27.2 (C-15), 22.9 (C-16), 45.5 (C-17), 40.8 (C-18), 45.7 (C-19), 30.4 (C-20), 33.3 (C-21), 32.0 (C-22), 64.4 (C-23), 12.7 (C-24), 15.5 (C-25), 16.9 (C-26), 25.7 (C-27), 178.6 (C-28), 32.8 (C-29), 23.4 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[25]，故鑒定化合物11為常春藤皂苷元。

化合物12：白色無定形粉末，ESI-MS/: 473 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 11.94 (1H, s, 28-COOH), 5.19 (1H, brs, H-12), 3.40 (1H, m, H-3), 3.24 (1H, dd,= 10.5, 4.4 Hz, H-24α), 3.05 (1H, dd,= 10.6, 4.3 Hz, H-24β), 1.23 (3H, s, 26-CH3), 1.05 (3H, s, 23-CH3), 0.98 (3H, s, 25-CH3), 0.91 (3H, s, 27-CH3), 0.88 (3H, s, 29-CH3), 0.72 (3H, s, 30-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 33.3 (C-1), 26.6 (C-2), 70.5 (C-3), 42.6 (C-4), 47.4 (C-5), 17.7 (C-6), 31.8 (C-7), 38.0 (C-8), 47.1 (C-9), 35.8 (C-10), 22.8 (C-11), 121.8 (C-12), 143.1 (C-13), 41.7 (C-14), 27.1 (C-15), 22.6 (C-16), 45.4 (C-17), 40.8 (C-18), 45.7 (C-19), 30.3 (C-20), 32.8 (C-21), 32.1 (C-22), 22.6 (C-23), 66.0 (C-24), 13.7 (C-25), 16.7 (C-26), 25.6 (C-27), 178.5 (C-28), 32.1 (C-29), 23.3 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[26]，故鑒定化合物12為3α,24-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸。

化合物13：白色無定形粉末，ESI-MS/: 489 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-6): 5.12 (1H, t,= 3.3 Hz, H-12), 3.71 (1H, brd,= 11.6 Hz, H-2), 3.60 (1H, brs, H-3), 3.43 (1H, d,= 10.9 Hz, H-24β), 3.29 (1H, d,= 7.3 Hz, H-24α), 2.09 (1H, d,= 11.3 Hz, H-18), 1.02 (3H, s, 23-CH3), 0.93 (3H, s, 27-CH3), 0.90 (3H, s, 26-CH3), 0.85 (3H, d,= 4.4 Hz, 30-CH3), 0.80 (3H, d,= 6.4 Hz, 29-CH3), 0.69 (3H, s, 25-CH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 42.0 (C-1), 65.0 (C-2), 72.9 (C-3), 42.1 (C-4), 48.9 (C-5), 18.2 (C-6), 33.4 (C-7), 38.8 (C-8), 47.1 (C-9), 37.8 (C-10), 23.4 (C-11), 124.8 (C-12), 138.5 (C-13), 44.1 (C-14), 27.7 (C-15), 24.1 (C-16), 47.3 (C-17), 52.7 (C-18), 37.9 (C-19), 38.8 (C-20), 30.5 (C-21), 36.6 (C-22), 23.2 (C-23), 64.1 (C-24), 16.9 (C-25), 17.1 (C-26), 23.6 (C-27), 178.7 (C-28), 17.3 (C-29), 21.3 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[27]，故鑒定化合物13為2α,3α,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸。

化合物14：無色細(xì)針狀結(jié)晶（三氯甲烷），ESI-MS/: 457 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 11.96 (1H, s, 28-COOH), 5.12 (1H, brs, H-12), 4.31 (1H, d,= 4.0 Hz, 3-OH), 3.00 (1H, m, H-3), 2.10 (1H, d,= 11.3 Hz, H-18), 1.03 (3H, s, 23-CH3), 0.91 (3H, d,= 6.7 Hz, 29-CH3), 0.89 (3H, s, 27-CH3), 0.86 (3H, s, 26-CH3), 0.81 (3H, d,= 6.4 Hz, 30-CH3), 0.74 (3H, s, 24-CH3), 0.67 (3H, s, 25-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 38.4 (C-1), 27.0 (C-2), 76.9 (C-3), 38.5 (C-4), 54.8 (C-5), 18.1 (C-6), 32.8 (C-7), 41.7 (C-8), 46.9 (C-9), 36.4 (C-10), 22.9 (C-11), 124.6 (C-12), 138.2 (C-13), 41.7 (C-14), 23.3 (C-15), 23.9 (C-16), 46.9 (C-17), 52.4 (C-18), 38.3 (C-19), 38.3 (C-20), 30.2 (C-21), 36.6 (C-22), 28.3(C-23), 15.3 (C-24), 16.1 (C-25), 17.1 (C-26), 23.3 (C-27), 178.3 (C-28), 16.9 (C-29), 21.1 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[28]，故鑒定化合物14為熊果酸。

