鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊行為和生物轉化功能的影響

任加云，尚 帥，夏江寶

(1.濱州學院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點實驗室，山東 濱州 256600； 2.濱州學院 生物與環(huán)境工程學院，山東 濱州 256600)

引 言

近年來中國近岸海域鎘離子(Cd2+)污染呈上升趨勢[1-2]，某些海區(qū)鎘離子的濃度已經(jīng)超過水產(chǎn)養(yǎng)殖用水標準[3-4]，嚴重威脅著對海洋環(huán)境生態(tài)安全[5-11]。雙殼貝類營濾食性生活，代謝率低，富集重金屬能力較強[12-13]，許多學者研究顯示鎘離子對貝類具有明顯的毒性效應如氧化損傷，DNA損傷和細胞凋亡等[14-16]。

已有研究表明雙殼貝類濾食率、耗氧率可以作為評估外界環(huán)境壓力的重要行為指標[17-18]，谷胱甘肽硫轉移酶(GST)作為生物轉化過程中關鍵酶，是毒物生物轉化功能的重要評價指標[19-20]，目前應用行為和生物轉化指標綜合評價鎘離子對貝類毒性影響的研究尚未見報道。文蛤(Meretrixmeretrix)、四角蛤蜊(Mactraveneriformis)為我國淺海養(yǎng)殖重要的經(jīng)濟貝類，常被作為海洋污染的指示生物[21-23]，本文研究了鎘離子(Cd2+)對2種雙殼貝類濾食率(filtration rate)、耗氧率(respiration rate)和谷胱甘肽硫轉移酶活性的影響，比較分析了2種雙殼貝類對Cd2+脅迫響應的差異，探討了雙殼貝類在Cd2+作用下行為指標和生物轉化機能的關系，為我國海洋環(huán)境Cd2+污染評估和監(jiān)測提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

文蛤和四角蛤蜊于2019年9月取自山東省濱州市無棣縣沿海灘涂養(yǎng)殖基地，實驗所用文蛤、四角蛤蜊為同一批苗種養(yǎng)殖的貝類，平均殼高為3.2±0.3 cm，海水鹽度為28，海水鎘離子濃度為0.513±0.021 ng·L-1。

實驗用海水為當?shù)厣a(chǎn)的天然海鹽和清潔淡水配置成鹽度為28的海水，分別將文蛤和四角蛤蜊放入裝有30 L海水的60×45×35 cm的塑料水槽中，連續(xù)充氣，養(yǎng)殖海水pH值為7.8，水溫為21±1 ℃，以凍干小球藻粉(Chlorellavulgaris)為餌料，日投喂量為5.0 mg·L-1，日換水1/2，共暫養(yǎng)14 d。

1.2 實驗梯度設置

根據(jù)中國海水水質(zhì)標準[24](養(yǎng)殖水域鎘離子濃度需≤0.005 mg·L-1)，按照此標準的10倍、20倍、50倍設置實驗鎘離子暴露濃度，分別為0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1和0.25 mg·L-1。暴露實驗前，利用CdCl2·2.5H2O(AR級)制備高濃度Cd2+母液，然后稀釋至實驗所需的濃度。分別隨機挑選健康的文蛤、四角蛤蜊各100只放入塑料水槽中，每種貝類每個染毒梯度均設置6個平行組，實驗期間的充氣、換水量和投喂等管理跟暫養(yǎng)期間基本一致，換水時加入海水為含對應染毒濃度Cd2+的海水，每2 d測定養(yǎng)殖水槽的水溫、pH、鹽度和Cd2+濃度等數(shù)據(jù)，實驗期間各實驗梯度鎘離子濃度分別為0.04±0.01 mg·L-1、0.11±0.04 mg·L-1和0.28±0.08 mg·L-1。在暴露實驗的第0，1，3，6，10，15天取樣，每個水槽分別隨機取文蛤和四角蛤蜊各6只，解剖取消化盲囊和鰓絲組織，迅速用4 ℃超純水洗凈后置于1.5 mL離心管中，保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于測定GST酶的活性，樣品在采樣后24 h內(nèi)測定；同時取部分個體同步進行行為指標(濾食率和耗氧率)的測定實驗。

