煙臺市2015-2018年人感染戊型肝炎病毒基因型分析

崔偉紅，劉 娟，宮連鳳，顏丙玉，徐迎春

戊型病毒性肝炎(簡稱戊肝，HE)是由戊肝病毒(HEV)感染引起的肝臟傳染病，主要經(jīng)消化道傳播。近年來中國戊肝報告發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[1-3]，東部地區(qū)發(fā)病率明顯高于西部和中部[4]。煙臺是沿海開放城市，近年來戊肝發(fā)病率為全省平均水平的近6倍[5]，給群眾造成了巨大的經(jīng)濟負擔。HEV主要分為4個基因型，基因I和Ⅱ型僅人類感染，主要在發(fā)展中國家流行；基因Ⅲ、Ⅳ型人獸共患，以散發(fā)為主，豬是主要宿主之一，Ⅲ型世界各地均有報道，Ⅳ型主要分布于亞洲國家，尤其中國[6-8]。為了解煙臺市人感染戊肝病毒流行株的基因型別，我們收集了法定傳染病報告系統(tǒng)報告的戊肝病例，采集急性期糞便和血清標本，用套式RT-nPCR進行病毒核酸檢測，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2015-2018年法定傳染病報告系統(tǒng)報告的戊肝病例為研究對象，收集病人的基本信息。采集病例血清標本和糞便標本，血清標本進行HEV-IgM抗體檢測，對HEV-IgM陽性者提取戊肝病毒RNA，進行核酸檢測。共采集360份血清、48份糞便標本。

1.2 試劑 HEV-IgM抗體檢測試劑盒由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；RNA提取試劑盒由德國Qiagen公司生產(chǎn)；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶由美國Promega公司生產(chǎn)；PCR反應(yīng)試劑、緩沖液由寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)。實驗檢測委托山東省和煙臺市疾病預(yù)防控制中心完成。

1.3 標本處理 糞便標本用pH7.4 PBS稀釋，充分震蕩混勻，制成10%懸液(w/v)，4 ℃ 3 000 r/min離心 20 min 提取上清待檢；血清標本直接檢測。

1.4 HEV RNA提取、擴增和測序 參考文獻[9]合成HEV ORF2區(qū)域特異性引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物為：HEV外側(cè)上游：5′-GAYGGSACYAAYACYCATATWATGGC-3′ (5 648-5 673)；HEV外側(cè)下游：5′-GTYGGCTCGCCATTGGCYGAGAC-3′ (6 350-6 372)；HEV內(nèi)側(cè)上游：5′-GARGCWTCWAATTAYGCCCAGTAYCG -3′ (5 678-5 703)；HEV內(nèi)側(cè)下游：5′-CCAGCCGACGAAATCAATTCTGTC-3′(6 298-6 321)。

取140 μL血清或糞便懸液，用RNA提取試劑盒進行RNA提取，收集50 μL提取液。采用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，在42 ℃、50 min進行逆轉(zhuǎn)錄；用巢式PCR(nested PCR, nPCR)擴增HEV核苷酸片段。第一輪PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，擴增45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；第二輪PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，擴增35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

最終獲得的PCR終產(chǎn)物序列長度為644 bp(基因組第5 678～6 321位，參考緬甸株M73218)，其中用于序列分析的區(qū)段長度為540 bp(病毒基因組第5 765～6 304位)。所有PCR陽性產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.5 基因序列分析 采用mega7.0對本研究所得序列和GenBank數(shù)據(jù)庫下載的參考序列進行分析，計算遺傳距離，并用鄰接法構(gòu)建基因進化樹，計算Bootstrap值，檢驗進化樹各分支置信度，進行1 000次重復(fù)運算，當Bootstrap值>70時則構(gòu)建的進化樹可靠。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Epidata3.0軟件錄入數(shù)據(jù)，用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用方差分析比較不同亞型組間數(shù)值變量差異，采用Fisher精確概率法比較不同亞型組建分類變量差異。雙側(cè)檢測，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 共采集了360份血清標本和48份糞便標本。采集的360份血清樣本中，198份HEV-IgM陽性，陽性率55.00%。198份血清標本中，55份HEV核酸檢測陽性，陽性率27.78%。48份糞便標本中，19份HEV核酸檢測陽性，陽性率39.58%。其中2例病例血清和糞便標本同時陽性?？傟栃圆±龜?shù)72例，男性48例，女性24例。發(fā)病3周內(nèi)采集的糞便HEV核酸陽性率(57.1%)高于發(fā)病3周后采集的糞便HEV核酸陽性率(15.0%)(P=0.003)，發(fā)病3周內(nèi)采集的血清HEV核酸陽性率(37.9%)高于發(fā)病3周后采集的血清HEV核酸陽性率(2.2%)(P<0.001)。見表1。

2.2 基因型分布 本次檢測的72例HEV基因型全部是4型。4d亞型的構(gòu)成比最高，占77.78%(56/72)；其次是4b亞型，占19.44%(14/72)；4a亞型的構(gòu)成比最低，占2.78%(2/72)。采用Fisher確切概率法進行組間構(gòu)成比比較，不同亞型在各年份的構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.195)。不同亞型的季節(jié)構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.908)。不同亞型的性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.132)。4a、4b、4d亞型病例的年齡分別是(50.0±7.07)歲、(57.6±9.74)歲、(58.6±10.77)歲，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.667，P=0.517)；4a、4b、4d亞型病例的ALT值分別是(742.0±912.17)U/L、(1234.8±835.56)U/L、(854.9±821.97)U/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.235，P=0.297)。見表1。

