慢性阻塞性肺疾病小鼠外周血和BALF中CD83、Th17/Treg細胞的表達及意義

張 婧，張?zhí)m英，歐陽瑤

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科,貴州 遵義 563099)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種由多種因素引起的以氣流受限為特征的慢性炎癥性肺疾病[1]。目前，全球COPD患者已達2.994億人[1]。據報道，2017年有320萬人死于COPD，已成為全球第三大致死疾病[1]。雖然研究報道吸煙是COPD最主要的和最常見的危險因素，但COPD發(fā)生的具體機制仍不十分清楚。因此，進一步探討COPD發(fā)生的具體機制，對COPD的防治有重要的臨床價值。

研究發(fā)現CD4+T淋巴細胞參與的免疫炎癥反應在COPD的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的調控作用[2]。CD4+T淋巴細胞包括輔助性T細胞1(T helper 1，Th1)、Th2、Th17、調節(jié)性T細胞(T regulatory,Treg)和濾泡輔助性T細胞。Th17細胞主要分泌白介素-17(Interleukin-17，IL-17)等細胞因子促進炎癥反應[3]。Treg細胞通過分泌IL-10等細胞因子以達到抑制炎癥反應的目的[3]。叉頭狀轉錄因子3(Forkhead box protein 3，FOXP3)可調控Treg細胞生長和分化，是鑒定Treg細胞最可靠的生物標記物[4]。在生理狀態(tài)下，Treg細胞和Th17細胞處于動態(tài)平衡以維持免疫穩(wěn)態(tài)。然而，在病理狀態(tài)下，Th17/Treg細胞平衡失調則可導致免疫炎癥疾病的發(fā)生。研究報道Th17/Treg細胞失衡可能參與COPD的形成[5]。

樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是一種由骨髓樣干細胞和淋巴樣干細胞分化而來的抗原提呈細胞[6]。DC通過刺激初始T細胞，使T細胞向Th17細胞分化或抑制Treg細胞產生，進一步參與不同類型的免疫反應[6]。DC包括未成熟DC(Immature DC，iDC)和成熟DC(Mature DC，mDC)。CD83是mDC的特征性標記物，在mDC執(zhí)行抗原提呈和活化T細胞的過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。CD1a是iDC的特征性標記物[8]。iDC通過誘導Treg細胞生成，從而在維持外周和中樞免疫耐受過程中發(fā)揮重要的作用[9]。研究發(fā)現DC參與了COPD的發(fā)生發(fā)展[10]，但其具體機制尚未完全明確。

本研究采用煙熏的方法建立COPD小鼠模型，通過流式細胞儀檢測小鼠外周血和支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中CD83、Th17細胞和Treg細胞的表達情況，從而進一步探討COPD發(fā)生發(fā)展中的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 26只6～8周齡C57BL/6小鼠(SPF級、雌雄不限、體重約20～25 g)，購買于第三軍醫(yī)大學動物實驗中心。

1.2 實驗試劑 黃果樹牌香煙(焦油量：11 mg；煙氣煙堿量：0.9 mg；煙氣一氧化碳量：13 mg)購買于貴州中國工業(yè)有限責任公司；抗小鼠CD83抗體、抗小鼠CD4抗體、抗小鼠CD25抗體、抗小鼠IL-17抗體和抗小鼠FOXP3抗體均購買于eBioscience公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD小鼠模型的建立 隨機將26只C57BL/6小鼠分為對照組(Control組)(n=10)和COPD模型組(n=16)。將模型組小鼠放置于玻璃箱內，將燃燒的香煙置于玻璃箱內，使小鼠每天被動吸煙4次，6支煙/次，1 h/次，上午2次，中間間隔30 min；下午2次，中間間隔30 min，每周6 d，持續(xù)4周。Control組小鼠在正常環(huán)境下飼養(yǎng)。于實驗第28天，處死兩組小鼠，收集1mL小鼠內眥靜脈叢血液以及BALF。該研究經遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準后實施。

1.3.2 流式細胞術 檢測Th17和Treg細胞準備兩個流失專用的試管，測定管中加入需檢測分子的抗體，對照管中加入陰性對照抗體。加入樣本(外周血或BALF)，混勻后，室溫避光孵育25 min。用PBS洗滌細胞2次，于4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入200 μL的 1%多聚甲醛，混勻后，可進行上機檢測。