1.3 文蛤和四角蛤蜊行為指標測定

本實驗測定文蛤和四角蛤蜊的耗氧率和濾食率來評價兩者的行為變化，具體測定方法如下：

每次取樣四角蛤蜊和文蛤迅速放入燒杯中進行密閉，濾食率(FR)的測定采用Coughlan等人的方法[25]，稍加改進，該方法基于中性紅色染料顆粒從水體中的損失速度來表示濾食率，將每個濃度組出水管伸縮健康的文蛤和四角蛤蜊分別放入含有100 mL中性紅溶液(1 mg·L-1)的燒杯(每個燒杯1個蛤)中，在將蛤放入溶液之前，從每個燒杯中取出水測定初始濃度C0，2 h后取出蛤蜊，剩余溶液(CT)與初始溶液(C0)用5%鹽酸調(diào)整pH=5，在550 nm處測量吸光度，計算中性紅濃度。中性紅的標準隨樣品一起測量，并用于建立標準曲線，從中可以推斷中性紅染料濃度。FR的計算公式為FR=[M/nt]log(C0/Ct)，其中FR換算為每g濕重文蛤或者四角蛤蜊的濾食率(mg·g-1·h-1)，M為水的總體積，n為蛤的數(shù)量，t為時間(h)，C0和Ct分別為兩次采樣的濃度值。

用校準好的氧電極連接血氧計，采用Basti等人的方法[26]分別測定在4只文蛤和四角蛤蜊測量呼吸速率(RR)。每30 min進行一次氧濃度下降測定，持續(xù)3 h，并使用以下公式計算耗氧率RR=[CT0-CTi]×V/(Ti-T0)，其中RR為耗氧率,用蛤每g濕重每小時消耗的氧氣量來表示(mg·g-1·h-1)，CT0和CTi分別是時間在開始T0和Ti時間點的氧氣濃度，V為密閉燒杯總溶液的體積(mL)。

1.4 谷胱甘肽硫轉移酶(GST)的測定

現(xiàn)將消化盲囊和鰓絲在已經(jīng)調(diào)配好的磷酸鹽緩沖液(pH=7.7，溫度為4 ℃)冰浴中進行勻漿，時間為5 min，轉速為12,000 r·min-1，勻漿后取勻漿液放入1.5 mL離心管中，然后在高速冷凍離心機以10,000 r·min-1離心25 min后，取上清液作為酶液測定GST酶的活力。GST活力根據(jù)Habig等[27]的測定方法稍加改進，取200 μL酶液，快速加入磷酸緩沖液2.0 mL，H2O 400μL，GSH (15.0 mmol) 200 μL，CDNB (15.0 mmol·L-1) 200 μL，然后利用分光光度計在340 nm連續(xù)讀數(shù)120 s，酶活力用每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生的2,4-二硝基苯谷胱甘肽(2,4-dinitrophenylglutathione)的nmol量來表示，單位為nmol·mg-1·min-1；蛋白含量用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)[28]測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差(SD)表示，并用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗暴露組與對照組的行為反應差異，然后通過雙向方差(two-way ANOVA)分析評估各濃度組兩種蛤之間各指標變化差異性。當P<0.05時，認為差異顯著(*表示)，當P<0.01時認為差異極顯著(**表示)，其它認為差異不顯著。

2 實驗結果

2.1 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊濾食率和耗氧率的影響

圖1和圖2分別為文蛤和四角蛤蜊在各濃度鎘離子暴露下濾食率變化圖?？梢娫阪k暴露影響下，兩種蛤的濾食率整體呈現(xiàn)下降趨勢，0.05 mg·L-1暴露組的文蛤和四角蛤蜊濾食率從第3天和第1天開始明顯低于對照組(P<0.05)；兩者在0.10 mg·L-1和0.25 mg·L-1暴露組從第1天開始均顯著低于對照組(P<0.05)，且在0.25 mg·L-1處理組均從第1天開始極顯著低于對照組(P<0.01)。經(jīng)過計算，四角蛤蜊在各個濃度鎘離子處理下的濾食率幅度均顯著高于文蛤(P<0.05)，其中在0.25 mg·L-1處理組在第15天文蛤的濾食率為對照組的16.7%，而四角蛤蜊為對照組的8.0%。

圖1 鎘離子對文蛤濾食率的影響

圖2 鎘離子對四角蛤蜊濾食率的影響

圖3和圖4分別為文蛤和四角蛤蜊在各濃度鎘離子暴露下耗氧率變化圖。0.05 mg·L-1暴露組文蛤的耗氧率并未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，四角蛤蜊從第6天開始顯著低于對照組(P<0.05)；0.10 mg·L-1處理組的文蛤和四角蛤蜊分別從第3天和第1天明顯低于對照組(P<0.05)，兩者在0.25 mg·L-1處理組均從第1天開始顯著低于對照組(P<0.05)。經(jīng)過計算得知，各濃度鎘離子影響下四角蛤蜊耗氧率降低速度比文蛤快。

