基于蛋白質(zhì)組學(xué)的法醫(yī)生物物證鑒定技術(shù)探討

張 玉 張 帥 林穎悅

河南文正檢測(cè)技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450048

蛋白質(zhì)組，通俗理解為特定的條件機(jī)理中，存在于有機(jī)體中的蛋白質(zhì)種類與數(shù)量總和。對(duì)這些存在于生命體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類與數(shù)量總和進(jìn)行深入研究，包括對(duì)蛋白質(zhì)組的特性、蛋白質(zhì)組的組成結(jié)構(gòu)以及在不同的條件機(jī)理中蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律等現(xiàn)象進(jìn)行研究的學(xué)科，即為蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）。除此之外，為了研究蛋白質(zhì)組而創(chuàng)造的相關(guān)技術(shù)，也能夠被劃分至蛋白質(zhì)組學(xué)這一學(xué)科中來。

然而受制于蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定手段門檻較高，很多鑒定技術(shù)人員并未對(duì)蛋白質(zhì)組中潛藏著的遺傳學(xué)信號(hào)給以足夠的關(guān)注與深入研究，也往往忽略了蛋白質(zhì)組技術(shù)僅需一次測(cè)量即可獲取大量信息，包括全部的蛋白質(zhì)類型及其數(shù)量，同時(shí)，檢測(cè)結(jié)果中也可得出蛋白質(zhì)中的每個(gè)氨基酸序列[1]。這對(duì)于鑒定DNA缺失或DNA濃度低于限制的生物物證鑒定，具有十分特殊的重要意義。

一、蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)簡介

（一）2-DE技術(shù)

2-DE方法，即雙向凝膠電泳方法。2-DE是等電聚束電泳與SDS-PAGE的結(jié)合技術(shù)，換言之就是指攜帶有相同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)，不管其分子數(shù)量多少，在等電場(chǎng)方法的影響下最終都會(huì)在某一特殊部位聚合，然后借助SDS-PAGE方法把各種分子數(shù)量的蛋白質(zhì)分開，在電泳后再通過蛋白質(zhì)的上樣量對(duì)膠開始添加染料，經(jīng)染料上色后所得的電泳圖是一個(gè)二維分布式的蛋白質(zhì)圖像，通過存儲(chǔ)凝膠圖像可以獲得蛋白質(zhì)定性與定量信號(hào)，使用圖像解析軟件可以分析蛋白質(zhì)傳遞的各種基因信號(hào)。由于傳統(tǒng)的2-DE技術(shù)普遍存在膠和膠之間的重復(fù)性不佳的弊端，在此技術(shù)發(fā)展上，2D-DIGE，即雙向差異凝膠電泳法的問世十分有效地克服了這一不足。因?yàn)?D-DIGE能夠從同一張雙向電泳膠中分離出來數(shù)種熒光標(biāo)記的樣本，且首次在2D-DIGE中引進(jìn)了內(nèi)標(biāo)的概念，使其在蛋白質(zhì)定量上的結(jié)果更為精準(zhǔn)。

（二）MS技術(shù)

MS技術(shù)，即質(zhì)譜技術(shù)。MS技術(shù)以其高度特異性、高靈敏度、高智能化的多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)識(shí)別中。因?yàn)殚L鏈大化合物是不能直接被質(zhì)譜篩選出的，因此必須利用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分割，將其分割成較小的肽段，所用的蛋白質(zhì)酶多為胰酶（Trypsin），Trypsin的特點(diǎn)在于，其能夠在賴氨酸和精氨酸殘基后，完成肽鍵的切斷。而蛋白質(zhì)譜技術(shù)，其基本原理即借助蛋白酶消化蛋白質(zhì)后得到的肽片段混合物，通常情況下，由蛋白質(zhì)酶斷開的蛋白質(zhì)片段上的氨基酸個(gè)數(shù)在14個(gè)左右，完成全部的酶切流程大概需要耗費(fèi)10個(gè)小時(shí)。最新的一項(xiàng)將胰酶固定于液象學(xué)色譜分析法上的技術(shù)，則能夠更快地完成全部的酶切流程。上述步驟完成之后，然后在質(zhì)譜儀上產(chǎn)生充能電離，再經(jīng)由質(zhì)譜分析儀和探測(cè)器的分析與檢測(cè)之后，將特定的質(zhì)量質(zhì)荷之比（m/z）進(jìn)行分散和收集，然后再利用質(zhì)量分析儀分析得到每個(gè)肽片段的m/z，最終能夠制成蛋白質(zhì)的一級(jí)質(zhì)譜峰圖。