2 結果

2.1 兩組小鼠體重變化 從實驗開始到實驗結束，隨著時間的延長，Control組小鼠的體重呈逐漸增加的趨勢；而COPD模型組小鼠的體重呈逐漸下降的趨勢。在實驗第7、14、21、28天，與Control組相比，COPD模型組小鼠的體重均降低(P<0.05,見表1)。

表1 兩種小鼠體重變化

2.2 小鼠肺組織病理特征 兩組小鼠肺組織HE染色結果顯示：Control組小鼠肺泡結構完整，肺泡壁正常，肺泡間隔未見明顯炎性細胞浸潤(見圖1A)；COPD模型組小鼠肺泡結構破壞，大部分肺泡相互融合形成較大的肺泡腔，肺泡間隔有較多的炎性細胞浸潤(見圖1B)，提示吸入香煙煙霧可以成功構建小鼠COPD模型。

A：Control組小鼠肺泡結構完整，肺泡壁正常、連續(xù)，肺泡間隔未見明顯炎性細胞浸潤；B：COPD模型組小鼠肺泡結構破壞，大部分肺泡相互融合形成較大的肺泡腔，肺泡間隔有較多的炎癥細胞浸潤。

2.3 小鼠外周血和BALF中CD83的表達 由于CD83是mDC的特征性標記物，故采用CD83來反應mDC的含量[7]。流式細胞術結果顯示，與Control組(20.74±2.95)相比，COPD模型組小鼠外周血中CD83(8.69 ±2.28)表達顯著降低(P<0.05，見圖2A～C)。同樣，COPD模型組BALF中CD83的表達(15.06±6.19)較Control組(72.04±10.44)明顯降低(P<0.05，圖2D～F)。上述結果提示香煙煙霧可能抑制DC成熟。

A：Control組小鼠外周血CD83的表達；B：COPD模型組小鼠外周血CD83的表達；C：Control組和COPD模型組小鼠外周血CD83的表達；D：Control組小鼠BALF中CD83的表達；E：COPD模型組小鼠BALF中CD83的表達；F：Control組和COPD模型組小鼠BALF中CD83的表達；*：與Control組比較，P<0.05。

2.4 小鼠外周血和BALF中Th17細胞的表達 通過流式細胞儀檢測小鼠外周血及BALF中Th17細胞的表達，以CD4+IL-17A+細胞占總CD4+T細胞百分比表示。結果顯示，COPD模型組外周血中Th17細胞的百分比含量(4.09±0.47)較Control組(1.02±0.28)明顯增高(P<0.05，見圖3A～C)。與Control組(3.39±0.35)相比，COPD模型組BALF中Th17細胞的百分比含量(5.59±0.32)也顯著增高(P<0.05，圖3D～F)。上述結果提示Th17細胞增多可能促進COPD的發(fā)病。

通過流式細胞術檢測小鼠外周血及BALF中Th17細胞的百分比含量，用CD4+IL-17A+細胞占總CD4+T細胞百分比表示。A：Control組小鼠外周血中Th17細胞的百分比含量；B：COPD模型組小鼠外周血中Th17細胞的百分比含量；C：Control組和COPD模型組小鼠外周血中Th17細胞的百分比含量；D：Control組小鼠BALF中Th17細胞的百分比含量；E：COPD模型組小鼠BALF中Th17細胞的百分比含量；F：Control組和COPD模型組小鼠BALF中Th17細胞的百分比含量；*：與Control組比較，P<0.05。

2.5 小鼠外周血和BALF中Treg細胞的表達 設置CD4+T細胞為門控，流式細胞術檢測外周血和BALF中Treg細胞的表達，用CD4+CD25+FOXP3+細胞占總CD4+T細胞的百分比表示。結果顯示，COPD模型組小鼠外周血中Treg細胞含量(0.39±0.09)較Control組(1.09±0.44)降低(P<0.05，圖4A～C)。同樣，COPD模型組小鼠BALF中Treg細胞的含量(0.51±0.16)顯著低于Control組(2.57±0.35，P<0.05，圖4D～F)。上述結果表明Treg細胞減少可能導致COPD的發(fā)病。