圖3 鎘離子對文蛤耗氧率的影響

圖4 鎘離子對四角蛤蜊耗氧率的影響

通過計算得知兩種蛤的濾食率下降幅度要明顯高于耗氧率，耗氧率呈現(xiàn)顯著下降的時間點相對于濾食率滯后。

2.2 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊消化盲囊和鰓絲GST活力的影響

圖5和圖6分別為文蛤消化盲囊和鰓絲在各濃度鎘暴露下GST酶活性變化圖。0.05 mg·L-1暴露組的文蛤消化盲囊在實驗期間并未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，而鰓絲則從第3天明顯高于對照組(P<0.05)，且一直上升；0.10 mg·L-1暴露組的文蛤消化盲囊從第3天開始明顯高于對照組(P<0.05)，然后一直上升，而鰓絲則從第1天開始明顯高于對照組(P<0.05)，在第6天達到最高值，隨后下降，但未低于對照組的水平；在0.25 mg·L-1暴露組，文蛤消化盲囊從第1天開始明顯高于對照組(P<0.05)，在第6天達到最高，然后下降，最后階段仍然高于對照組的水平，而鰓絲則在第3天達到最高值，隨后下降，在第15天明顯低于對照組(P<0.05)。

圖5 鎘離子對文蛤消化盲囊GST酶活性的影響

圖6 鎘離子對文蛤鰓絲GST酶活性的影響

圖7和圖8分別為鎘暴露下四角蛤蜊消化盲囊和鰓絲GST酶活性變化圖。0.05 mg·L-1暴露組的四角蛤蜊消化盲囊和鰓絲分別從暴露后第3天和第1天明顯高于對照組(P<0.05)，且一直上升； 0.10 mg·L-1處理組的四角蛤蜊消化盲囊從第1天明顯高于對照組(P<0.05)，在第3天達到最高，隨后下降，在第15天明顯低于對照組(P<0.05)，而鰓絲則在第1天明顯高于對照組(P<0.05)，然后下降，從第6天開始明顯低于對照組(P<0.05)；0.25 mg·L-1處理組的四角蛤蜊消化盲囊在第3天達到最高值然后下降，從第10天開始顯著低于對照組(P<0.05)，而鰓絲則從暴露實驗第1天開始就明顯低于對照組(P<0.05)，一直下降。

圖7 鎘離子對四角蛤蜊消化盲囊GST酶活性的影響

圖8 鎘離子對四角蛤蜊鰓絲GST酶活性的影響

3 討論

3.1 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊行為指標的影響

截止目前，關于環(huán)境因素對貝類代謝行為指標影響有一定研究，一般認為，相關環(huán)境因子變化可以導致其濾食和耗氧指標的下降[17-18,29]，而針對具體污染物對文蛤和四角蛤蜊行為指標影響的研究相對較少。本實驗結果表明文蛤和四角蛤蜊在鎘暴露下，其行為指標整體呈現(xiàn)下降趨勢，且濃度越高，暴露時間越長，下降越明顯，目前有研究發(fā)現(xiàn)在二氧化鈦等有毒物質(zhì)作用下，貝類的濾食率和耗氧率同樣呈現(xiàn)下降趨勢[30-31]，與本實驗研究結果類似，另據(jù)報道，貝類濾食率和耗氧率下降的主要是由于機體主動降低其能量消耗而導致[32]。本實驗文蛤的兩個行為指標被抑制的時間點明顯晚于四角蛤蜊，且四角蛤蜊在暴露時間相同的情況下，相比對照組的下降幅度更大，說明四角蛤蜊的耗氧和濾食行為受到的影響更明顯。耗氧率指標在個別濃度組沒有變化或相對濾食率被抑制時間點滯后，說明兩種蛤濾食行為能更早體現(xiàn)出機體對鎘暴露的反應，有研究認為在毒物作用下貝類可以首先通過主動降低其攝食量來降低對污染物的攝入或者在神經(jīng)系統(tǒng)的控制下，貝類鰓絲部位肌肉收縮和纖毛擺動行為發(fā)生變化導致其濾食行為變化更明顯[33-35]，可以進一步導致貝類鰓絲耗氧和清除食物顆粒的能力下降。另外有研究表明，貝類行為指標變化與體內(nèi)某些功能酶活力變化也具有一定的關系，有研究發(fā)現(xiàn)AChE酶活性的抑制和行為指標的抑制具有協(xié)同性[36]，所以結合體內(nèi)某些代謝酶活性和行為指標的變化來判別貝類受影響的程度更全面，而本研究則結合了谷胱甘肽硫轉移酶(GST)的變化來闡述與蛤行為指標變化的關系。