化合物15：白色針狀結(jié)晶（三氯甲烷），ESI-MS/: 427 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 5.13 (1H, t,= 3.5 Hz, H-12), 3.22 (1H, dd,= 10.8, 5.1 Hz, H-3), 1.11 (3H, s, 27-CH3), 1.05 (3H, s, 26-CH3), 0.97 (3H, s, 23-CH3), 0.93 (3H, s, 25-CH3), 0.91 (3H, d,= 4.6 Hz, 30-CH3), 0.81 (3H, s, 28-CH3), 0.78 (3H, d,= 7.7 Hz, 29-CH3), 0.69 (3H, s, 24-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 38.4 (C-1), 26.9 (C-2), 78.6 (C-3), 38.3 (C-4), 54.7 (C-5), 17.9 (C-6), 32.4 (C-7), 40.1 (C-8), 47.1 (C-9), 36.4 (C-10), 23.0 (C-11), 124.0 (C-12), 139.1 (C-13), 41.6 (C-14), 28.4 (C-15), 26.1 (C-16), 33.3 (C-17), 58.4 (C-18), 39.0 (C-19), 39.0 (C-20), 30.6 (C-21), 40.9 (C-22), 28.1 (C-23), 15.3 (C-24), 15.9 (C-25), 16.5 (C-26), 22.9 (C-27), 27.5 (C-28), 21.1 (C-29), 17.2 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[29]，故鑒定化合物15為α-香樹脂醇。

3.2 藥理活性篩選結(jié)果

3.2.1 抗炎活性篩選結(jié)果 Griess法考察化合物4～5、7～14對LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO生成抑制活性結(jié)果見表1，其中，化合物8、14對NO生成抑制率超過60%，但存在一定的細(xì)胞毒性。

3.2.2 抗腫瘤活性篩選結(jié)果 MTT法考察化合物對腫瘤細(xì)胞抑制活性測定結(jié)果見表2。其中，化合物8、13對人膀胱癌EJ細(xì)胞的IC50值分別為（24.32±1.60）、（44.23±0.82）μmol/L；化合物8、11對ECA-109細(xì)胞的IC50值分別為（50.25±3.09）、（62.59±3.20）μmol/L；化合物8對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的IC50值為（25.13±7.07）μmol/L。

表1 樣品對NO生成抑制率

Table 1 Inhibition rate of NO production by samples

化合物NO生成抑制率/% 426.27±2.04（有細(xì)胞毒性） 524.81±0.76（有細(xì)胞毒性） 749.55±2.16（有細(xì)胞毒性） 863.10±0.64（有細(xì)胞毒性） 923.98±0.70 1039.95±1.65 1146.25±1.71 1222.07±3.11 1326.78±1.27 1464.19±0.70（有細(xì)胞毒性）

表2 抗腫瘤篩選結(jié)果()

Table 2 Anti-tumor screening results()

化合物IC50/(μmol·L?1)EJECA-109PANC-1 4 96.37±0.87 119.10±1.89112.30±1.37 5 1 036.00±0.59 533.70±0.88148.40±0.72 7 218.00±1.243 842.00±0.49449.60±1.27 8 24.32±1.60 50.25±3.09 25.13±7.07 913 942.00±0.27 476.80±0.52199.90±0.57 10 93.95±1.26 94.35±1.24 83.36±3.46 11 68.30±7.45 62.59±3.20 70.78±7.62 12 838.70±1.68174.70±1.37109.50±6.42 13 44.23±0.82111.80±1.84272.50±1.16 14 1 063.00±3.03 86.49±24.91307.90±1.75 順鉑 55.69±0.38 37.88±1.24 45.25±1.36

結(jié)果表明，化合物8、14具有較強的抗炎活性，其表現(xiàn)較其他三萜類化合物更好；但存在一定的細(xì)胞毒性?；衔?、11、13對EJ細(xì)胞、化合物8、11、14對ECA-109細(xì)胞具有一定的抑制作用；化合物8、10、11對PANC-1細(xì)胞增殖抑制活性作用較好。

