貴州本地楊木及燈臺木刨花用作實驗動物墊料的研究

霍春茂，龍 紅，秦廷洋，唐克桐，包峰云，張仕斌

(遵義醫(yī)科大學(xué) 實驗動物中心，貴州 遵義 563099)

實驗動物是醫(yī)學(xué)研究的重要支撐條件。墊料是構(gòu)成實驗動物微環(huán)境的重要因素，對實驗動物健康、動物實驗結(jié)果及動物福利都有著重要的影響。國內(nèi)常用的墊料主要包括刨花、鋸末、紙屑、玉米芯、棉絮、秸稈、稻草等[1]。刨花因來源廣泛、價廉易得，且質(zhì)地松軟，吸水性好，較少污染和發(fā)霉，是實驗動物最常選用的墊料[2]。由于刨花來源的樹種不同，其化學(xué)性、物理性有明顯的差別。根據(jù)我國木材資源現(xiàn)狀，經(jīng)過多年的商品化開發(fā)和實驗證明[3-5]，楊木、樺木等速生商品木材樹種，是比較理想的刨花原材料。國外如歐洲學(xué)者發(fā)現(xiàn)《實驗動物》雜志上的所有出版物，大多數(shù)歐盟作者(約90%)為嚙齒動物提供了木質(zhì)墊料。因此，木質(zhì)類仍然是歐洲最常用的墊料，且刨花因更易筑巢符合小鼠生活習(xí)性更受歡迎[6]。

目前，我省市場上使用的楊木和樺木刨花墊料主要來自北方，因市場相對較小且長途運輸?shù)脑?，?dǎo)致價格相對較高。為開發(fā)適用于貴州本地，價廉易得的實驗動物墊料，本研究以市場上比較常用的北方楊木和樺木刨花作為對照，對包括貴州本地楊木和燈臺木刨花在內(nèi)的4種刨花進(jìn)行吸水性能實驗、干燥性實驗、升溫實驗、降溫實驗，對小鼠的急性毒性實驗和適應(yīng)性實驗。研究結(jié)果可為開發(fā)貴州本地楊木和燈臺木刨花作為實驗動物墊料提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 墊料 貴州楊木刨花，燈臺木刨花，北方楊木刨花，樺木刨花，均來自貴州億科達(dá)生物技術(shù)有限公司[SCXK(黔)2021-0001]。

1.1.2 實驗動物 選擇6周齡SPF級KM小鼠24只，雌雄各半，用于對4種刨花的適應(yīng)性觀察實驗。選擇4周齡SPF級KM小鼠40只，雌雄各半，按性別隨機(jī)分為貴州楊木刨花、燈臺木刨花、北方楊木刨花和樺木刨花4個組，用于這4種刨花的急性毒性實驗。所有小鼠均來自遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黔)2021-0002；實驗動物使用許可證號：SYXK(黔)2021-0004。

1.1.3 儀器設(shè)備 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司型號：DHG-9240A，電子天平購自上海蒲春計量儀器有限公司型號：JA3001，溫度計購自武強(qiáng)縣威爾儀表廠，燒杯購自四川蜀科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 吸水性能實驗 取4種刨花墊料各6份，分別緩慢裝進(jìn)一次性塑料杯中使之自然沉積，將空塑料杯和裝滿墊料的塑料杯分別稱重記錄；然后用孔徑為2.0 mm×2.0 mm的醫(yī)用脫脂紗布封閉杯口后扎緊，緩緩放入裝有蒸餾水的盆子中，使其完全浸泡，60 min后倒置塑料杯于網(wǎng)架上自然瀝干，用濾紙將杯子外表面殘留的水吸干，分別稱重裝有墊料的塑料杯并計算各自的吸水率。吸水率用每克墊料吸水克數(shù)來表示。實驗室條件為：溫度24～28℃，相對濕度45%～60%。

吸水率=(吸水后刨花總重-刨花初重)/刨花初重

1.2.2 干燥試驗 將4種刨花用1L的燒杯裝滿放入干燥箱內(nèi)烘干至恒重后，將空燒杯和裝滿墊料的燒杯分別稱重記錄，然后放入裝有蒸餾水的盆子中吸水30 min后取出，吸水后用濾紙將杯子殘留的水吸干，稱重記錄吸水后裝滿墊料的燒杯總質(zhì)量，放于同一自然環(huán)境的實驗臺上。并在之后7 d內(nèi)每隔24 h對吸水后裝滿墊料的燒杯稱重一次，共稱重7次并計算4種刨花的干燥度，干燥度表示吸水后干燥的百分比。干燥實驗重復(fù)做3次，最后干燥度取3次平均值。