目前，運(yùn)用得最多的蛋白質(zhì)組離子化方法為ESI技術(shù)，即電噴霧離子化，是利用電噴霧電離的離子源使肽段離子化，在第一級(jí)質(zhì)譜掃描色譜柱分離出來的全部成分，在第二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中選取幾個(gè)豐度較高的峰，加以依次分開，并標(biāo)記它們的第二級(jí)斷裂質(zhì)譜。全部步驟不超過一秒鐘，在全部色譜分離步驟中重復(fù)數(shù)千次，最終可以得到幾千至數(shù)萬條洗脫肽二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜。如果在電離過程中存在強(qiáng)度很大的多肽段，則離子選擇器會(huì)對(duì)它做二次質(zhì)譜分析。而蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果可以利用前后兩次質(zhì)譜峰圖之間的比對(duì)而確定。目前，專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)使用的質(zhì)譜儀靈敏度也在不斷地提升，這對(duì)于提升蛋白質(zhì)譜技術(shù)的檢測(cè)靈敏度也大有裨益。

二、蛋白質(zhì)的定性與定量方法

（一）定性技術(shù)

蛋白質(zhì)的定性往往強(qiáng)調(diào)要達(dá)到全面覆蓋的效果，盡管就目前的科學(xué)水平來說，八成左右的人體蛋白質(zhì)檢出是能夠?qū)崿F(xiàn)的，然而剩余部分的蛋白質(zhì)，由于或是豐度不足或是疏水性過強(qiáng)等原因，導(dǎo)致其難以檢出。目前，定性技術(shù)運(yùn)用較多的為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（proteinchip），這是一類全新的生物芯片技術(shù)，其基本原理是將已知的分子產(chǎn)物做上熒光記號(hào)，并將其固定在通過特定化學(xué)加工后的高固相含量載體上。待測(cè)蛋白中，存在能夠與已知的蛋白質(zhì)分子物質(zhì)的特異性融合的種類，這類待測(cè)蛋白能夠被準(zhǔn)確捕捉到。將捕捉到的待測(cè)蛋白進(jìn)行漂洗后提純，然后再經(jīng)過檢測(cè)芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，再由電子計(jì)算機(jī)解析結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)各種蛋白質(zhì)的目標(biāo)。蛋白質(zhì)芯片擁有能夠從ng數(shù)量級(jí)的極小樣本中捕捉到豐度很低的低蛋白質(zhì)，并且能夠直接對(duì)血清、體液等生物物證進(jìn)行迅速的高通量檢測(cè)。

（二）定量技術(shù)

ITRAQ技術(shù)，即同位素標(biāo)記技術(shù)。ITRAQ技術(shù)，即同位素標(biāo)識(shí)相對(duì)比和絕對(duì)定性技術(shù)。主要是同時(shí)對(duì)4～8種不同種類的蛋白質(zhì)樣本中已被裂解的蛋白質(zhì)多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記與比對(duì)，進(jìn)而形成幾千個(gè)可鑒定多肽，進(jìn)而運(yùn)用質(zhì)譜分析法對(duì)形成的多肽做定量分析，再運(yùn)用生物信息學(xué)，對(duì)數(shù)據(jù)加以更高效的處理。但鑒于蛋白質(zhì)組成的極其復(fù)雜性，目前仍未有一個(gè)微生物中的蛋白質(zhì)覆蓋率能夠達(dá)到百分之百。

三、蛋白質(zhì)的識(shí)別技術(shù)

（一）PSM技術(shù)