3.2 鎘暴露對文蛤和四角蛤蜊組織GST活性的影響

生物機體對污染物解毒的第一步是生物轉化，分為相I和相II兩個過程，其中谷胱甘肽硫轉移酶(GST)為相II過程中的關鍵酶，可以促進一級代謝物與谷胱甘肽(GSH)結合，使其變成親水性物質(zhì)進一步解毒[37-39]，有較多的研究發(fā)現(xiàn)，GST酶活性在污染物的作用下會呈現(xiàn)升高現(xiàn)象，以提升機體的解毒代謝能力[40-41]，本實驗結果也顯示，除文蛤消化盲囊在0.05 mg·L-1處理組GST酶活性無變化之外，其余組織在低濃度組或者高濃度組的開始階段呈現(xiàn)上升趨勢，說明兩者在低濃度Cd2+或者高濃度Cd2+短時間影響下，有能力提升GST酶活性以解毒一級代謝物，此時機體受到的毒害效應較低。但是在高濃度組后期，GST酶活性明顯下降，且最后階段均接近或明顯低于對照組，這說明文蛤消化盲囊利用GST酶進行解毒的能力較強，鰓絲受到的毒害影響較為明顯，特別是四角蛤蜊鰓絲GST酶活性在0.25 mg·L-1濃度組全程被抑制，之前有較多的研究也發(fā)現(xiàn)雙殼貝類在高濃度污染物或長時間的作用下明顯被抑制的情況[38,40]，對比可見，兩種蛤的鰓絲GST被抑制的時間點都早于消化盲囊，鰓絲受到的毒性作用更明顯，這說明兩種組織特別是鰓絲由于污染物或者其一級代謝物不能及時清除，積累逐漸增多反而導致兩種組織GST酶被抑制。

3.3 鎘暴露影響下兩種蛤受影響規(guī)律對比及各指標關系探討

通過分析，文蛤和四角蛤蜊濾食率和耗氧率均隨時間整體呈現(xiàn)下降趨勢，且鎘離子暴露濃度越高，下降越明顯，而四角蛤蜊受抑制的程度更顯著，兩種蛤的行為指標變化敏感度存在一定的差異，結合實驗期間兩種蛤外部行為變化也可以看出，四角蛤蜊在0.25 mg·L-1濃度組或者長時間鎘暴露下，其入水管萎縮程度較文蛤明顯，四角蛤蜊攝食行為受阻顯著；0.05 mg·L-1處理組的文蛤消化盲囊GST酶活性并無變化，而四角蛤蜊則明顯上升，且在其它濃度組，四角蛤蜊酶活性上升開始時間點和被抑制時間點都較文蛤早，上升幅度和被抑制幅度相對文蛤顯著，所以高濃度Cd2+影響下四角蛤蜊的生物轉化功能受到了更明顯的影響，兩種蛤對重金屬的解毒代謝存在差異，根據(jù)報道，不同貝類對于重金屬的積累和代謝有差異主要跟每個種類消化吸收率、同化利用率和釋放速率存在差異有關[42-43]，且不同種類的解毒策略包括抗氧化酶系統(tǒng)、溶酶體與金屬硫蛋白(metallothioneins，MT)結合等功能有所不同[44]，文蛤對鎘的解毒功能強于四角蛤蜊。

本實驗兩種蛤行為指標和GST酶活性的變化趨勢對比可知，行為指標數(shù)據(jù)整體呈現(xiàn)下降趨勢，但是GST酶活性在某些濃度組和時間段則呈現(xiàn)上升趨勢，說明兩種蛤首先通過主動降低攝食率和耗氧量來減少Cd2+的攝入，然后在低濃度或者高濃度的開始階段，則可以通過生物轉化酶的上升來促進進入體內(nèi)的Cd2+的轉化，而在高濃度長時間影響下，機體受鎘影響的毒性反應較為明顯，此時文蛤和四角蛤蜊耗氧率和攝食率的下降則可能是一種被動的反應，機體GST酶活性受到嚴重抑制，兩種蛤已經(jīng)不能完全通過主動保護性行為來降低Cd2+的攝入，此時GST酶活性、耗氧率和濾食率都呈現(xiàn)明顯的被抑制狀態(tài)，機體受到的損傷較為嚴重，所以文蛤和四角蛤蜊在Cd2+影響下，其主動解毒、被動受毒害時間點以及能應對解毒的Cd2+濃度范圍可以在后期做進一步的研究確定。