4 討論

本實驗研究了紅根草的化學(xué)成分，共分離鑒定了脫氫松香烷、柳杉酚、淚杉醇等15個化合物，多數(shù)為五環(huán)三萜類化合物，其母核結(jié)構(gòu)類型有齊墩果烷型、烏蘇烷型和羽扇豆烷型。五環(huán)三萜類化合物在植物次級代謝產(chǎn)物中較為常見，其種類較多，資源豐富，具有較廣的生物活性，如抗炎、抗腫瘤等。前人開展了齊墩果酸[30]、熊果酸[31]藥理作用研究，與本課題組抗炎藥理研究結(jié)果比較，均表明齊墩果酸（8）、熊果酸（14）具有較強的抗炎活性，顯示紅根草發(fā)揮抑菌抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能為齊墩果酸、熊果酸等三萜類成分。研究中分離得到的化合物中，脫氫松香烷、淚杉醇、狗脊蕨酸、白樺脂酸的量較大，有待分別深入開展體外和體內(nèi)藥效活性研究，為建立譜效相關(guān)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。本研究豐富了紅根草的化學(xué)成分及其化合物藥理活性研究，為這一民族藥材資源的可持續(xù)開發(fā)提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草 [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999: 652.

[2] 廣西實用中草藥新選編輯部. 廣西實用中草藥新選 [M]. 廣西: 廣西人民出版社, 1969: 212.

[3] 廣西壯族自治區(qū)革命委員會衛(wèi)生局. 廣西本草選編 [M]. 南寧: 廣西人民出版社, 1974.

[4] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品管理局. 廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (第二卷) [M]. 南寧: 廣西科學(xué)技術(shù)出版社, 2011: 141.

[5] 朱傳義, 徐寶林, 張衛(wèi), 等. 紅根草抗凝血作用研究 [J]. 現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 1987, 4(2): 11-12.

[6] 呂強, 許國祥. 紅根草抗結(jié)核有效成分的初步研究 [J]. 中國藥學(xué)雜志, 1980, 15(9): 44.

[7] 樂秀芳, 韓家嫻, 沈祖銘, 等. 紅根草鄰醌的體內(nèi)外抗癌作用研究 [J]. 腫瘤, 1992, 12(2): 49-50.

[8] 蔣永俊. 兩種鼠尾草屬植物的化學(xué)成分研究 [D]. 昆明: 昆明理工大學(xué), 2015.

[9] 張金生, 黃勇. 紅根草中的新二萜: 紅根草酮內(nèi)酯和新紅根草酮 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 1995, 7(4): 1-4.

[10] 霍華珍, 陳紹農(nóng), Guido F P, 等. 紅根草三萜類化學(xué)成分的研究 [J]. 廣西植物, 2019, 39(4): 516-522.

[11] 羅婕, 張藝. 中華民族共同體視野下的民族醫(yī)藥傳承創(chuàng)新[J]. 世界中醫(yī)藥, 2021, 16(15): 2211-2216.

[12] 鐘小清, 盧志標(biāo), 唐倩, 等. 壯藥紅根草的基原調(diào)查和生藥學(xué)研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(4): 1151-1155.

[13] 宗明月. 芫花根中倍半萜類成分的抗炎活性及機制研究 [D]. 煙臺: 煙臺大學(xué), 2021.

[14] 馬燕春, 張旻, 徐文彤, 等. 裸花紫珠化學(xué)成分及細(xì)胞毒活性研究 [J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(16): 3094-3101.

[15] Kutney J P, Han K. Studies with plant-cell cultures of the Chinese herbal plant,. Isolation and characterization of diterpenes [J]., 1996, 115(1): 77-93.

[16] Li W H, Chang S T, Chang S C,. Isolation of antibacterial diterpenoids frombark [J]., 2008, 22(12): 1085-1093.

[17] Jang H J, Yang K S. Inhibition of nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages by diterpenoids from[J]., 2011, 34(6): 913-917.

[18] 何際嬋, 韋松, 蘭樹彬, 等. 黃杞莖皮化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2006, 37(12): 1788-1789.

[19] 盧旭然, 劉爍, 王滿元, 等. 五指那藤三萜類化學(xué)成分研究 [J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(23): 4629-4636.

[20] 趙明, 趙英楠, 李軍, 等. 白樺樹皮化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(16): 4117-4123.

