基于α-synuclein表達(dá)探討七氟烷對(duì)小鼠樹突棘狀態(tài)與學(xué)習(xí)記憶功能的影響

閻 晨,劉 濤,宣 斐

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 麻醉與圍手術(shù)期醫(yī)學(xué)中心，新疆 烏魯木齊 830000)

隨著生命醫(yī)學(xué)和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多疾病有機(jī)會(huì)通過全身麻醉后手術(shù)進(jìn)行修復(fù)。然而，無論嚙齒類還是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，多數(shù)臨床前實(shí)驗(yàn)都已證明，全身麻醉會(huì)造成認(rèn)知功能損傷[1]。七氟烷是一種臨床常用麻醉劑，其優(yōu)勢(shì)包括起效快、效能高、可控性強(qiáng)及血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定[2]?；仡櫺匝芯糠治鲲@示，幼齡兒童接受七氟烷全身麻醉會(huì)增加其成年后讀寫功能損害的風(fēng)險(xiǎn)[3]。此外，在成年患者中，七氟烷麻醉也會(huì)造成短期或長(zhǎng)期的認(rèn)知功能損傷[4]。而在老齡患者中，全身麻醉手術(shù)則是老年癡呆發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[5]。大腦海馬組織是機(jī)體認(rèn)知與學(xué)習(xí)中心，神經(jīng)元樹突是信息儲(chǔ)存記憶的生理基礎(chǔ)。α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是廣泛存在于海馬神經(jīng)元中突觸蛋白，當(dāng)α-Syn過量表達(dá)時(shí)會(huì)異常聚集，形成神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)元樹突棘可塑性降低，導(dǎo)致學(xué)習(xí)認(rèn)知功能降低[6]?，F(xiàn)階段，已有不少研究討論七氟烷對(duì)患者學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的影響機(jī)制[7]，但針對(duì)α-Syn介導(dǎo)的樹突棘可塑性降低鮮有報(bào)道。因此，本研究擬從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面探討七氟烷對(duì)小鼠樹突棘結(jié)構(gòu)與學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只野生型(Wild-type,WT)C57BL/6J 雄性小鼠與16只α-synuclein基因敲除(α-syn knockout,KO)C57BL/6J 雄性小鼠，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。所有動(dòng)物體質(zhì)量為23～28 g，年齡8～10周，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房中，室內(nèi)溫度控制23～25 ℃，濕度控制為60%～70%，12 h/12 h晝夜節(jié)律。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 七氟烷(上海艾伯維公司)；HT22細(xì)胞株(上海賽百慷生物技術(shù)公司)；高爾基染色試劑盒(美國(guó)HitoBiotec公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物公司)；外源性腦源性生長(zhǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，美國(guó)Sigma公司)；MTT噻唑藍(lán)粉末(Thiazolyl blue tetrazolium bromide，北京索萊寶生物公司)；Morris水迷宮(北京眾實(shí)迪創(chuàng)公司)；ZH-MZJ型小動(dòng)物麻醉機(jī)(安徽正華生物儀器公司)；Duo Link 鄰位連接檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；兔源Anti-synuclein抗體(美國(guó)abcam公司)；鼠源Anti-TrkB(美國(guó)abcam公司)；兔源Anti-p-TrkB(沈陽萬類生物公司)；兔源Anti-TrkB(沈陽萬類生物公司)；鼠源Anti-β-actin(沈陽萬類生物公司)。

1.3 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建 所有動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為WT對(duì)照組(WT Control)，KO對(duì)照組(KO Control)，WT+七氟烷(WT+Sev)組，KO+七氟烷(KO+Sev)組，每組8只。自制一個(gè)60 cm×30 cm×25 cm的透明麻醉盒，兩側(cè)設(shè)有進(jìn)氣口與出氣口。將WT+Sev組與KO+Sev組小鼠放入麻醉盒中，進(jìn)氣口與麻醉機(jī)相連，出氣口連接氣體檢測(cè)儀。通過麻醉機(jī)將空氣混合3%七氟烷自進(jìn)氣口輸入至麻醉盒中，麻醉過程中控制溫度為37 ℃，持續(xù)6 h。WT Control組與KO Control組小鼠吸入空氣。次日，待所有小鼠蘇醒后進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。

