陳耿仟,吳國平,洪麗明,林 潤
心血管疾病,如心力衰竭、冠心病和急性心肌梗死等與心肌結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)密切相關(guān),嚴重威脅人類生命安全[1]。溶栓、冠狀動脈介入是治療心血管疾病的有效手段,可使病人受到不同程度的心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[2]。因此,開發(fā)新策略預(yù)防I/R損傷對改善心血管疾病具有重要的臨床意義[3]。miR-19a在糖尿病誘導(dǎo)的心肌組織中過表達,可能參與糖尿病心肌損傷過程。Liu等[4]研究顯示,激活細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(SOCS3)可抑制蛋白質(zhì)酪氨酸激酶-1(JAK1)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(STAT3)磷酸化水平,抑制SOCS3表達可抑制肝癌細胞自噬。有研究顯示,I/R導(dǎo)致心肌細胞過度自噬,抑制I/R誘導(dǎo)的心肌細胞自噬,進而保護心臟功能[5]。miR-19能否參與調(diào)控缺氧(hypoxia,H)和復(fù)氧(reoxygenation,R)誘導(dǎo)的心肌細胞自噬過程及其與SOCS3/JAK1/STAT3通路的關(guān)系尚未明確。本研究在體外模擬H/R模型[6],探討miR-19a過表達對H/R誘導(dǎo)下心肌細胞增殖、凋亡及自噬變化情況,并分析潛在的作用機制,為預(yù)防心肌細胞I/R損傷提供新思路。
1.1 實驗材料與儀器
1.1.1 實驗材料 大鼠心肌細胞H9c2(GNR5)購自中國科學院細胞庫;DMEM高糖(11995)/無糖(90113)培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清(11011-8611)、胰蛋白酶消化液(0.25%)(T1350)、雙抗(青鏈霉素混合液)(P1400)、Matrigel基底膠(M8370)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(T2210-200T)、電化學發(fā)光(ECL)液(PE0010)購自北京Solarbio公司;miR-19a模擬(mimics)、miR-19a陰性對照(negative control,NC)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M)、RIPA裂解液(P0013B)、Trizol試劑盒(R0016)、細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)(C0037)上海碧云天生物技術(shù)有限公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(11668019)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate Dehydrogenase,GAPDH)兔抗人多克隆抗體(PA1-16777)、SOCS3兔抗人多克隆抗體(PA5-87485)、Beclin-1兔抗人多克隆抗體(PA5-96649)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein light chain 3 Ⅱ/Ⅰ,LC3Ⅱ/Ⅰ)兔抗人多克隆抗體(PA5-109226)、核孔蛋白(nucleoporin 62,p62)兔抗人多克隆抗體(PA5-27247)、JAK1兔抗人多克隆抗體(PA5-105265)、JAK1磷酸化(p-JAK1)兔抗人多克隆抗體(44-4222G)、STAT3兔抗人多克隆抗體(710077)、STAT3磷酸化(p-STAT3)兔抗人多克隆抗體(44380G)、山羊抗兔IgG(H+L)二級抗體(A32731)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。
1.1.2 實驗儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(BBD6220)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;低氧工作站(DY-S)購自黑龍江邁沃德工貿(mào)有限公司;聚合酶鏈式反應(yīng)儀(T100)購自美國Bio-Rad公司;酶標儀(ST-360)購自上海科華生物工程股份有限公司;倒置顯微鏡購自(MA100N)購自日本Nikon;流式細胞儀(ZS-AE7S)購自中生(蘇州)醫(yī)療科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 心肌細胞培養(yǎng) 將H9c2心肌細胞用含10%胎牛血清(v/v)、1%雙抗(v/v)、89%高糖DMEM培養(yǎng)基(v/v)的培養(yǎng)瓶培養(yǎng),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱,每日更換1次新鮮培養(yǎng)液。細胞融合度>80%時進行傳代并保種,胰酶消化收集3~5代細胞用于后續(xù)實驗。
1.2.2 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)期生長的H9c2心肌細胞接種于6孔板(5×105個/孔),待細胞完全貼壁后,隨機分為3組:H/R組、H/R-miR-19a mimics組和H/R-miR-19a陰性對照(NC)組。H/R-miR-19a模擬(mimics)組、H/R-miR-19a NC組分別使用無血清的培養(yǎng)基稀釋miR-19a mimics儲存液、miR-19a NC儲存液及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染液處理6 h,更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h,H/R組不進行轉(zhuǎn)染處理,收集各組細胞用于后續(xù)實驗。
