云南省大理市嚙齒動物攜帶冠狀病毒和戊型肝炎病毒的調(diào)查

楊 字, 殷紅敏，黃 皓，孔逸塵, 陳 利，張云智

冠狀病毒(Coronavirus，CoV)是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目(Nidovirales)、正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae)，包括甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus，α-CoV)、乙型冠狀病毒屬(Betacoronavirus，β-CoV)、丙型冠狀病毒屬(Deltacoronavirus，δ-CoV)和丁型冠狀病毒屬(Gammacoronavirus，γ-CoV) 4個屬[1]。CoV廣泛感染各種動物及人，引發(fā)呼吸道和消化道疾病[2]。目前感染人的CoV有7種，分屬于α-CoV和β-CoV，通常前者引起類似普通感冒的輕微癥狀，后者導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病，引發(fā)大流行[3]。早在1949年，嚙齒動物攜帶的冠狀病毒(Rodent-borne coronavirus，RCoV)在小家鼠(Musmusculus)中首先分離到，命名為鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)[4]，根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)目前分類，鼠冠狀病毒(Murinecoronavirus)包括MHV、大鼠冠狀病毒(Rat coronavirus)和鳥嘴海雀病毒(puffinosis virus)，屬于β-CoV的Embecovirus亞屬。目前β-CoV包含5種可以感染人的冠狀病毒，在過去不到20年里，β-CoV中的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)已經(jīng)造成3次大暴發(fā)，引起人類嚴(yán)重的疾病。近年來，ICTV新增多個與嚙齒動物有關(guān)的冠狀病毒種，例如中國鼠冠狀病毒HKU24(ChinaRattuscoronavirus HKU24)、鹿城褐家鼠冠狀病毒(LuchengRnratcoronavirus)。多項研究發(fā)現(xiàn)中國云南、浙江和歐洲等地的嚙齒動物攜帶CoV[5-7]。

戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)是無包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于戊肝病毒目(Hepelivirales)、肝炎病毒科(Hepeviridae)。肝炎病毒科分為正戊型肝炎病毒屬(Orthohepevirus)和魚戊型肝炎病毒屬(Piscihepevirus)。正戊型肝炎病毒屬分為 A、B、C、D 4種。目前，A種包含8個基因型，主要感染人；C種分為4個亞型，主要感染鼠和雪貂；B和D種分別感染禽類和蝙蝠[8]。戊型肝炎病毒引起人的急性和慢性肝炎，稱戊型肝炎(Hepatitis E，HE)，HE為自限性急性病毒肝炎，臨床上大多表現(xiàn)為輕微發(fā)熱，但孕婦和免疫低下人群易感，引發(fā)慢性肝炎，嚴(yán)重者造成流產(chǎn)、死亡[9]。2011年，嚙齒動物攜帶的HEV全基因組首次在褐家鼠(Rattusnorvegicus)中獲得[10]，隨后在多個國家的褐家鼠、黃胸鼠(Rattustanezumi)等家鼠屬(Rattus)嚙齒動物中發(fā)現(xiàn)，2018年我們課題組在云南省高山姬鼠(Apodemuschevrieri)和黑腹絨鼠(Eothenomysmelanogaster)中發(fā)現(xiàn)嚙齒動物攜帶的HEV新基因型[11]。

嚙齒動物種類占哺乳動物的40%以上，是哺乳動物中的第一大類群，與人類關(guān)系密切相關(guān)[12]。嚙齒動物攜帶多種病毒，是病毒的天然儲存庫[13]。大理市屬于北亞熱帶高原季風(fēng)氣候，動植物繁多，僅記錄的嚙齒動物就有20多種[14]，是研究CoV和HEV的天然場所。CoV和HEV是重要的人獸共患病RNA病毒。本文對大理市4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)嚙齒動物攜帶的CoV和HEV感染現(xiàn)況進(jìn)行了調(diào)查，并發(fā)現(xiàn)在嚙齒動物中存在共感染(Co-infection)現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 樣本收集及物種鑒定 2020年8月至2021年8月在云南省大理市的銀橋鎮(zhèn)、大理鎮(zhèn)、下關(guān)鎮(zhèn)和鳳儀鎮(zhèn)4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，以油炸食物為誘餌，用夾夜法進(jìn)行宿主動物調(diào)查。捕獲的小型哺乳動物立即帶回實驗室，先形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，同時利用PCR擴(kuò)增肝組織DNA的線粒體細(xì)胞色素b(mt-Cytb)基因，進(jìn)行分子鑒定。樣本進(jìn)行無菌解剖，收集心、肝、脾、肺、腸置于凍存管中，-80 ℃保存待檢。