設置CD4+T細胞為門控，流式細胞術檢測外周血和BALF中Treg細胞的百分比含量，用CD4+CD25+FOXP3+細胞占總CD4+T細胞百分比表示。A：Control組小鼠外周血中Treg細胞的百分比含量；B：COPD模型組小鼠外周血中Treg細胞的百分比含量；C：Control組和COPD模型組小鼠外周血中Treg細胞的百分比含量；D：Control組小鼠BALF中Treg細胞的百分比含量；E：COPD模型組小鼠BALF中Treg細胞的百分比含量；F：Control組和COPD模型組小鼠BALF中Treg細胞的百分比含量；*：與Control組比較， P<0.05。

2.6 小鼠外周血和BALF中Th17/Treg細胞的比值計算 兩組小鼠外周血和BALF中Th17細胞和Treg細胞的比值，并對其進行對比分析。結果顯示，COPD模型組小鼠外周血中Th17/Treg細胞的比值(10.86±2.62)較Control組(1.06±0.50)升高(P<0.05，見圖5)。同樣，COPD模型組小鼠BALF中Th17/Treg細胞的比值(12.05±3.61)也顯著高于Control組(1.33±0.17，P<0.05，見圖5)。上述結果提示Th17/Treg細胞失衡可能導致COPD的發(fā)病。

A:Blood;B:BALF;*：與Control組比較， P<0.05。

3 討論

COPD是一種發(fā)病率和病死率逐年升高的呼吸系統慢性疾病，其發(fā)病機制尚不清楚，尤其是其免疫機制有待進一步研究。吸煙是COPD形成的危險因素，可能引起T細胞介導的免疫反應失衡，導致COPD發(fā)生[10]。本研究發(fā)現香煙煙霧可能導致小鼠體內CD83+DC減少，Th17/Treg細胞比值增加，從而導致COPD的發(fā)生。

本課題組前期通過煙熏4周的方法成功構建了COPD動物模型[10]，因此本研究也采用此方法構建小鼠COPD模型。HE染色結果表明，煙熏4周已成功構建小鼠COPD模型。DC在啟動和維持自身免疫反應中起著重要的作用，是連接先天性和適應性免疫反應的橋梁[11]。DC是否成熟以及表面共刺激分子的表達水平可直接影響免疫反應的類型[12]。此外，DC可刺激初始T細胞，使Th細胞向Th17細胞分化并可抑制Treg細胞的產生，從而參與免疫反應[6]。本研究通過流式細胞術檢測發(fā)現COPD模型組小鼠外周血及BALF中CD83+的DC減少，提示成熟DC的減少可能參與COPD的形成。

Th17細胞通過分泌IL-17等細胞因子在自身免疫性疾病中起著促進免疫炎癥反應的作用，如銀屑病、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化癥和類風濕性關節(jié)炎等，而Treg細胞則具有抑制免疫炎癥反應的作用[13]。據報道，Th17/Treg細胞比例失衡可導致自身免疫性甲狀腺疾病[14]、哮喘[15]以及慢性牙周炎[16]等疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現COPD模型組小鼠外周血和BALF中Th17細胞增加，Treg細胞減少，Th17/Treg細胞比例增加，提示Th17/Treg細胞比例增加，可能促進COPD的發(fā)生發(fā)展。

香煙煙霧會影響DC成熟，并且抑制DC刺激初始T細胞及分泌細胞因子的能力，進而導致DC介導的免疫反應失調[17]。DC使初始T細胞分化成不同類型的T細胞亞群[18]，其分泌的IL-6是初始T細胞向Th細胞或Treg細胞分化的關鍵性因素[19]。此外，Th17細胞通過分泌細胞因子誘導DC產生IL-6，參與COPD的慢性炎癥過程[20]。本研究發(fā)現COPD模型組小鼠外周血和BALF中CD83+DC減少，即成熟DC降低，Th17/Treg細胞比例增加，提示DC可能參與Th17/Treg細胞失衡，導致COPD的形成，但其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現香煙煙霧可能抑制DC的成熟，導致Th17/Treg細胞失衡，從而參與COPD的發(fā)生發(fā)展。