布魯氏菌噬菌體基因組學(xué)研究進展

張 宇，樸東日，姜 海

布魯氏菌病簡稱布病，是一種由布魯氏菌引起的、全身感染性的人獸共患性疾病，《中華人民共和國傳染病防治法》將其歸為乙類傳染病。人主要通過直接接觸受感染的病畜及其食物制品或吸入帶有布魯氏菌的氣溶膠而感染，發(fā)病后出現(xiàn)發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛和多汗等癥狀。動物大多是從患病動物、受污染的水源和飼料等途徑攝入布魯氏菌導(dǎo)致感染[1]，主要引起流產(chǎn)和產(chǎn)奶量減少等病癥。自1887年首次從死于“馬耳他熱”的英國士兵的脾中分離到布魯氏菌以來[2]，經(jīng)100多年的研究，共有12種布魯氏菌被發(fā)現(xiàn)。其中6個經(jīng)典種布魯氏菌均來源于陸生生物，即羊種布魯氏菌(B.melitensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)、綿羊附睪種布魯氏菌(B.ovis)、犬種布魯氏菌(B.canis)、豬種布魯氏菌(B.suis)和沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)；另外6個為新發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌，即鯨種(B.ceti)、鰭種(B.pinnipidialis)、田鼠種(B.microti)、狒狒種(B.papionis)、紅狐種(B.Vulpis)和人源種布魯氏菌(B.inopinata)[3]。

應(yīng)用布魯氏菌噬菌體鑒別布魯氏菌是一種簡便和快速的方法，但它只能鑒別種，不能鑒別各生物型[4]。20世紀50年代，Parnas和Jablonski等發(fā)現(xiàn)了噬菌體對布魯氏菌的感染和裂解作用[5-6]。1955年在蘇聯(lián)分離到的Tbilisi(Tb)噬菌體是最早被國際公認的用于布魯氏菌鑒定的噬菌體，到80年代，根據(jù)宿主特異性，將布魯氏菌噬菌體分為6大群，其代表株為Tb、Fi(Firenze)、Wb(Weybridge)、Bk(Berkeley)、R/C、Iz(Izatnagar)，這對布魯氏菌噬菌體的分群及其在布魯氏菌種中的鑒別和分類起到重要作用，全球的實驗室至今仍在使用[7-8]。后來分離到的噬菌體SA、A2、NM系列等噬菌體[9]，作為參考系統(tǒng)的補充，對布魯氏菌的分型鑒定也具有一定意義。布魯氏菌噬菌體的研究由來已久，但對具有不同宿主特異性的不同布魯氏菌噬菌體的種群結(jié)構(gòu)、分子多樣性和基因組的轉(zhuǎn)運機制仍然了解甚少?，F(xiàn)對布魯氏菌噬菌體最新研究結(jié)果進行簡要綜述。

1 布魯氏菌噬菌體分類研究

布魯氏菌噬菌體均屬于痘病毒科，為雙鏈DNA病毒，具有二十面體頭部和一個短小尾部，尾部有尾纖絲，該纖絲對噬菌體吸附在宿主菌上有明顯作用[10]?；蚪M大小相近，為38.25～41.45 kb，其中Iz噬菌體的基因組是所有裂解型布魯氏菌噬菌體中最大的[11]，預(yù)測的蛋白產(chǎn)物個數(shù)也非常相近，Tb、Pr、Fi、Wb、S708、Bk、R/C和EF4的GC含量為48%，低于宿主菌布魯氏菌基因組(57%)。布魯氏菌噬菌體之間具有高度相似的序列和基因組結(jié)構(gòu)，主要差異表現(xiàn)在它們所感染的布魯氏菌的種類不同[12]。表1是目前在美國國立生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫收錄的12株布魯氏菌噬菌體。

1.1 Tb 1955年第比利斯疫苗和血清研究所首次從牛糞便中分離得到Tbilisi噬菌體[2]。隨后，該噬菌體被布魯氏菌分類學(xué)國際小組委員會批準作為布魯氏菌菌株診斷和鑒別的參考噬菌體[13]。Tb在常規(guī)檢測濃度(routine test dilution，RTD)對牛種布魯氏菌有裂解作用;在高濃度(104×RTD或更高)時可引起豬種和沙林鼠種布魯氏菌裂解。