1.2 核酸提取 CoV檢測采用腸道組織，HEV檢測使用肝組織。無菌剪取約0.1 g組織樣本放入GeneReady動物PIII粉碎管(遂真，中國)中，加入滅菌的500 μL磷酸緩沖液，再置于GeneReady Ultimate生物樣本低溫快速制備離心系統(tǒng)(遂真，中國)中進(jìn)行研磨。核酸提取采用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(TIANGEN，中國)，制備步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3 巢式RT-PCR 病毒RNA擴(kuò)增采用巢式PCR，兩輪PCR反應(yīng)體系皆為25 μL。第1輪采用Fastking一步法RT-PCR試劑盒(TIANGEN，中國)，RNA模板3 μL，CoV和HEV退火溫度分別為50.0 ℃和52.8 ℃，第2輪采用Green Taq Mix(Vazyme，中國)，第1輪產(chǎn)物模板1 μL，CoV和HEV退火溫度分別為50.0 ℃和53.6 ℃。PCR引物由賽默飛世爾科技有限公司合成(表1)。瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向序列測定。若測序結(jié)果為重疊峰，將PCR產(chǎn)物純化回收(OMEGA Bio-tek，美國)、T-A克隆(Promega，美國)，再送陽性克隆菌液測序。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primer information

1.4 核苷酸序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 通過DNAstar Lasergene軟件包進(jìn)行序列拼接、剪切。利用NCBI在線BLAST工具進(jìn)行相似性比對分析。從GenBank中下載相近序列，使用ClustalX2進(jìn)行序列比對。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建使用MEGA-X，選擇最大似然法(Maximum Likelihood，ML)進(jìn)行1 000次bootstrap重復(fù)，核苷酸替代模型選擇最優(yōu)模型，自展值大于70%為可靠進(jìn)化分支。CoV和HEV進(jìn)化樹基于部分RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)基因，相應(yīng)嚙齒動物宿主進(jìn)化樹基于部分mt-Cytb基因。

1.5 統(tǒng)計分析 Excel建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 嚙齒動物種類 在大理市4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的居民區(qū)共捕獲嚙齒動物76只，經(jīng)鑒定屬于5屬6種，其中黃胸鼠占55.26%(42/76)、褐家鼠占35.53%(27/76)、高山姬鼠占3.95%(3/76)、大絨鼠(Eothenomysmiletus)占2.63%(2/76)、針毛鼠(Niviventerfulvescens)占1.32%(1/76)及錫金小鼠(Mus Pahari)占1.32%(1/76)，其中黃胸鼠和褐家鼠為優(yōu)勢種(表2)。

2.2 病毒感染率及共感染率 利用CoV和HEV巢式PCR對76只嚙齒類動物篩查。CoV病毒總感染率為15.79%(12/76)，感染動物為褐家鼠和黃胸鼠，褐家鼠的CoV感染率高于黃胸鼠，感染率分別為40.74%(11/27)、2.38%(1/42)，其它嚙齒動物中未檢測到CoV；HEV總感染率為6.58%(5/76)，感染動物為褐家鼠和黃胸鼠，褐家鼠HEV感染率高于黃胸鼠，感染率分別為14.81%(4/27)、2.38%(1/42)，其它嚙齒動物中未檢測到HEV。在銀橋鎮(zhèn)捕獲的2只褐家鼠中同時檢測到CoV和HEV病毒，共感染率為7.41%(2/27)(表2)。

表2 云南省大理市嚙齒動物攜帶CoV和HEV感染現(xiàn)狀Tab.2 CoV and HEV infection in rodents in Dali City, Yunnan Province