PSM信息技術(shù)，即肽譜匹配技術(shù)，其基本原理是通過對(duì)現(xiàn)存于數(shù)據(jù)系統(tǒng)中的全部待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行分割，然后計(jì)算分割得到的胰蛋白酶肽的質(zhì)量。進(jìn)而將理論上的碎片信息與實(shí)際圖譜中得到的碎片信息加以比對(duì)，同時(shí)對(duì)兩者的相似性得分進(jìn)行計(jì)算，以此為判斷其匹配與否的依據(jù)。顯然，運(yùn)用該技術(shù)的過程之中，需要借助專業(yè)的數(shù)據(jù)庫軟件，以及評(píng)分方程，一方面要確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確水平，另一方面對(duì)于數(shù)據(jù)庫的完整性也提出了很高的要求，這也對(duì)能否準(zhǔn)確識(shí)別到目標(biāo)多肽產(chǎn)生顯著的影響。此外，PSM方法中的評(píng)分步驟并非完全可靠，因?yàn)閷?duì)于錯(cuò)誤的配對(duì)結(jié)果是無法規(guī)避的。因此，為了處理這一問題，引入了錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的概念，即指代整個(gè)肽譜配對(duì)中發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤的概率。具體而言，就是在數(shù)據(jù)庫中添加并不實(shí)際存在于待測(cè)樣本中的誘餌序列，一旦出現(xiàn)與誘餌序列發(fā)生配對(duì)的，均可視為錯(cuò)誤的配對(duì)，而錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率就是根據(jù)與誘餌肽譜配對(duì)的數(shù)量得出的。所以，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率只是估算整個(gè)肽譜配對(duì)中錯(cuò)誤量的參考值，并無法表明每一個(gè)肽譜配對(duì)的可信度，這就必須用其他計(jì)算方法來度量。

（二）生物信息學(xué)技術(shù)

現(xiàn)代生物信息學(xué)一般從微生物基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)兩個(gè)方向表現(xiàn)。在蛋白質(zhì)研究過程中，生物信息學(xué)技術(shù)的主要作用除了能夠進(jìn)行資料庫的查詢與相關(guān)信息技術(shù)資源的整合之外，而且在蛋白質(zhì)組研究應(yīng)用領(lǐng)域中，如鑒別蛋白質(zhì)、對(duì)已有蛋白質(zhì)組織進(jìn)行研究等方面的作用也是非常重要的。高流量、大面積的實(shí)驗(yàn)資料經(jīng)過生物信息學(xué)系統(tǒng)的處理，就可以對(duì)圖像研究、蛋白質(zhì)鑒別與比較等帶來更加方便的幫助。

四、基于蛋白質(zhì)組學(xué)的法醫(yī)生物物證鑒定

蛋白質(zhì)組相較于DNA而言，其氨基酸序列同樣是由DNA上的堿基序列編碼而來，因此實(shí)質(zhì)上看，兩者所攜帶的為同一種遺傳密碼。因此即使在生物體內(nèi)各個(gè)蛋白質(zhì)中的DNA一樣，但各種部位、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞種類的蛋白質(zhì)組是完全不一樣的，其差別體現(xiàn)在蛋白質(zhì)的種類和濃度。利用蛋白質(zhì)組技術(shù)，不但能夠確定蛋白質(zhì)序列信息，而且還能夠獲取蛋白質(zhì)成分的種類和濃度特征。當(dāng)生物物證缺失DNA時(shí)，依靠氨基酸序列的多態(tài)性，就能夠?qū)崿F(xiàn)基因的鑒定。

（一）利用蛋白濃度的降低推斷死亡時(shí)間

蛋白質(zhì)作為人類機(jī)體的主要組成之一，機(jī)體蛋白質(zhì)會(huì)在人類死亡后，逐漸被各種蛋白質(zhì)水解酶以及腐敗菌所溶解，形成氨基酸和小分子的含氮化合物，蛋白質(zhì)的濃度也會(huì)隨著死亡時(shí)間的增加而逐步下降甚至消失。例如，腦脊液中的白蛋白會(huì)在致死后3天內(nèi)完成降解，其降解具有線性特征。因而就可以利用能夠與其產(chǎn)生反應(yīng)的特定染料對(duì)其進(jìn)行染色，然后對(duì)染色得到的化合物做吸收光譜后進(jìn)行定量分析。最終，可以根據(jù)分析結(jié)果，推斷尸體的死亡時(shí)間。