1.2.3 H/R模型建立 按1.2.2步驟收集的各組細胞參照文獻[6],換用等量低糖無血清DMEM培養(yǎng)基(已用CO2和N2充分飽和3 h),孵育2 h(37 ℃),置于低氧培養(yǎng)箱(37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2)中培養(yǎng)10 h,胰酶消化處理,收集各組細胞,加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,置于常氧培養(yǎng)箱(37 ℃、95%空氣、5%CO2)中復(fù)氧2 h。另按1.2.1收集的細胞,接種于6孔板上(5×105個/孔),常規(guī)培養(yǎng),設(shè)置為Control組。收集各組細胞用于后續(xù)實驗。
1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR) 使用Trizol試劑盒分別提取按1.2.3步驟收集的各組H9c2心肌細胞總RNA,取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)處理1 min,95 ℃ 15 s,70 ℃ 30 s,擴增40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參,應(yīng)用2-△△Ct法計算miR-19a基因相對表達量。miR-19a及U6引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成,引物序列見表1。
表1 miR-19a和參考U6引物序列(5′-3′)
1.2.5 CCK-8實驗 將1.2.3收集的各組細胞分別重懸,接種于96孔細胞板(4.5×104個/孔)上,每組設(shè)置6個復(fù)孔,待細胞完全貼壁后,每孔添加100 μL CCK-8,避光孵育2.5 h,酶標儀檢測450 nm波長下各孔OD值,計算各組細胞生存率,取平均值。細胞生存率(%)=各實驗組OD值/各空白Control組OD值×100%。
1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 胰酶(不含EDTA)消化收集1.2.3各組細胞,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次,離心(1 000 r/min,5 min),Binding Buffer重懸(500 μL),依次添加10 μL Annexin V-FITC和PI,充分混勻,常溫避光靜置15 min,流式細胞儀檢測凋亡率。凋亡率(%)=凋亡早期細胞比例+凋亡晚期細胞比例。
1.2.7 蛋白免疫印跡法 收集1.2.3各組細胞,PBS清洗3次,每孔加入200 μL預(yù)冷的RIPA裂解液,提取各組總蛋白。加入等量蛋白樣品電泳,轉(zhuǎn)膜,PBS清洗,在37 ℃下用5%脫脂牛奶封閉4 h,加入一抗LC3Ⅱ/Ⅰ(1∶500)、p62、Beclin-1、SOCS3、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000),搖床孵化過夜,洗膜,添加二抗(1∶10 000),室溫孵化2 h,洗膜,根據(jù)ECL說明書進行顯色曝光,凝膠成像儀成像。分析目標蛋白與GAPDH內(nèi)參條帶比值。
2.1 各組H9c2心肌細胞中miR-19a表達比較 與Control組比較,H/R組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平降低(P<0.05);與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平顯著升高(P<0.05)。詳見表2。
表2 各組H9c2心肌細胞中miR-19a表達比較(±s,n=6)
2.2 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞存活率的影響 與Control組比較,H/R組H9c2心肌細胞存活率降低(P<0.05);與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞存活率升高(P<0.05)。詳見表3。
表3 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞存活率的影響(±s,n=6) 單位:%
2.3 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡的影響 與Control組相比,H/R組H9c2心肌細胞凋亡率升高(P<0.05);與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞凋亡率降低(P<0.05)。詳見圖1、表4。
圖1 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡的影響
表4 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡的影響(±s,n=6) 單位:%
2.4 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對各組H9c2心肌細胞自噬標記物LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p62表達的影響 與Control組比較,H/R組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ升高(P<0.05),p62蛋白表達水平降低(P<0.05);與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ降低(P<0.05),p62蛋白表達水平升高(P<0.05)。詳見圖2、表5。