1.2 Wb Weybridge(Wb)噬菌體是在豬種布魯氏菌培養(yǎng)液中通過誘導(dǎo)Tb噬菌體得到的[14]，對光滑型的牛種、豬種和沙林鼠種布魯氏菌具有裂解作用，不裂解粗糙型的犬種、綿羊種布魯氏菌。

1.3 Fi Firenze(Fi)噬菌體是從牛種布魯氏菌中分離得到的[15]，在RTD中可以裂解光滑型牛種、沙林鼠種、田鼠種和紅狐種布魯氏菌;在高濃度下對豬種布魯氏菌也有裂解作用。

1.4 Bk Berkeley(Bk)噬菌體是在羊種布魯氏菌Isfahan株中培養(yǎng)Wb噬菌體出現(xiàn)的噬斑中分離得到的[16]，能裂解光滑型牛種和豬種布魯氏菌。后又在不同的羊種布魯氏菌株上傳代，得到Bk2噬菌體，現(xiàn)在是鑒定光滑型布氏菌的常用噬菌體之一[4]。

1.5 R/C R/C是一種來源于Wb、D和Mc/75噬菌體的突變體，可裂解綿羊附睪種布魯氏菌、犬種布魯氏菌以及其他種型的一些粗糙型菌株，而不裂解任何光滑型布魯氏菌[12]。

1.6 Iz 1982年，印度Izatnagar的獸醫(yī)研究所從綿羊和山羊糞便中分離到的Iz噬菌體，在RTD時可裂解光滑型牛種、豬種、沙林鼠種、羊種布魯氏菌，也可裂解粗糙型羊種和豬種布魯氏菌，而不裂解粗糙型牛種、綿羊附睪種和犬種布魯氏菌;在104×RTD甚至更高濃度，幾乎對所有光滑型布魯氏菌表現(xiàn)出裂解活性，但對粗糙型牛種和綿羊附睪種布魯氏菌的裂解活性仍較低，對犬種布魯氏菌的活性幾乎沒有[17]。

1.7 NP Rigby等[12]從非典型牛種布魯氏菌分離出的布魯氏菌噬菌體，命名為Nepean(Np)噬菌體，可以裂解光滑型豬種和沙林鼠種布魯氏菌。

1.8 Pr 2003年在墨西哥Perote分離出布魯氏菌噬菌體Pr[18]，可以裂解牛種、羊種和豬種布魯氏菌，其噬斑因布魯氏菌菌株不同而有所差異，在牛種和豬種布魯氏菌中復(fù)制時，形成清晰的斑塊，而在羊種布魯氏菌中復(fù)制時，產(chǎn)生小的渾濁斑塊。

1.9 EF4 Calvin等從蒙大拿州采集的麋鹿糞便樣本中分離出可感染牛種布魯氏菌S19的噬菌體，命名為EF4[19]。

1.10 F1 F1噬菌體在牛種布魯氏菌疫苗株S19上繁殖得到[20]。與Tb裂解譜相似，F(xiàn)1對牛種、豬種、沙林鼠種和田鼠種布魯氏菌具有特異性。

1.11 BiPBO1 BiPBO1是第一個被鑒定出的溫和型布魯氏菌噬菌體，是Hammerl等[21]通過誘導(dǎo)，從人源種布魯氏菌中分離到的噬菌體。在形態(tài)上不同于其他已知的布魯氏菌噬菌體，屬于長尾病毒科，可感染牛種和羊種布魯氏菌。

表1 NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的布魯氏菌噬菌體Tab.1 Brucella phages included in the NCBI database

2 布魯氏菌噬菌體基因組功能研究進展

基因?qū)κ删w的繁殖至關(guān)重要。布魯氏菌噬菌體的基因根據(jù)預(yù)測的功能進行聚類，結(jié)構(gòu)蛋白和裂解蛋白在正鏈上編碼，反向鏈中具有參與DNA復(fù)制和代謝的基因結(jié)構(gòu)[18]。

2.1 Tb Tb噬菌體有57個開放閱讀框(ORF)，3個轉(zhuǎn)錄終止子和4個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄啟動子。ORF 28與編碼預(yù)測GDSL/SGNH水解酶的酶尾纖維蛋白具有同源性，酶尾纖維蛋白常在降解宿主細胞膜中起作用[22]。ORF 29編碼預(yù)測的碳水化合物結(jié)合尾刺突蛋白，與含有碳水化合物結(jié)合蛋白的果膠裂解酶樣結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出顯著的相似性。ORF 6和7分別編碼末端酶小亞基和大亞基，這兩個末端酶是參與DNA包裝的主要蛋白質(zhì)。ORF 30的產(chǎn)物具有肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DUF847結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域通常存在于噬菌體裂解蛋白和細菌肽聚糖降解酶中[23]，主要在裂解宿主和降解肽聚糖中起作用。ORF 43編碼假定的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，ORF 49編碼假定的Ⅲ型限制性核酸酶，這2個基因可能參與DNA限制和修飾[17]。ORF 23可能編碼尾纖維蛋白，其與伯克霍爾德菌噬菌體DC1尾纖維蛋白肽酶結(jié)構(gòu)域(N端位置拓撲結(jié)構(gòu))表現(xiàn)出相似性[22]。4個可能與DNA復(fù)制有關(guān)的基因ORF 33、ORF 50、ORF 52和ORF 58，分別編碼預(yù)測的DnaA樣蛋白、DEAD解旋酶、核酸外切酶和雙功能引物酶/DNA聚合酶。