1.4 Morris水迷宮訓(xùn)練與測(cè)試Morris 水迷宮測(cè)試裝置主體是一個(gè)圓柱體水箱，直徑120 cm，高50 cm。水箱中注入約40 cm深水，設(shè)置水溫條件為恒溫24 ℃，并使用白色淀粉鋪滿水底，水箱中固定一個(gè)水面以下1.5 cm的逃生平臺(tái)，水箱周圍固定一些幾何圖形，幫助小鼠確認(rèn)方向。水箱上裝有一個(gè)攝像機(jī)記錄小鼠游泳圖像并將數(shù)據(jù)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)上進(jìn)行軌跡分析。計(jì)算機(jī)將水面分為四個(gè)象限，設(shè)置存在逃生平臺(tái)的象限為第一象限，順時(shí)針設(shè)為第二現(xiàn)象，第三象限和第四象限。將小鼠從任意象限放到水池中，讓它們自由游泳直到登上平臺(tái)，設(shè)置自由尋找時(shí)間為90 s，90 s內(nèi)未登上平臺(tái)則引導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s。每天重復(fù)4次，訓(xùn)練4 d。分析小鼠潛伏期，平均速率和平均距離。結(jié)束訓(xùn)練后2 d，將小鼠自第三象限丟入水中，撤去逃生平臺(tái)，記錄小鼠逃避潛伏期，穿越平臺(tái)次數(shù)與在第一象限中停留時(shí)間(靶象限)。

1.5 電生理場(chǎng)電位記錄 將小鼠的大腦小心地取出放置在冷卻的人工腦脊髓液緩沖液中，緩沖液包括124 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1 mM MgSO4、1.25 mM KH2PO4和10 mM D-葡萄糖，通入95%O2和5%CO2。冰凍后將腦組織切成300 nm厚的切片，并在人工腦脊液緩沖液中孵育2 h。用金屬探針將腦切片固定在8×8陣列微電極室中，并使用MED64 Mobius微電極陣列系統(tǒng)(Microelectrode array system,MEA)記錄長(zhǎng)期增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)。測(cè)試刺激強(qiáng)度位于DG區(qū)域，并根據(jù)I / O(輸入/輸出)曲線設(shè)置為引起最大場(chǎng)興奮性突觸后電位(Field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)響應(yīng)的30%(或50%)。20 min后，記錄基線，并通過重復(fù)3次的100 Hz高頻刺激誘導(dǎo)LTP，并在另外60 min內(nèi)記錄fEPSP斜率變化，記為長(zhǎng)時(shí)程電位(Long-term potentiation,LTP)。

