miR-148a靶向S1PR1抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制研究

唐懿 劉彥麟 宋黎

漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)屬于非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)發(fā)病率最高亞型，占NHL的30%～40%，平均發(fā)病年齡在60歲左右，男性高于女性，呈B淋巴細(xì)胞彌漫性惡性增殖[1,2]。DLBCL在臨床上、遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)均表現(xiàn)出異質(zhì)性，目前DLBCL的發(fā)病機(jī)制還未有統(tǒng)一定論，最新研究表明miRNAs表達(dá)水平與其發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有關(guān)，近年來(lái)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)內(nèi)容[3]。人微小RNA(microRNA，miRNA)長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸序列，能夠與靶基因3’UTR配對(duì)，降解或抑制靶基因mRNA翻譯，從而調(diào)控腫瘤如細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生理過(guò)程[4]。miRNAs在腫瘤中表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象也十分常見(jiàn)。有研究表明，miR-148a低表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，上調(diào)miR-148a表達(dá)水平能夠下調(diào)c-myc表達(dá)水平，抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[5,6]。1型1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine 1-phosphate receptor1，S1PR1)屬于1-磷酸鞘氨醇受體家族的G蛋白偶聯(lián)受體，作為機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，能夠與其配體1-磷酸鞘氨醇(S1P)結(jié)合從而調(diào)控下游信號(hào)通路活性[7]。研究表明，S1PR1能夠調(diào)控BATF3信號(hào)通路來(lái)抑制霍奇金淋巴瘤(HL)細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)S1PR1作為一種癌基因，能夠上調(diào)許多信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[8,9]。miR-148a和S1PR1均與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系，且在DLBCL中未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究測(cè)定miR-148a mimic轉(zhuǎn)染后OCI-LY19細(xì)胞miR-148a、S1PR1及相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平，分析二者對(duì)OCI-LY19細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；總RNA提取試劑盒(DP420)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；兔抗人S1PR1、兔抗人ERK、兔抗人p-ERK、兔抗人STAT3、兔抗人p-STAT3、兔抗人PDGF-A、兔抗人PDGF-B、兔抗人BcL-XL、兔抗人McL-1、兔抗人內(nèi)參U6、羊兔二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；miR-148a mimic、miR-148a陰性對(duì)照序列購(gòu)自上海生工生物公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 細(xì)胞系：人B淋巴HMy2.CIR細(xì)胞、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-LY19細(xì)胞均購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)：兩種細(xì)胞均采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加1%青鏈霉素雙抗，10%血清，培養(yǎng)條件：5%CO2，相對(duì)濕度98%，溫度37℃。隔天換液，待細(xì)胞密度在80%～90%時(shí)胰酶消化傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將OCI-LY19細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到24孔板上，待細(xì)胞密度在50%左右時(shí)棄去培養(yǎng)液，首先將5 μl Lipofectamine TM2000與100 μl DMEM培養(yǎng)液混合均勻，25℃靜置20 min，用培養(yǎng)液調(diào)整miR-148a mimic、miR-148a陰性對(duì)照序列濃度為20 μmol/L，25℃靜置20 min，將miR-148a mimic、miR-148a陰性對(duì)照、等體積培養(yǎng)基(作為miR-148a空白對(duì)照)分別與LipofectamineTM2000混合均勻，25℃靜置20 min，加入到含有OCI-LY19細(xì)胞的24孔板中。實(shí)驗(yàn)分組：(1)對(duì)照組；(2)miR-148a陰性對(duì)照；(3)miR-148a mimic組。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)OCI-LY19細(xì)胞miR-148a表達(dá)水平 使用試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)miR-148a進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系共20.0 μl，其中SYBR Mix10.0 μl，cDNA(25 ng/ml)2.0 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性300 s，94℃變性30 s，65℃退火60 s，75℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，75℃終末延伸5 min。設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，采用2- CT法對(duì)miR-148a表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。見(jiàn)表1。

表1 miR-148a 和內(nèi)參U6 引物序列

1.4 蛋白印跡法(Western blotting，WB)測(cè)定OCI-LY19細(xì)胞S1PR1、ERK、p-ERK、STAT3、p-STAT3、PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)分組同“1.2”。使用RIPA法提取并測(cè)定各組細(xì)胞總蛋白含量，蛋白以50 μg/孔加樣，垂直電泳法分離所需目標(biāo)蛋白，用BIO-RAD法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉將結(jié)合位點(diǎn)封閉1 h。加入兔抗人S1PR1、兔抗人ERK、兔抗人STAT3、兔抗人p-ERK、兔抗人p-STAT3、兔抗人PDGF-A、兔抗人PDGF-B、BcL-XL、McL-1、兔抗人內(nèi)參β-Actin(稀釋比例均為1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，用PBS清洗后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育30 min，PBS清洗，顯色、曝光。用凝膠成像設(shè)備觀察。