（二）利用蛋白質(zhì)的變化差異推斷死因

在死亡原因的認(rèn)定中，部分死亡案件死因較為明朗，也很易于得出正確的認(rèn)定意見。但部分案件因?yàn)闆]有特異性的指標(biāo)，對(duì)于進(jìn)行具體的死因判斷存在一定的困難。而體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也會(huì)在人體死亡后發(fā)生改變，并且呈現(xiàn)一定的特殊規(guī)律。例如，不同的心臟病變，會(huì)導(dǎo)致左右心室中蛋白質(zhì)濃度的差異。如心臟左、右心室的中心尖區(qū)和基底區(qū)域中的多種蛋白質(zhì)，在含量上都具有明顯差別。左右心室即使存在相同類型的蛋白質(zhì)，但是其濃度會(huì)因?yàn)樾氖覅^(qū)域的不同而存在差異。存在于左心室的五種蛋白質(zhì)在心尖中具有更高的含量；而存在于右心室中的兩種蛋白質(zhì)在心尖中具有更高的含量。具體的蛋白質(zhì)種類如圖1所示。因?yàn)椴煌穆孕呐K病變對(duì)不同心室的產(chǎn)生影響也是不同的，因此可以利用這一規(guī)律對(duì)司法案件中不明的突發(fā)心臟病猝死案件的致死原因進(jìn)行判斷。

圖1 左右心室濃度較高的蛋白質(zhì)類比

（三）利用SAP的多態(tài)性進(jìn)行族群推斷

盡管血液、唾液等生物物證的STR分型技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但是由于毛干的基本組成物為角質(zhì)化細(xì)胞，其細(xì)胞核DNA濃度很低，并且分解極其強(qiáng)烈。因此，利用STR分型的精準(zhǔn)度表現(xiàn)很差。而蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性要明顯優(yōu)于角質(zhì)化細(xì)胞的細(xì)胞核DNA濃度。在不同的生物個(gè)體中，蛋白質(zhì)氨基酸順序也具有顯著不同，這就是SAP，即單氨基酸多態(tài)性，主要由nsSNP經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。

從毛干蛋白質(zhì)組中得到的nsSNP可以進(jìn)行族群推斷，對(duì)SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行整合后完成數(shù)據(jù)庫的建立，就能夠利用質(zhì)譜測(cè)試毛干蛋白質(zhì)組中數(shù)十種含有SAP的特異性多肽類物質(zhì)序列。這也意味著，毛干SAP的個(gè)體辨識(shí)，能夠很好填補(bǔ)STR個(gè)體識(shí)別中毛干識(shí)別的不足[2]。

（四）運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析識(shí)別DNA的具體來源

DNA鑒定技術(shù)雖然能夠?qū)ι矸菪畔⑦M(jìn)行識(shí)別，卻難以判斷DNA來自哪一類體液和組織。蛋白質(zhì)組學(xué)利用不同蛋白質(zhì)的不同配比以及通過機(jī)器學(xué)習(xí)的方式，來實(shí)現(xiàn)對(duì)體液中斑跡物質(zhì)來源的識(shí)別。通過非靶向技術(shù)，能夠?qū)Σ煌w液斑跡物質(zhì)的特異性標(biāo)記蛋白進(jìn)行識(shí)別，也可以準(zhǔn)確鑒定出混合類型的體液中的有效物質(zhì)。然而，相對(duì)于血液與精液混合物的檢出率，陰道分泌物和唾液混合物的檢出率稍顯遜色。因此，通過借助豐度水平的機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，對(duì)其檢出率加以提高。在實(shí)際使用中，還可以通過對(duì)槍擊案中現(xiàn)場(chǎng)殘留彈頭上的組織遺留物開展蛋白質(zhì)組學(xué)分析，目的是使彈頭結(jié)構(gòu)和槍擊受害人的損傷疤痕加以對(duì)應(yīng)。

五、結(jié)論

運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段可以對(duì)人死后各個(gè)時(shí)點(diǎn)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行準(zhǔn)確定性，并尋找其變化規(guī)律，進(jìn)而對(duì)死亡時(shí)間做出合理推測(cè)，同時(shí)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段可以找出不明致死因素的特異性標(biāo)記，進(jìn)而探測(cè)出蛋白質(zhì)水平和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的交互影響。如果能夠有效把控蛋白質(zhì)樣本生產(chǎn)與存儲(chǔ)過程的均一化，則運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段破解法醫(yī)物證鑒定中的疑難問題也就變?yōu)榱丝赡堋?/p>