1.6 高爾基染色與計(jì)數(shù) 按照HitoBiotec公司生產(chǎn)的Hito Golgi-Cox Optimstain Kit 高爾基染色試劑盒中說明書步驟進(jìn)行處理。取小鼠腦組織，浸沒于試劑盒中溶液1與溶液2混合液中(提前24 h配置)，次日跟換混合液，室溫避光保存2周。取組織洗去混合液，浸入溶液3中，避光儲(chǔ)存24 h，更換溶液再放置4 d。取組織放入預(yù)冷的異戊烷中冷凝成塊，擦去表面異戊烷。使用冰凍切片及切成約100 μm切片，載玻片貼片后避光陰干。玻片置入溶液4與溶液5混合液中反應(yīng)，結(jié)束后蒸餾水沖洗，切片放入梯度乙醇中脫水，每次60 s，再以二甲苯溶液透化組織，每次2 min。最后使用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察捕獲圖像，以神經(jīng)元樹突棘密度反映神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 取小鼠海馬組織大腦，放于冰盒上，全程維持低溫環(huán)境，稱重后根據(jù)重量加入RIPA裂解液。使用勻漿機(jī)充分勻漿10 min，結(jié)束后冰浴充分裂解30 min，離心機(jī)預(yù)冷4 ℃，調(diào)至12 000 rpm，離心30 min，精確記錄體積，檢測(cè)蛋白濃度，加入溴酚藍(lán)上樣緩沖液。將樣品放入100 ℃金屬浴中煮沸5 min，待冷卻后冰箱冷凍保存。配置SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，每一泳道上樣50 μg，設(shè)置電泳條件60 V，30 min，90 V，100 min，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)，停止電泳，根據(jù)分子標(biāo)記物切取所需蛋白范圍的凝膠，剪取與凝膠大小相似的PVDF膜，選擇濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法，設(shè)置條件恒流300 mA，60 min。取出PVDF膜，4%脫脂牛奶中，室溫孵育1 h。洗凈牛奶后，將PVDF膜放入對(duì)應(yīng)一抗溶液中，4 ℃條件下孵育過夜。次日取出條帶漂洗，加入HRP標(biāo)記的二抗稀釋液，搖床上避光孵育1 h。PBST漂洗條帶后，加入配好的ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)下顯影，保存圖像，最終使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)與活率 檢測(cè)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加100 μg/mL鏈霉素與100 U/mL盤林西林，培養(yǎng)條件為37 ℃培養(yǎng)箱中通入5% CO2。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合，胰酶消化細(xì)胞，等量接種于96孔板中，設(shè)組為對(duì)照組(Control)，七氟烷組(Sev)，80 ng/mL腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組(BDNF 80 ng/mL)，七氟烷+40 ng/mL腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組(Sev+BDNF 40 ng/mL)，七氟烷+80 ng/mL腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組(Sev+BDNF 80 ng/mL)。七氟烷組暴露于含2%七氟烷環(huán)境中2 h，隨后添加BDNF，在正常培養(yǎng)環(huán)境中孵育24 h。次日取出96孔板，棄去上清，每孔添加50 μL 5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h。取出96孔板，每孔添加100 μL DMSO溶液，充分震蕩10 min使甲臜充分溶解，在570 nm激發(fā)波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值。

1.9 α-synuclein與TrkB的鄰位 連接(Proximity Ligation Assay,PLA)檢測(cè)根據(jù)DuoLink廠家提供說明書進(jìn)行細(xì)胞處理操作。將步驟1.8中培養(yǎng)于96孔板中的細(xì)胞PBS漂洗后加入兔源Anti-α-Synuclein與鼠源Anti-TrkB抗體孵育2 h。PBS漂洗樣本后加入正鏈PLA探針識(shí)別鼠源抗體和負(fù)鏈標(biāo)記的PLA探針識(shí)別兔源抗體，共同孵育1 h。PBS漂洗樣品并加入連接酶，孵育1 h，DAPI染色液37 ℃避光孵育15 min。PBS漂洗樣品，加入擴(kuò)增緩沖液，使用熒光顯微鏡對(duì)每個(gè)細(xì)胞中紅色點(diǎn)信號(hào)進(jìn)行記錄，最后使用Duolink成像工具對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 七氟烷對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響 為了探究在α-synuclein存在情況下，七氟烷對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，本研究測(cè)試了Morris實(shí)驗(yàn)中小鼠的空間參考記憶。如圖1、表1所示，訓(xùn)練期間，WT Control組與KO Control組在逃避潛伏期沒有顯著性差異(P>0.05)。與此同時(shí)，如表2所示，測(cè)試期間，WT Control組與KO Control組在逃避潛伏期，穿越平臺(tái)次數(shù)和靶象限停留時(shí)間之間都不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。然而，與Control組相比，七氟烷吸入麻醉的小鼠訓(xùn)練期間逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)，在測(cè)試中，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)，靶象限停留時(shí)間顯著增加(P<0.05)。此外，KO+Sev組小鼠Morris水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于WT+Sev組小鼠，且測(cè)試中逃避潛伏期兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 訓(xùn)練期間小鼠逃避潛伏期

表1 訓(xùn)練期間小鼠逃避潛伏期統(tǒng)計(jì)

表2 測(cè)試期間小鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)與靶象限停留時(shí)間統(tǒng)計(jì)

2.2 七氟烷對(duì)小鼠海馬 CA3-CA1途徑長(zhǎng)時(shí)程電位與樹突棘狀態(tài)的影響如圖2、3所示，腦組織電生理檢測(cè)中興奮性突觸后電位(fEPSP)斜率常作為觀察LTP變化的指標(biāo)。WT Control組小鼠與KO Control組小鼠海馬組織CA1-CA3途徑中LTP沒有差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，七氟烷造成小鼠fEPSP斜率顯著降低(P<0.05)，此外，與WT+Sev組相比，KO+Sev組小鼠fEPSP斜率降低，且存在顯著性差異(P<0.05)。高爾基染色樹突棘密度能夠反映樹突棘的可塑性，與LTP結(jié)果一致，WT Control組與KO Control組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度較高且沒有顯著差異，但七氟烷吸入麻醉造成小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度降低。