干燥度(%)=(吸水后刨花總質(zhì)量-記錄時濕刨花質(zhì)量)/(吸水后刨花總質(zhì)量-烘干刨花質(zhì)量)×100%

1.2.3 升溫實驗 將4種刨花用1L的燒杯裝滿放入干燥箱內(nèi)，干燥箱的溫度設(shè)置為100 ℃，用溫度計記錄燒杯內(nèi)溫度變化，溫度計探頭位于刨花的中間位置不能觸壁，打開升溫開關(guān)后記錄不同時間段刨花的升溫情況。分別在3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、60、90、120 min記錄。升溫實驗重復(fù)做3次，最后數(shù)據(jù)取3次平均值。

1.2.4 降溫實驗 將4種刨花用1L的燒杯裝滿放入干燥箱升至同一溫度，將刨花從干燥箱中拿出，用溫度計記錄燒杯內(nèi)溫度變化，溫度計探頭位于刨花的中間位置不能觸壁，放于同一自然環(huán)境中，記錄不同時間刨花的降溫情況。分別在3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、60、75、90 min記錄。降溫實驗重復(fù)做3次，最后數(shù)據(jù)取3次平均值。

1.2.5 適應(yīng)性觀察實驗 將650 mm×450 mm×500 mm的自制鼠盒分隔成完全相同的4個小室，各相鄰的小室都開有一小孔(小孔能使小鼠自由通過)。鼠盒放置在安靜、無外界干擾的實驗室內(nèi)，在盒子的4小室分別放置4種刨花。將24只KM小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為4組后分別放入鼠盒的4個小室。記錄不同時間段鼠盒4個小室內(nèi)小鼠的數(shù)量，根據(jù)記錄判斷小鼠對不同刨花墊料的適應(yīng)性。評價墊料適應(yīng)性，可以根據(jù)小鼠在不同墊料盒子內(nèi)停留的時間以及睡眠時間長短，來判斷小鼠對不同墊料的適應(yīng)性[7]。

1.2.6 急性毒性實驗 刨花水提取物的制備：將4種刨花分別稱取40 g，加入600 mL蒸餾水浸泡30 h，所得的濾液加熱濃縮至80 mL，使溶液濃度為0.5 g/mL，放入4℃冰箱備用。

選擇4周齡SPF級KM小鼠40只，雌雄各半，按性別隨機(jī)分為貴州楊木刨花、燈臺木刨花、北方楊木刨花和樺木刨花4個組，每組10只。用上述制備好的刨花水提取物原液按20 mL/kg劑量(相當(dāng)于生藥10 g/kg)對小鼠進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d，期間給予小鼠正常飲食和自由飲水，每天對小鼠進(jìn)行稱重記錄體質(zhì)量變化情況，并詳細(xì)檢查小鼠是否出現(xiàn)中毒癥狀及死亡情況等，據(jù)此判斷刨花對小鼠是否具有毒性作用。安全性包括一般毒性檢測，一般進(jìn)行墊料水浸出物的急性毒性實驗?？梢杂媒鑫飳嶒瀯游镞M(jìn)行灌胃試驗，觀察動物狀態(tài)和體質(zhì)量變化情況，確定墊料對實驗動物是否有毒性作用[8]。

2 結(jié)果

2.1 吸水性實驗 4種刨花吸水前的質(zhì)量范圍基本相同，但是浸泡相同時間后，北方楊木刨花的吸水性最好，燈臺木刨花和貴州本地楊木刨花吸水性能力相差不大，樺木刨花的吸水性最低(見表1)。4組墊料之間方差分析結(jié)果為：F值為31.051，P值為0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，對4組刨花墊料做事后LSD多重比較，其中北方楊木刨花與樺木刨花之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，北方楊木刨花的吸水性極顯著高于樺木刨花的吸水性。貴州本地楊木刨花與樺木刨花之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。貴州本地楊木刨花的吸水性顯著高于樺木刨花的吸水性。燈臺木刨花與樺木刨花、貴州本地楊木刨花的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 4種刨花的吸水率