1.5 MTT法測(cè)定OCI-LY19細(xì)胞活性 實(shí)驗(yàn)分組同“1.2”，將細(xì)胞接種到96孔板上，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，棄取培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入25 μl MTT(5 mg/ml)溶液，培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO溶液，100 r/min 37℃恒溫震蕩10 min，測(cè)定在490 nm處吸光度(optical density，OD值)。根據(jù)公式計(jì)算OCI-LY19細(xì)胞活性。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定OCI-LY19細(xì)胞體外遷移能力 實(shí)驗(yàn)分組同“1.2”，將OCI-LY19細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種到6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度70%～80%時(shí)，用滅菌后的200 μl槍頭垂直于孔底，均勻劃出細(xì)胞劃痕，PBS清洗細(xì)胞碎片，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞遷移程度，拍照記錄，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞遷移能力。遷移能力(%)=(初始兩側(cè)距離-觀察時(shí)兩側(cè)距離)/初始兩側(cè)距離×100%。

1.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-148a與S1PR1的靶標(biāo)關(guān)系

1.7.1 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)突變型載體的制備:用TargetScan分析S1PR1序列發(fā)現(xiàn)，在3’UTR區(qū)域有兩個(gè)miR-148a結(jié)合區(qū)域。將該區(qū)域擴(kuò)增后與PGEM-T載體相連，篩選目標(biāo)序列并與pGL4相連，成功構(gòu)建p-GL4-S1PR1-3’UTR質(zhì)粒，以此質(zhì)粒為模板對(duì)S1PR1-3’UTR進(jìn)行定點(diǎn)突變(Del1，Del2)，進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序篩選構(gòu)建p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1、p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del2和p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1，Del2質(zhì)粒。

1.7.2 熒光素酶測(cè)試報(bào)告實(shí)驗(yàn):將OCI-LY19細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，將p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1、p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del2和p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1，Del2質(zhì)粒與miR-148a mimic、miR-148a陰性對(duì)照共染，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24 h后，加入100 μl熒光素酶檢測(cè)試劑，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，之后加入Stop&Glo試劑并測(cè)定吸光度，熒光素酶的相對(duì)活性以前后熒光強(qiáng)度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a mimic轉(zhuǎn)染后OCI-LY19細(xì)胞中miR-148a、S1PR1、p-ERK、p-STAT3表達(dá)水平 與HMy2.CIR細(xì)胞組比較，OCI-LY19細(xì)胞對(duì)照組miR-148a表達(dá)水平顯著降低(P>0.05)，ERK、STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，S1PR1蛋白表達(dá)水平、ERK蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組、miR-148a陰性對(duì)照組比較，miR-148a mimic組miR-148a表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，ERK、STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，S1PR1蛋白表達(dá)水平、ERK蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 miR-148a 、S1PR1 、p-ERK 、p-STAT3 表達(dá)水平

圖1 S1PR1、p-ERK、p-STAT3表達(dá)水平；A HMy2.CIR細(xì)胞組；B 對(duì)照組；C miR-148a mimic組；D miR-148a陰性對(duì)照組

2.2 miR-148a mimic轉(zhuǎn)染后OCI-LY19細(xì)胞活性 與對(duì)照組比較，miR-148a mimic組細(xì)胞活性顯著降低降低(P<0.05)，miR-148a陰性對(duì)照組細(xì)胞活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miR-148a mimic 轉(zhuǎn)染后OCI-LY19 細(xì)胞活性

2.3 miR-148a mimic轉(zhuǎn)染后OCI-LY19細(xì)胞遷移能力 與對(duì)照組比較，miR-148a mimic組細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，miR-148a陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 miR-148a mimic 轉(zhuǎn)染后OCI-LY19 細(xì)胞遷移能力

2.4 miR-148a mimic轉(zhuǎn)染后OCI-LY19細(xì)胞PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，miR-148a mimic組PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-148a陰性對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表5，圖2。

表5 miR-148a mimic 轉(zhuǎn)染后OCI-LY19 細(xì)胞PDGF-A 、PDGF-B 、BcL-XL 、McL-1 表達(dá)水平

圖2 PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達(dá)水平;A 對(duì)照組；B miR-148a陰性對(duì)照組；C miR-148a mimic組

2.5 miR-148a與S1PR1靶標(biāo)關(guān)系 Targetscan分析表明，miR-148a序列3’UTR區(qū)存在2個(gè)S1PR1結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與p-GL4-S1PR1-3’UTR組比較，p-GL4-S1PR1-3’UTR+miR-148a mimic組的熒光素酶相對(duì)活性顯著降升高(P<0.05)。與p-GL4-S1PR1-3’UTR+miR-148a mimic組比較，p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1+miR-148a mimic組、p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del2+miR-148a mimic組和p-GL4-S1PR1-3’UTR-Del1,Del2+miR-148a mimic組的熒光素酶相對(duì)活性均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 OCI-LY19 細(xì)胞熒光素酶的相對(duì)活性