表1 2015-2018年煙臺市HEVRNA檢測陽性數(shù)量及分布Tab.1 Number positive and distribution of HEV RNA in Yantai from 2015 to 2018

2.3 遺傳距離分析 人感染HEV核苷酸序列的遺傳距離為0.002～0.303。其中4a亞型間的遺傳距離是0.035；4b亞型間的遺傳距離是0.015～0.127；4d亞型間的遺傳距離是0.002～0.094。對72例病人和不同物種的核苷酸序列遺傳距離進行分析，結(jié)果顯示本次分離出的56株4d亞型HEV序列與山東地區(qū)豬源(KF176351)、羊源(KU904267)、牛源(KU904278)HEV序列的遺傳距離為0.021～0.160、0.010～0.178、0.008～0.176；14株4b亞型與廣西(EU676172)、廣東(JX855794)、黑龍江(DQ279091)豬源HEV序列的遺傳距離為0.033～0.180；2株4a亞型HEV序列與吉林(EF077630)和上海(EU366959)豬源HEV序列的遺傳距離為0.060～0.226。見圖1。

3 討 論

近年來戊肝在病毒性肝炎中發(fā)病占比逐年升高[10]，開展戊肝病原學(xué)監(jiān)測對于分析戊肝病毒傳播路徑，有效進行戊肝防控非常重要[11]。歐洲地區(qū)已經(jīng)建立HEV分子監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，涵蓋了人、動物、食品和外環(huán)境等各類來源的HEV[12]。我國也有不少學(xué)者在進行HEV分子流行病學(xué)研究。有研究顯示，戊肝患者感染后2周內(nèi)血清HEV RNA陽性率可高達90%左右[13]，但因戊肝早期發(fā)病不典型，病例往往癥狀持續(xù)一段時間才就診，另外部分基層醫(yī)院不具備診斷能力，確診時間靠后，采集標本時往往病例已經(jīng)發(fā)病較長時間，因此HEV RNA檢出率不高。本研究血清標本核酸總陽性率27.78%(55/198)，高于江蘇(19.2%)[14]但低于上海(32.79%)[15]的陽性率。糞便標本的核酸陽性率相對較高，達到陽性率39.58%(19/48)，可能與采集糞便樣本時，僅選擇了發(fā)病早期的病例有關(guān)。

研究顯示，我國HEV最常見的Ⅳ型病毒，常見亞型是4a、4d和4h亞型[16]。本次檢測的煙臺戊肝流行株均屬于第Ⅳ基因組，流行株以4d亞型(占77.78%)為主，其次是4b亞型(19.44%)，4a亞型占比最低(2.78%)。本次未在樣本中檢出4c亞型，山東省和煙臺市以往的檢測中也未曾檢出4c亞型[11,17]，推測4c亞型在煙臺地區(qū)不是優(yōu)勢株。而2012年煙臺地區(qū)人源HEV主要流行株是4a亞型，其次是4d亞型[17]。說明各年份的流行優(yōu)勢株有差異，這與疾病的自然流行規(guī)律有關(guān)系。各年份之間的流行株并無特定的進化關(guān)系，可能與戊肝感染的多源性，高度散發(fā)有關(guān)。

國際病毒分類委員會(International Committee for Taxonomy of Viruses，ICTV) 按病毒的分子結(jié)構(gòu)對 HEV 分類提出了新的建議：用氨基酸序列所建立的遺傳進化樹所計算出的遺傳距離的大小進行基因分型[18]，當P值小于0.30為同一個基因型。本次分離出的煙臺市人感染HEV核苷酸序列全部為Ⅳ型，總遺傳距離為0.002～0.303，其中4a亞型間的遺傳距離是0.035；4b亞型間的遺傳距離是0.015～0.127；4d亞型間的遺傳距離是0.002～0.094。在獲得的毒株中，親緣關(guān)系很近，但是沒有完全一致的毒株，符合散發(fā)感染的特點。

分離出的4d亞型HEV序列與山東地區(qū)豬源、羊源、牛源HEV序列的遺傳距離分別為0.021～0.160、0.010～0.178、0.008～0.176，表明煙臺市人感染HEV序列與豬、牛、羊等動物親緣關(guān)系均較近，提示本地HEV感染可能存在跨物種傳播，動物源性傳播不容忽視。一方面人感染HEV可能與進食動物制品有關(guān)[19]，也可能與HEV病毒動物糞便污染導(dǎo)致密切接觸傳播有關(guān)，尚需進一步研究。

本次的研究樣本均來自于國家傳染病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，由于流行病學(xué)調(diào)查信息的局限性，對于肝功能僅收集了ALT指標，未進一步進行傳染源的追溯，但對于追蹤煙臺地區(qū)HEV基因特征變化和進行人感染HEV病毒傳播來源分析提供了重要的線索。

利益沖突：無

引用本文格式：崔偉紅，劉娟，宮連鳳，等. 煙臺市2015-2018年人感染戊型肝炎病毒基因型分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(8)：703-706，713. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.099