[21] 伊哲, 張琦, 黎思露, 等. 引種亞麻葉白千層三萜類化學(xué)成分研究 [J]. 中南藥學(xué), 2020, 18(12): 1982-1985.

[22] 宣偉東, 陳海生, 袁志仙, 等. 中藥膽木的化學(xué)成分 [J]. 中國天然藥物, 2005, 3(3): 181-183.

[23] Chen W H, Chen G Y, Wang J,. Chemical constituents of[J]., 2015, 51(4): 797-799.

[24] 張援虎, 陳東林, 王鋒鵬. 峨眉杠柳化學(xué)成分的研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(5): 772-774.

[25] 羅建光, 張潔, 孔令義. 絲石竹三萜成分的研究 [J]. 中國中藥雜志, 2006, 31(19): 1640-1641.

[26] Wang K W, Zhang X, Zhang H J,. Cytotoxic triterpenes from[J]., 2020, 56(1): 161-163.

[27] Sun X R, Luo H W, Sakai T,. Pentacyclic triterpenes from[J]., 1992, 46: 202-205.

[28] 張旋, 侴桂新. 黃花敗醬化學(xué)成分研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2020, 32(5): 783-791.

[29] 莫青胡, 周先麗, 周云, 等. 桃金娘葉的化學(xué)成分研究 [J]. 中藥材, 2020, 43(3): 587-590.

[30] 戴岳, 杭秉茜, 譚立武. 齊墩果酸的抗炎作用 [J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 1989, 3(2): 96-99.

[31] 王立為, 劉新民, 余世春, 等. 枇杷葉抗炎和止咳作用研究 [J]. 中草藥, 2004, 35(2): 174-176.

Chemical compositions and biological activities of Zhuang medicine

CHEN Xing-guang1, 2, HUANG Yuan-yuan1, MIN Jian-guo2, YUAN Jing-quan1, ZHOU Yan-lin2

1. Chinese Medicine Experimental Center, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guilin Sanjin Pharmaceutical Co., Ltd., Guilin 541004, China

To study the chemical composition of, and screen its anti-inflammatory and anti-tumor activities.Normal phase silica gel, reversed-phase silica gel, Sephadex LH-20, preparative liquid chromatography were used for separation and purification of the chemical composition from, and the structures of the isolated compounds were identified by NMR and MS. The methods of Griess and MTT were used to conduct preliminary anti-inflammatory activity screening and anti-tumor activity research on some of the isolated triterpenoids from.A total of 15 compounds were isolated from the 50% ethanol extracts of, their structures were determined as abieta-8,11,13-trien (1), sugiol (2), manoo1 (3), woodwardic acid (4), betulinic acid (5), betulin (6), betulonic acid (7), oleanic acid (8), 3-epioleanolic acid (9), 23-hydroxy-oleanolic acid (10), hederagenin (11), 3α,24-dihydroxy-12-en-28-oleanolic acid (12), 2α,3α,24-trihydroxy-12-en- 28-ursic acid (13), ursolic acid (14) and α-amyrin (15). The inhibition rate of compounds 8 and 14 on NO production reached more than 60%, the IC50of compounds 8 and 13 on human bladder cancer cells (EJ) were (24.32 ± 1.60) μmol/L and (44.23 ± 0.82) μmol/L, respectively; the IC50value of compound 8 on human pancreatic cancer cells (PANC-1) was (25.13 ± 7.07) μmol/L.Compounds 4, 7, 10, 14, 15 are isolated fromfor the first time. Compounds 8 and 14 have better anti-inflammatory activity. Compounds 8, 11, 13 have a strong inhibitory effect on human bladder cancer cells (EJ); Compound 8, 10, 11 have an inhibitory effect on human pancreatic cancer cells (PANC-1).

Hance; triterpenes; anti-inflammation; antitumor; woodwardic acid; betulonic acid; oleanic acid; 2α,3α,24- trihydroxy-12-en-28-ursic acid; ursolic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)17 - 5276 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.003

2022-01-26

廣西中醫(yī)藥大學(xué)博士科研啟動項目（2018BS048）

陳興廣（1993—），男，碩士研究生，研究方向為中藥活性成分及新產(chǎn)品研究。E-mail: 2970797317@qq.com

袁經(jīng)權(quán)，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥及天然藥物研究與開發(fā)。E-mail: yjqgx@163.com

閔建國，碩士，工程師，研究方向為中藥新藥研發(fā)。E-mail:67493023@qq.com

[責(zé)任編輯 王文倩]