2.2 Pr Pr噬菌體基因組中的ORF 6和7與Tb噬菌體的功能相同，均在編碼大小亞基末端酶中發(fā)揮作用。Pr ORF 29的產(chǎn)物也具有肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DUF847結(jié)構(gòu)域，可能參與宿主裂解?？赡軈⑴cDNA限制和修飾的ORF 42和ORF 48，分別編碼預(yù)測的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和Ⅲ型限制性核酸酶。ORF 32、ORF 49、ORF 51和ORF 57可能參與DNA復(fù)制，其編碼的預(yù)測產(chǎn)物功能均與Tb噬菌體相同。

2.3 Fi ORF 28和ORF 29可能在吸附和滲透宿主細胞中有重要作用，ORF 28編碼的預(yù)測蛋白產(chǎn)物為酶尾纖維蛋白，ORF 29編碼的預(yù)測碳水化合物結(jié)合尾刺突蛋白，含有與沙門菌噬菌體P22相似的果膠裂解酶結(jié)構(gòu)域[22,24]。

2.4 Wb Wb基因組的ORF 16和ORF 23編碼結(jié)構(gòu)蛋白，ORF 27編碼尾部蛋白，ORF 57編碼引物酶/DNA聚合酶。

2.5 R/C R/C基因組的ORF 14編碼引物酶/DNA聚合酶，該基因內(nèi)含有終止密碼子，對基因表達起到調(diào)控作用。

2.6 Iz Iz噬菌體中位于ORF 23和24之間的301 bp重復(fù)核苷酸序列，編碼尾纖維蛋白[11]。與R/C相同，Iz編碼引物酶/DNA聚合酶的基因中也包含一個終止密碼子。

2.7 EF4 EF4噬菌體的基因組編碼密度為87.8%，有72個編碼序列(CDS)，其中38個與已知功能的蛋白具有序列相似性，包括主要頭部蛋白、門戶蛋白和尾環(huán)蛋白，以及大小亞基末端酶。該基因組還包含參與DNA復(fù)制的假定蛋白，如雙功能DNA聚合酶/引物酶、解旋酶、核酸外切酶和DNA核酸內(nèi)切酶。

2.8 F1 F1噬菌體基因組已知具有58個假定基因和7個轉(zhuǎn)錄終止子。F1與Tb和Pr非常相似，核苷酸同源性分別為99%和98%，大多數(shù)預(yù)測的基因產(chǎn)物甚至完全相同。F1的一些產(chǎn)物可能參與病毒粒子組裝，如Gp12主要頭部蛋白、Gp15和Gp16結(jié)構(gòu)蛋白、Gp24尾絲蛋白，這些產(chǎn)物與Tb相應(yīng)的蛋白相關(guān)，有顯著的氨基酸多態(tài)性。

2.9 BIPBO1 該基因組包括87個ORF和19個可能的轉(zhuǎn)錄終止子，32個假定的基因產(chǎn)物可以進行功能分配。BIPBO1與其他溫和噬菌體相似，其編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因主要存在于基因組左臂，整合基因和宿主細胞裂解的基因位于中段，右臂是參與復(fù)制和免疫的基因。正鏈上ORF 1和2可能編碼大小亞基末端酶，ORF 3和6可能編碼與HK97樣噬菌體頭部蛋白相關(guān)的門戶蛋白和主要衣殼蛋白，ORF 9、10、13和16是4個假定的尾部基因。此外，還有兩個位于負鏈上的基因，可能編碼毒素(ORF 20)和解毒劑蛋白(ORF 19)，該模塊可能與BiPBO1原噬菌體的穩(wěn)定性有關(guān)。ORF 29編碼的蛋白含有纖維連接蛋白3型重復(fù)序列(FN3)，該結(jié)構(gòu)域通常存在于噬菌體的尾部蛋白質(zhì)中，可能有助于噬菌體附著到細胞表面[25]?；蚪M中段的ORF 33和ORF 37可能為編碼賴氨酸和整合酶的基因，參與整合。在基因組的右臂有幾個對復(fù)制很重要的ORF，ORF 77和ORF 79的產(chǎn)物分別與DnaA起始蛋白和DnaB解旋酶類似，ORF 52也可編碼解旋酶，該基因被一個核酸內(nèi)切酶基因(ORF 51)和一個核酸外切酶基因(ORF 53)包圍。