圖2 各組LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1和p62蛋白表達條帶圖(A為Control組;B為H/R組;C為H/R-miR-19a NC組;D為H/R-miR-19a mimics組)
2.5 miR-19a mimics轉(zhuǎn)染對H9c2心肌細胞SOCS3、p-JAK1、p-STAT3表達的影響 與Control組比較,H/R組H9c2心肌細胞SOCS3蛋白表達水平升高(P<0.05),p-JAK1、p-STAT3水平降低(P<0.05);與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞SOCS3蛋白表達水平降低(P<0.05),p-JAK1、p-STAT3水平升高(P<0.05)。詳見圖3、表6。
圖3 各組H9c2心肌細胞SOCS3、p-JAK1、p-STAT3蛋白表達條帶圖(A為Control組;B為H/R組;C為H/R-miR-19a NC組;D為H/R-miR-19a mimics組)
心肌I/R損傷是一種病理性疾病,特征是血液供給受限,恢復(fù)灌注并伴隨供氧,最終導(dǎo)致急性心肌梗死或心力衰竭[7]。近年來,治療心肌I/R損傷手段取得重要進展,但療效需進一步提高。有研究顯示,H/R誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細胞損傷模型可一定程度模擬I/R損傷,因此,本研究選擇大鼠H9c2心肌細胞作為體外研究對象[8]。心肌I/R損傷機制尚未明確,尋找治療心肌I/R損傷的有效靶點,是減少I/R損傷的突破口。
I/R損傷可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,是導(dǎo)致I/R損傷病人生存率低的重要因素。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類單鏈非編碼RNA,研究證實,其與心肌細胞增殖、凋亡等密切相關(guān)[9]。Mao等[10]研究顯示,上調(diào)miR-19a-3p表達水平可減輕心肌肥大。Liu等[11]研究顯示,miR-19a-3p具有抑制心臟肥大和心力衰竭的能力。本研究首先構(gòu)建了miR-19a過表達體系,之后建立H/R損傷模型,與Control組比較,H/R組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平、存活率降低,凋亡率升高,提示H/R可誘導(dǎo)損傷H9c2心肌細胞,I/R損傷模型構(gòu)建成功,推測miR-19a與H/R誘導(dǎo)的心肌細胞的增殖、凋亡相關(guān)。Gao等[12]研究顯示,miR-19a模擬物可增強心肌細胞增殖,減輕心肌梗死引起的心臟損害。本研究結(jié)果顯示,與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞miR-19a表達水平、細胞存活率升高,凋亡率降低,提示過表達miR-19a可抑制H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細胞死亡及凋亡,推測miR-19a可能成為治療I/R損傷的潛在靶標。
自噬是細胞受外界刺激以維持穩(wěn)態(tài)的動態(tài)過程。I/R過程中,心肌細胞自噬發(fā)揮著損傷作用。Beclin-1是細胞自噬過程的必需蛋白質(zhì),可促進自噬體形成[13]。LC3Ⅱ與溶酶體膜結(jié)合誘導(dǎo)細胞自噬,可作為自噬小體標記物之一,p62可用于測定自噬通量,其表達水平與自噬活性成反比[14]。本研究結(jié)果顯示,與Control組比較,H/R組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ升高,p62蛋白表達水平降低,提示H/R誘導(dǎo)增強了心肌細胞自噬;與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3Ⅱ/Ⅰ降低,p62蛋白表達水平升高,提示miR-19a過表達可減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞自噬,推測miR-19a可能通過抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞自噬,發(fā)揮心肌保護作用。
Li等[15]研究顯示,miR-19a在系統(tǒng)性幼年關(guān)節(jié)炎病人中低表達,且能激活SOCS3/JAK/STAT信號通路。本研究結(jié)果顯示,與H/R組和H/R-miR-19a NC組比較,H/R-miR-19a mimics組H9c2心肌細胞SOCS3蛋白表達水平降低,p-JAK1及p-STAT3水平升高,提示過表達miR-19a可抑制SOCS3表達,促進p-JAK1及p-STAT3表達。Liu等[4]研究顯示,抑制/促進SOCS3表達,可抑制肝癌細胞/促進乳腺癌細胞自噬的形成。因此推測,過表達miR-19a可能通過抑制SOCS3表達,促進p-JAK1/p-STAT3水平,抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞自噬。
綜上所述,過表達miR-19a可能通過抑制SOCS3表達,激活JAK1/STAT3信號通路,抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞自噬,從而減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷,為臨床制定治療I/R心肌損傷的新策略提供了參考。臨床導(dǎo)致I/R心肌損傷的因素復(fù)雜且具有不可控性,僅憑體外模擬實驗證據(jù)尚不充分,今后將聯(lián)合體內(nèi)小鼠模型和臨床試驗,深入探討miR-19a對I/R心肌損傷的影響及作用機制。