aa：與燈臺木組相比較,P<0.01; cc：與貴州本地楊木組相比較，P<0.01; dd：與樺木組相比較,P<0.01; d：與樺木組相比較,P<0.05。

表2 不同時間4種刨花干燥度

表3 不同時間4種刨花升溫情況

表4 不同時間4種刨花降溫情況

表5 KM小鼠對4種刨花的適應(yīng)性

表6 KM小鼠對4種刨花的適應(yīng)性

表7 4種刨花浸出液對KM雄鼠體質(zhì)量的影響

表8 4種刨花浸出液對KM雌鼠體質(zhì)量的影響

3 討論

木材刨花、鋸末、再生紙、玉米芯、秸稈、蒲草、蘆葦、稻谷殼、稻草等多達(dá)幾十種材料均可用作實驗動物墊料，各種墊料在使用過程中各有優(yōu)缺點。蒲草的吸水性、吸氨性和保暖性高于玉米棒芯[9-10]，小鼠在極端(饑餓)狀態(tài)下嚼食少量蒲草墊料以及水提取物對其灌胃均不引起中毒[11]；對小鼠生長繁殖都沒有影響[12]。蘆葦?shù)亩拘缘汀⑽詮?qiáng)、適應(yīng)性好，動物生長發(fā)育及繁殖型性能良好[13]。但是蒲草和蘆葦畢竟來源有限，分布局限，難以作為商品化墊料大面積推廣。谷殼的保溫性能和動物適應(yīng)性較好[14]，但谷殼的吸水性差、容易長霉且不易保存，易于粘附在皮毛上，影響動物美觀；稻草具有在南方易收集、成本低、易保存、動物適應(yīng)性好等特點[14]，但稻草容易被動物的排泄物污染腐壞，表面附著的塵埃也較多，難免也會有不同程度的農(nóng)藥殘留。并且稻草質(zhì)地較硬容易刺傷幼鼠的皮膚，作為墊料前必須進(jìn)行二次加工[15]。玉米秸作為墊料時，SD大鼠能保持較高的繁殖性能，可以作為大鼠墊料使用[16]。麥秸和玉米秸稈經(jīng)過裁切、滅菌處理后用于實驗動物墊料，具有成本低廉、吸濕性好、無毒等優(yōu)點[17]。但玉米秸和麥秸受到加工工藝影響，經(jīng)過簡單裁切后質(zhì)地依舊較硬，塵屑較多，微生物難以控制，同時難免也會有不同程度的農(nóng)藥和重金屬(砷、鎘、鉛和汞)的殘留和超標(biāo)，因此商品化推廣使用價值并不高[18]。麥糠吸水性良好，對KM小鼠生長發(fā)育無不良影響，對實驗動物無毒性[19]。但是麥糠作為墊料難免有農(nóng)藥殘留，且分布局限，難以大范圍推廣。有人將麥秸進(jìn)行爆破處理，發(fā)現(xiàn)處理后的麥秸纖維疏松、柔軟，其保溫性和吸濕、吸氨性能均較好，很適合于嚙齒類大小鼠生長繁殖[18]，但是這種處理后的新型實驗動物墊料成本較高，工序復(fù)雜。在研究評估墊料選擇的福利成本的實驗中發(fā)現(xiàn)，刨花類墊料能減少老鼠的打斗行為[20]。在楊木刨花與木屑墊料的研究中發(fā)現(xiàn)，刨花墊料的繁殖效率顯著提高，且價格比木屑便宜，在育種差的品系中，刨花墊料比起木屑墊料是更好的選擇[21]。大量研究和實踐表明，速生商品闊葉類木材如楊木、樺木等加工的刨花因來源廣泛、價廉易得，能減少打斗行為，無毒性作用，且質(zhì)地松軟，吸水性好，較少污染和發(fā)霉，成為實驗動物最合適、也最常用的墊料來源。

目前，供應(yīng)貴州市場的實驗動物墊料均以來源于北方的楊木和樺木刨花為主，因市場相對較小且長途運輸?shù)脑?，?dǎo)致其價格相對較高。為開發(fā)適用于貴州本地，價廉易得的實驗動物墊料，本研究首次檢測了貴州本地楊木和燈臺木刨花的物理特性以及對小鼠的適應(yīng)性和安全性。實驗結(jié)果顯示，北方楊木刨花的吸水性最好，貴州本地楊木刨花和燈臺木刨花次之，樺木刨花最差，說明貴州本地楊木刨花和燈臺木刨花的吸水性處于貴州市場上常用的北方楊木和樺木之間，符合貴州市場的性能需求。實驗結(jié)果顯示，本實驗所用4種刨花墊料對小鼠均無毒性作用，且急性毒性MTD均大于10 g/kg，都大于一般最大給藥量(5 g/kg)，說明貴州本地楊木刨花和燈臺木刨花無明顯中毒癥狀不會導(dǎo)致小鼠發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，且MTD較高。實驗結(jié)果顯示，4種刨花墊料的升溫曲線、降溫曲線、干燥性能以及對動物體質(zhì)量增長的影響的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。貴州本地楊木刨花和燈臺木刨花與貴州市場常用的墊料在保溫，隔熱，干燥和動物生長等方面大致相同。實驗結(jié)果顯示，貴州本地楊木刨花的動物適應(yīng)性最好，燈臺木刨花與北方楊木刨花的動物適應(yīng)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明小鼠對燈臺木刨花與北方楊木刨花喜愛度大致相同，使用貴州本地楊木刨花更符合動物福利概念。

本次實驗結(jié)果表明貴州本地楊木和燈臺木刨花均可用作實驗動物墊料，貴州本地楊木刨花的動物適應(yīng)性最好，說明其具有更好的開發(fā)價值。