3 布魯氏菌噬菌體基因組進化

Tb、Fi、Wb、S708、Bk、R/C、EF4和Pr這些布魯氏菌噬菌體基因組之間具有較高的序列同源性。Tb、Fi、Wb、S708、Bk和R/C的成對核苷酸序列同源性>96.1%，Tb與Fi、Pr的核苷酸同源性均>99%[18,22]，EF4與R/C基因組的核苷酸同源性為99.71%，F(xiàn)1與Tb和Pr非常相似，核苷酸同源性分別為99%和98%，所有基因組具有很強的共線性。Farlow等[22]確定了與宿主范圍表型一致的3個遺傳組，I組噬菌體TbM、TbW和Fi，II組噬菌體Bk、R/C和Pr，III組噬菌體S708和Wb。在I組噬菌體中，TbW和Fi序列僅相差一個核苷酸，TbM與TbW和Fi的總核苷酸同源性為99.93%，差異主要存在于幾個基因間IG區(qū)域和ORF 21的插入。還有研究表明在不同研究所的Tb噬菌體存在一些序列偏差，主要是由點突變造成的[18,22,24]。

4 應(yīng) 用

布魯氏菌病仍然是一個全球性的健康問題，對這種人獸共患病的監(jiān)測和防控仍是一個難題。食品和臨床樣本中布魯氏菌的檢測是一項費時費力的工作，許多針對布魯氏菌DNA的PCR檢測方法已經(jīng)開發(fā)出來，但這些方法無法區(qū)分活的和死的布魯氏菌。噬菌體廣泛應(yīng)用于布魯氏菌的分型，可在宿主菌細胞內(nèi)可以增殖到非常高的數(shù)量，所以它們也可以作為宿主菌的特定指示物，現(xiàn)已有研究者對此進行初步應(yīng)用。例如，Kirill等[26]使用實時熒光定量PCR(qPCR)對噬菌體DNA擴增過程進行監(jiān)測，以此間接證明血液樣本中存在活菌，這種方法無需DNA提取和純化步驟，對含有其他可能被錯誤鑒定為布魯氏菌屬(人蒼白桿菌和阿菲波菌)的混合培養(yǎng)物同樣有效；Projahn等[27]同樣利用qPCR方法，在人為污染田鼠種布魯氏菌的牛乳中檢測出噬菌體DNA擴增，證明牛乳中存在活菌，與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的技術(shù)相比，這種方法表現(xiàn)出在牛奶基質(zhì)中同樣具有高穩(wěn)定性，并且檢測時間也大大縮短。因此，可以認為分子檢測方法是檢測布魯氏菌的一種可靠靈敏的方法，有助于減少篩選潛在污染物所需的實際操作時間，并在不分離細菌的情況下得到結(jié)果，提示感染風(fēng)險。但這些研究結(jié)果都是通過模擬樣品得到的，未來是否可以應(yīng)用到真實標本中還需要進一步的驗證。

5 展 望

目前關(guān)于布魯氏菌噬菌體的全基因組測序以及遺傳特征的研究逐漸成為熱點。通過將更多的布魯氏菌噬菌體納入到基因組數(shù)據(jù)庫中，研究噬菌體與宿主菌細胞壁結(jié)合的位點及其與布魯氏菌的作用機制，從而設(shè)計出具有裂解布魯氏菌相似作用的藥物[28]，即可應(yīng)用其凈化布病養(yǎng)殖場以及治療布魯氏菌病;通過研究噬菌體基因組功能及其與宿主菌相互作用，探明布魯氏菌噬菌體進化過程及其與宿主菌共同演化關(guān)系，確定其在宿主菌之間傳遞遺傳信息的作用，從而了解布魯氏菌噬菌體在布病流行規(guī)律中的作用，有效控制傳播進程;通過開發(fā)新的靈敏可靠的活布魯氏菌檢測方法，有效地應(yīng)用到食品和臨床標本的檢測中。

利益沖突：無

引用本文格式：張宇，樸東日，姜海. 布魯氏菌噬菌體基因組學(xué)研究進展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(8)：718-722. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.095