2.3 同源性比對分析 基于CoV的RdRp片段434 bp核苷酸分析，11株來自褐家鼠毒株均為α-CoV(GenBank登錄號：OL689209～OL689219)，相互之間的同源性為99.47%～100.00%，與來自中國福建黃毛鼠(Rattuslosea)RtRl/FJ2015株同源性最高，為99.73%～99.74%；1株來自黃胸鼠毒株為β-CoV(GenBank登錄號：OL689208)，與來自中國云南板齒鼠(Bandicotaindica)Ruili66株同源性最高，為98.21%(表3)?；贖EV的RdRp片段340 bp核苷酸分析，5株來自褐家鼠毒株均為HEV-C(GenBank登錄號：OL689220～OL689224)，相互之間的同源性為94.74%～100.00%，與來自中國香港病人pt5株(從1名腎移植患者且為乙肝病毒攜帶者的腦脊液中檢測到)同源性最高，為95.87%～96.21%(表4)。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 基于CoV和HEV 部分RdRp基因，本研究獲得的片段序列與具有代表性的不同基因型毒株共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。為比較嚙齒動物攜帶的CoV和HEV與宿主的關(guān)系，以嚙齒動物mt-Cytb基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹并與CoV和HEV的進(jìn)化樹形成共進(jìn)化關(guān)系圖，用以推斷病毒與其宿主的進(jìn)化關(guān)系。

本研究的12株CoV中，來自黃胸鼠的CoVDLfy4與其他11株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與Ruili66和RtRn/YN2013形成1個分支，屬于β-CoV的Embecovirus亞屬。鼠冠狀病毒代表株MHV-3和中國鼠冠狀病毒HKU24代表株Ruili-77、Lijiang-14、Lijiang-211、Ruili-888和Lijiang-99都包括在Embecovirus分支。其余11株為CoVDLyq20、CoVDLyq21、CoVDLyq22、CoVDLyq33、CoVDLyq34、CoVDLyq36、CoVDLfy53、CoVDLfy58、CoVDLfy62、CoVDLfy67和CoVDLfy70，它們親緣關(guān)系相對較近，且都來自于褐家鼠，與Longquan-311、GCCDC5、RtRl/FJ2015和Ruian83形成1個分支，屬于α-CoV的Luchacovirus亞屬。Luchacovirus分支包含鹿城褐家鼠冠狀病毒的代表株Longquan-311、Ruian83、Lijiang-71和Lijiang-27。Lijiang-71和Lijiang-27的宿主分別為大絨鼠和大耳姬鼠(Apodemuslatronum)，通過進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)Lijiang-71和Lijiang-27與來自褐家鼠的Longquan-311和Ruian83親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。從CoV病毒-宿主共進(jìn)化樹來看，不同屬的CoV能夠感染同一種嚙齒動物，同一屬的CoV可感染不同的嚙齒動物宿主，這種進(jìn)化模式有利于CoV發(fā)生基因重組，適應(yīng)新的宿主(圖1)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示本研究獲得的5株HEV親緣關(guān)系較近，褐家鼠所攜帶的HEVDLyq21、HEVDLyq34、HEVDLyq35、HEVDLyq40和黃胸鼠所攜帶的HEVDLfy11與pt5形成1個分支，聚集于HEV的C1亞型。C1亞型中除pt5來自于人之外，HEV17/1683也來自于人。來自雪貂的SF4379和F63、來自高山姬鼠的Ac14、Ac86和Ac16以及來自黑腹絨鼠的Em67、Em55和Em40各自形成1個進(jìn)化分支，分別為HEV的C2、C3和C4亞型。HEV-A的宿主更為廣泛，包括豬、駱駝和人類。HEV病毒-宿主共進(jìn)化樹與CoV相比，嚙齒動物攜帶的HEV與相應(yīng)宿主遺傳進(jìn)化較為一致。僅有3株C1型HEV的宿主出現(xiàn)“交叉進(jìn)化”現(xiàn)象(圖2)。