#：與Control組比較， P<0.05；*：與WT+Sev組比較， P<0.05。

2.3 七氟烷對(duì)小鼠海馬組織中α-synuclein、BDNF與p-TrkB的影響 如圖4所示，本研究中使用小鼠為WT小鼠與KO小鼠，因此，α-synuclein KO小鼠基本不表達(dá)α-synuclein，WT Control組小鼠正常表達(dá)α-synuclein。七氟烷吸入則顯著增加了小鼠腦組織中α-synuclein表達(dá)(P<0.05)。此外，本研究中，與Control組相比，七氟烷給藥顯著降低了小鼠海馬中BDNF表達(dá)(P<0.05)，降低了TrkB磷酸化水平(P<0.05)。與此同時(shí)，與WT+Sev組相比，KO+Sev組小鼠腦組織中BDNF與TrkB表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

#：與Control組比較， P<0.05。

#：與Control組比較， P<0.05；*：與WT+Sev組比較， P<0.05。

2.4 外源性BDNF對(duì)七氟烷干預(yù)的HT22細(xì)胞活率的影響 如圖5所示，與對(duì)照組相比，七氟烷造成HT22細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，而外源性BDNF干預(yù)則促進(jìn)了HT22細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.05)。與此同時(shí)，細(xì)胞體系中添加外源性BDNF能夠顯著提高HT22細(xì)胞活率(P<0.05)，且具有劑量依賴性。

#：與Control組比較， P<0.05；*：與Sev組比較， P<0.05。

2.5 外源性BDNF對(duì)HT22細(xì)胞中α-Syn與TrkB鄰位結(jié)合的影響 如圖6所示，對(duì)照組與BDNF(80 ng/mL)組HT22細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到α-Syn與TrkB的鄰位結(jié)合。與對(duì)照組相比，七氟烷造成HT22細(xì)胞中α-Syn與TrkB鄰位結(jié)合較多，然而，外源性BDNF干預(yù)則顯著減少了α-Syn與TrkB結(jié)合，且結(jié)果呈劑量依賴性。

A：Control組；B：Sev組；C：BDNF(80 ng/mL)組；D：Sev+BDNF(40 ng/mL)組；E：Sev+BDNF(80 ng/mL)組；紅色點(diǎn)表示α-Syn與TrkB結(jié)合；#：與Control組比較， P<0.05；*：與Sev組比較， P<0.05。

3 討論

本研究重點(diǎn)論證了小鼠吸入七氟烷麻醉會(huì)提高海馬組織中α-synuclein(α-Syn)表達(dá)，降低BDNF表達(dá)，且α-Syn會(huì)與BDNF競(jìng)爭(zhēng)TrkB受體，干擾TrkB信號(hào)傳導(dǎo)，造成長(zhǎng)時(shí)程電位(Long-term potentiation,LTP)抑制與樹突棘可塑性損傷，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。

Morris水迷宮訓(xùn)練與測(cè)試是研究嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)功能的首要實(shí)驗(yàn)方法[8]。本研究中，WT Control組與KO Control組中兩種不同表型小鼠在空間記憶方面表現(xiàn)相似，沒有差異。然而，七氟烷吸入麻醉卻會(huì)造成WT小鼠與KO 小鼠在空間記憶與獲取信息方面，與對(duì)照組相比，表現(xiàn)變差。因此，七氟烷麻醉是造成小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力損傷的原因。與此同時(shí)，水迷宮訓(xùn)練與測(cè)試中，部分結(jié)果顯示KO+Sev組小鼠優(yōu)于WT+Sev組小鼠，提示敲除α-synuclein在一定程度上能夠緩解七氟烷造成的小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷。