3 討論

DLBCL臨床上表現(xiàn)為強(qiáng)侵襲性和中高度惡性，約60%患者可以通過(guò)R-CHOP方案治愈，但仍有部分患者耐藥，出現(xiàn)病情反復(fù)，預(yù)后不良[10]。

miR-148a在腫瘤組織或細(xì)胞中異常表達(dá)及調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中miR-148a表達(dá)水平下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-148a能夠抑制人食管癌細(xì)胞遷移、侵襲[11]。本研究表明，與HMy2.CIR細(xì)胞相比，OCI-LY19細(xì)胞中miR-148a表達(dá)水平顯著降低，提示在DLBCL細(xì)胞中miR-148a低表達(dá)，可能與DLBCL有關(guān)。研究表明，miR-148a過(guò)表達(dá)可以靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路，下調(diào)VEGF表達(dá)水平，抑制血管生成、細(xì)胞增殖[12]。徐桂麗等[13]研究表明miR-148a在NSCLC外周血中低表達(dá)，HPIP高表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-148a能夠下調(diào)HPIP表達(dá)水平，從而抑制A549細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，miR-148a mimic組細(xì)胞活性、遷移能力顯著降低，而miR-148a陰性對(duì)照組無(wú)明顯變化，提示上調(diào)miR-148a表達(dá)水平能夠抑制OCI-LY19細(xì)胞增殖、遷移能力，推測(cè)miR-148可能通過(guò)調(diào)控某種信號(hào)通路來(lái)抑制OCI-LY19細(xì)胞增殖、遷移。

近年S1PR1促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用引起研究者們的注意，S1PR1和S1PR3在卵巢癌組織中高表達(dá)，且與組織微血管密度(MVD)相關(guān)，提示S1PR1和S1PR3可能會(huì)成為評(píng)價(jià)卵巢癌預(yù)后新指標(biāo)，并為其治療提供新靶點(diǎn)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與HMy2.CIR細(xì)胞相比，OCI-LY19細(xì)胞中S1PR1蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示在DLBCL細(xì)胞中S1PR1高表達(dá)，可能促進(jìn)DLBCL發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Weichand等[15]研究表明S1PR1能夠調(diào)控NLRP3/IL-1β信號(hào)通路靶向腫瘤巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)小鼠乳腺腫瘤中S1PR1的遺傳缺失可防止肺轉(zhuǎn)移和腫瘤淋巴管生成。隨后研究表明，上調(diào)S1PR1表達(dá)水平可調(diào)節(jié)RhoA活化以加速VE-鈣粘蛋白磷酸化，導(dǎo)致EDV增加和乳腺癌中VM減少，提示S1PR1可為乳腺癌患者的抗血管生成治療提供新的思路[16]。本研究表明，與對(duì)照組比較，miR-148a mimic組S1PR1表達(dá)水平顯著降低，提示上調(diào)miR-148a表達(dá)水平可抑制S1PR1表達(dá)，可能通過(guò)此通路抑制OCI-LY19細(xì)胞增殖、遷移。TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示miR-148a序列3’UTR區(qū)存在2個(gè)S1PR1結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)S1PR1是miR-148a作用靶點(diǎn)，說(shuō)明miR-148a能夠調(diào)控S1PR1表達(dá)抑制OCI-LY19細(xì)胞增殖、遷移，但是具體通過(guò)調(diào)控哪種信號(hào)通路還有待進(jìn)一步。

S1PR1高表達(dá)能夠激活ERK1/2信號(hào)通路，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，此外下調(diào)S1PR1表達(dá)水平能夠抑制STAT3活性并在體外和體內(nèi)抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]。ERK活化后，可進(jìn)一步調(diào)控c-jun，c-fos，AP-1，NF-κb等轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展；STAT3能夠調(diào)控大部分癌基因的表達(dá)，是重要的癌基因和轉(zhuǎn)錄因子[18]。PDGF-A、PDGF-B作為p-ERK的下游靶基因，在腫瘤中PDGF-A、PDGF-B高表達(dá)，可持續(xù)高水平地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，參與癌癥發(fā)生發(fā)展。BcL-XL和McL-1是STAT3下游靶基因，能夠抑制細(xì)胞凋亡，在大部分腫瘤中高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，miR-148a mimic組ERK蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平、PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達(dá)水平顯著降低，提示miR-148a高表達(dá)，可能通過(guò)下調(diào)S1PR1表達(dá)水平進(jìn)一步調(diào)控ERK/STAT3信號(hào)通路下調(diào)PDGF-A、PDGF-B、BcL-XL、McL-1表達(dá)水平，從而抑制OCI-LY19細(xì)胞增殖、遷移。

綜上所述，miR-148a在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-148a表達(dá)水平能夠下調(diào)S1PR1表達(dá)，可能通過(guò)ERK/STAT3信號(hào)通路來(lái)抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖和遷移。但miR-148a在制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的表達(dá)情況仍需進(jìn)一步研究。