表4 戊肝病毒部分RdRp核苷酸同源性比對Tab.4 Partial RdRp nucleotide homology alignment of HEV

3 討 論

大理市位于云南省西部，處于山脈與高原的過渡地段，擁有蒼山、洱海等自然景觀和豐富的動植物資源，存在宿主動物的多樣性。在大理市周邊城市的動物中檢測出多種病毒，包括漢坦病毒(Hantavirus)、溫州病毒(Wenzhou virus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、戊型肝炎病毒，甚至與SARS-CoV-2極為相似的RaTG13蝙蝠冠狀病毒[18-19]，存在病毒的多樣性。嚙齒動物與人類關(guān)系密切，對嚙齒類攜帶病毒的調(diào)查對于人獸共患病防治非常有必要。

本研究在大理市4個鄉(xiāng)、鎮(zhèn)居民區(qū)捕獲的嚙齒動物中以黃胸鼠和褐家鼠為主。我們在褐家鼠和黃胸鼠中檢測到12株CoV和5株HEV。褐家鼠CoV和HEV的感染率均高于黃胸鼠。未在褐家鼠中檢測到β-CoV，也未在黃胸鼠中檢測到α-CoV，但由于2種鼠活動范圍存在重疊，不排除α-CoV和β-CoV均能在這2種鼠中感染。CoV和HEV在褐家鼠的感染率高于以往研究，而在黃胸鼠中則相反[20-21]，可能與地理、季節(jié)變化或檢測方法差異有關(guān)。這2種病毒是否能引起人的感染，而造成疾病的暴發(fā)流行，需要進(jìn)行長期的監(jiān)測和研究。

來自褐家鼠的11株α-CoV親緣關(guān)系較近，均屬于Luchacovirus亞屬；來自黃胸鼠的1株β-CoV與鼠冠狀病毒和中國鼠冠狀病毒HKU24相近，屬于Embecovirus亞屬。2003年SARS-CoV、2012年MERS-CoV以及從2019年流行至今的SARS-CoV-2對人類造成巨大危害。CoV高突變性和頻繁的重組事件，使其易于適應(yīng)新的宿主，發(fā)生跨種傳播[22]。CoV病毒-宿主共進(jìn)化樹表明，CoV與對應(yīng)宿主共進(jìn)化過程中，進(jìn)化速率不同，同一物種的嚙齒動物存在不同屬CoV，同種CoV能夠感染不同嚙齒動物。另一項研究表明嚙齒動物攜帶的α-CoV極大可能起源于同一祖先，嚙齒動物與CoV之間存在長期的相互作用[23]。

本研究從褐家鼠和黃胸鼠獲得的5株HEV屬于C1亞型，他們相互之間的同源性較高，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中與來自腎移植受者的pt5共同形成1個分支。一般認(rèn)為感染人的HEV僅限于HEV-A，HEV-C的宿主絕大多數(shù)是嚙齒動物。先前雖然有人類感染HEV-C的血清學(xué)證據(jù)，但還不足以證明HEV-C能夠直接感染人類。近期多項研究在免疫低下人群中檢測到HEV-C病原體，并且發(fā)現(xiàn)感染人類的HEV-C為不同種，表明HEV-C能夠跨種傳播[24-26]。人類健康受HEV-C的威脅越來越大，應(yīng)警惕該病毒在人群傳播，因此需加強(qiáng)對大理市嚙齒動物及人群HEV的監(jiān)測。HEV病毒-宿主共進(jìn)化樹顯示兩者進(jìn)化較為一致，HEV與其宿主的進(jìn)化速率較為同步。相比于CoV，HEV在進(jìn)化過程中更為穩(wěn)定，發(fā)生變異和基因重組頻率相對較低。

病毒、細(xì)菌、立克次體、朊病毒和寄生蟲等都能引起人獸共患病[27]。嚙齒動物體內(nèi)不僅存在多種病毒，也攜帶其他微生物[28]。嚙齒動物作為病原體的儲存庫，在人獸共患病的傳播、影響病毒感染力和毒性方面有著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)褐家鼠中同時存在CoV和HEV共感染現(xiàn)象，雖然嚙齒動物中病毒共感染現(xiàn)象十分普遍，但也不能忽視共感染可能造成的影響作用，這有待于進(jìn)一步的研究。

利益沖突：無

引用本文格式：楊字, 殷紅敏，黃皓，等. 云南省大理市嚙齒動物攜帶冠狀病毒和戊型肝炎病毒的調(diào)查[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(8)：685-692. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.096