LTP的形成被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶過程中潛在的細(xì)胞機(jī)制[9]。本研究結(jié)果顯示，正常情況下，敲除α-Syn不影響LTP。這可能是因?yàn)長(zhǎng)TP主要是由于CA3-CA1途徑中突觸后電位機(jī)制引起的，但是α-Syn對(duì)突觸傳遞的影響主要是突觸前，因此，KO Control組小鼠海馬CA3-CA1途徑中LTP與WT Control組小鼠沒有差異。然而，α-Syn過量表達(dá)卻會(huì)造成神經(jīng)毒性。α-Syn廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中，位于突觸小泡附近的突觸前末端。近期研究顯示，α-Syn在阿爾茲海默病研究中會(huì)增強(qiáng)Aβ蛋白分泌，上調(diào)淀粉樣前體蛋白表達(dá)的同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。此外，α-Syn的表達(dá)增加，在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中造成炎癥反應(yīng)，從而抑制LTP的形成，導(dǎo)致小鼠空間記憶功能的退化[11]。因此，本研究中，與文獻(xiàn)報(bào)道相似，七氟烷造成α-Syn表達(dá)增加，造成小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性降低，導(dǎo)致LTP抑制。然而，與WT+Sev組相比，KO+Sev組小鼠海馬神經(jīng)元LTP顯著升高，提示α-Syn表達(dá)升高是造成LTP抑制的重要原因。

與LTP密切相關(guān)的是神經(jīng)元突觸可塑性。神經(jīng)元是信息接納、加工與整合的基本單位。樹突棘是神經(jīng)元樹突上棘狀突起，與電信號(hào)接收和傳遞密切關(guān)聯(lián)，且樹突棘密度往往與信息傳遞速率相關(guān)[12]。與此同時(shí)，樹突棘的形成、脫落、擴(kuò)張和萎縮與突觸可塑性相關(guān)，樹突棘的高度可塑性是腦內(nèi)神經(jīng)元發(fā)揮學(xué)習(xí)記憶功能的生理基礎(chǔ)[13]。因此，本研究中顯示的七氟烷介導(dǎo)的小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度降低是導(dǎo)致小鼠Morris水迷宮中空間記憶能力衰退的重要原因。

海馬組織作為大腦長(zhǎng)期學(xué)習(xí)與記憶核心區(qū)域，也是七氟烷吸入麻醉過程中最敏感的區(qū)域。海馬組織中BDNF是學(xué)習(xí)與記憶涉及的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的關(guān)鍵分子[14]。通過檢測(cè)小鼠海馬組織中BDNF相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，七氟烷造成小鼠海馬組織中BDNF與p-TrkB表達(dá)顯著降低，且α-Syn敲除小鼠在七氟烷干預(yù)后，與WT+Sev組小鼠比較，BDNF與p-TrkB表達(dá)顯著升高。溯其原因是七氟烷造成BDNF表達(dá)降低，BDNF作用機(jī)理是通過原肌球蛋白激酶受體B(Tropomyosin kinase receptor B,TrkB)起作用。BDNF與TrkB的結(jié)合通過其胞內(nèi)域中酪氨酸殘基的構(gòu)象變化發(fā)生磷酸化，激活有絲分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和磷脂酶C-γ1(Phospholipase C-γ1,PLC-γ1)觸發(fā)其二聚化信號(hào)通路，介導(dǎo)神經(jīng)元分化，提高神經(jīng)元存活和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[15]。此外，當(dāng)α-Syn過度表達(dá)時(shí)，α-Syn會(huì)與BDNF選擇性競(jìng)爭(zhēng)TrkB受體，從而抑制BDNF-TrkB信號(hào)通路，抑制神經(jīng)元分化并導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[16]。本研究中，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證了外源性BDNF能夠有效改善七氟烷造成的HT22細(xì)胞死亡。與此同時(shí)，本研究通過鄰位連接實(shí)驗(yàn)證實(shí)了α-Syn與BDNF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TrkB位點(diǎn)。

綜上所述，七氟烷會(huì)造成小鼠認(rèn)知功能損傷，其機(jī)理是通過增加α-Syn表達(dá)，下調(diào)BDNF水平，減少TrkB磷酸化，從而降低海馬CA1區(qū)樹突棘可塑性，抑制長(zhǎng)時(shí)程電位從而造成小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷。