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    基于系統(tǒng)藥理學(xué)分析野生真菌硬皮馬勃治療腫瘤多層次作用機(jī)制*

    2022-08-26 08:57:22王宜磊周廣燦張桂榮
    關(guān)鍵詞:馬勃硬皮藥用

    李 敏,王宜磊,高 霞,周廣燦,唐 欣,張桂榮,崔 慧

    (1. 菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院微生物重點(diǎn)實(shí)驗室 菏澤 274015;2. 山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 濟(jì)南 250014)

    腫瘤是指人體在各種致瘤因子的作用下局部組織細(xì)胞異常增生所形成的新生物。腫瘤已是嚴(yán)重威脅全球居民生命和健康的疾病之一,根據(jù)國際癌癥研究中心數(shù)據(jù)表明,2018 年全球新發(fā)惡性腫瘤病例約1800 萬,死亡 960 萬例,位居全球死因首位[1],我國每年腫瘤新發(fā)病例約392.9 萬例,死亡233.8 萬例[2],且惡性腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢。常規(guī)的治療方法為手術(shù)、放療和化療等,放療、化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時對機(jī)體的消化系統(tǒng)和造血系統(tǒng)損傷嚴(yán)重,且具有顯著的毒性、耐藥性等不良反應(yīng)。與其相比,中藥具有對控制病情,提高生存質(zhì)量,降低放、化療不良反應(yīng),降低腫瘤復(fù)發(fā)等發(fā)揮越來越重要的作用[3]。藥用真菌作為中藥的一種,含有多種抑制腫瘤生長的功能成分[4],在治療腫瘤和疑難雜癥中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和潛力。

    藥用真菌在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有悠久的使用歷史[5],東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有10 余種藥用真菌的記載[6],但是對藥用真菌的分類、鑒定缺少模式標(biāo)本材料和方法單一[7],且同一藥用真菌的形態(tài)特征在不同環(huán)境和生長階段也不相同,對其研究相對匱乏,導(dǎo)致認(rèn)知不充分,特別是民間藥用真菌的研究、整理甚是稀少,使其廣泛推廣應(yīng)用和深度開發(fā)受到嚴(yán)重限制。因而,開展當(dāng)?shù)孛耖g藥用資源大型真菌的鑒定、分類、藥效成分分析及其作用機(jī)理十分必要。本文對當(dāng)?shù)孛耖g應(yīng)用最普遍的野生藥用真菌進(jìn)行組織分離,獲得菌株M-1,通過形態(tài)學(xué)和核糖體rRNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列進(jìn)行鑒定,該菌為硬皮馬勃(Scleroderma sinnamariense)。

    硬皮馬勃(Scleroderma sinnamariense)屬于馬勃目,馬勃科,硬皮馬勃屬,該屬分布于世界各地,約60多種,我國較常見的有11種[8],主要分布于山東、吉林、內(nèi)蒙古自治區(qū)等地。《名醫(yī)別錄》記載馬勃“味辛平無毒,主治惡瘡馬疥”[9],惡瘡即為現(xiàn)代腫瘤[10-12]。最近研究表明,硬皮馬勃活性成分4,4-二甲氧基維甲酸及其衍生物顯著抑制NCI-H187 腫瘤細(xì)胞生長[13],Zhang 在多根硬皮馬勃研究同樣發(fā)現(xiàn)甾醇類活性成分能抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-6)[14],而且馬勃狀硬皮馬勃多糖提取物對腫瘤細(xì)胞HepG2 和人肺癌A549 細(xì)胞具有顯著的抑制作用[15]。但是硬皮馬勃活性成分和作用機(jī)制仍不清楚,藥用真菌藥效成分復(fù)雜,其作用位點(diǎn)較多且各成分間協(xié)同作用體系復(fù)雜,采用傳統(tǒng)的方法篩選藥物成分、解釋其作用機(jī)理難度極大。然而,中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)借助于計算機(jī)技術(shù)在藥物靶點(diǎn)、疾病的發(fā)病、治療機(jī)制研究、精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和提高藥物的療效等方面提供了新的策略[16]。因此,本文應(yīng)用系統(tǒng)藥理學(xué)理論和技術(shù)體系,文獻(xiàn)中硬皮馬勃化學(xué)成分,借助TCMSP 數(shù)據(jù)庫尋找硬皮馬勃有效的、新穎的、潛在的抗腫瘤成分,整合網(wǎng)絡(luò)分析、功能富集和通路等技術(shù),探討其抑制腫瘤的潛在作用機(jī)制及其規(guī)律(圖1),為揭示有效成分的作用機(jī)制提供新思路,希冀為腫瘤藥物的開發(fā)提供新的視角和理論依據(jù)。

    圖1 系統(tǒng)藥理學(xué)流程圖

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    2018 年6 月,從山東省定陶區(qū)仿山草叢里采集一株野生藥用真菌子實(shí)體,置于一次性封口袋中,在微生物實(shí)驗室進(jìn)行分離、純化、鑒定和保藏,菌株編號為M-1。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 M-1菌株純化和鑒定

    形態(tài)學(xué)鑒定:先將采集的子實(shí)體用清水清洗干凈,然后用75%乙醇消毒,再用無菌水清洗掉乙醇,在無菌條件下將組織切成小塊接種于PDA 培養(yǎng)基上,置于26℃培養(yǎng),獲得純化菌株M-1,分別置于4℃和-80℃保藏備用。無菌條件下挑起菌絲接種平板上,接種點(diǎn)2 cm 處插入無菌蓋玻片,待菌絲生長其上后取出置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征。

    分子鑒定:將分離純化的菌絲采用CTAB 法[17]提取菌株DNA,基于核糖體rRNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3')和 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對其 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)體系為 50 μL,包括 DNA 模板 2.0 μL,2.5 μmol·L-1的前后引物各 2 μL,2×tag PCR Mix 25 μL,ddH2O 19 μL。PCR 擴(kuò)增程序為94℃ 5 min,35 個循環(huán)(94℃ 45 s,53℃ 45 s,72℃ 1 min),72℃ 10 min,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果用DNAMAN6.0 和Chromas Pro 軟件進(jìn)行堿基修正與拼接,利用在線數(shù)據(jù)庫NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對拼接后的序列進(jìn)行同源序列比對,獲取相似序列。

    1.2.2 馬勃活性成分庫的構(gòu)建及靶點(diǎn)預(yù)測

    從文獻(xiàn)中獲取硬皮馬勃化學(xué)成分,利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索其化學(xué)成分,并進(jìn)行后續(xù)的系統(tǒng)分析。利用虛擬ADME 系統(tǒng),計算硬皮馬勃化學(xué)成分藥用動力學(xué)參數(shù),依據(jù)網(wǎng)站推薦閥值,以參數(shù)口服生物利用度(Oral Bioavailability OB)>18% 和 類 藥 性(Drug Likeness DL)>0.1 為潛在高活性成分進(jìn)行篩選,利用ChemBio獲得潛在高活性成分的結(jié)構(gòu)式。

    在篩選到活性成分的基礎(chǔ)上,利用藥物靶向工具(SysDT)[18]和加權(quán)系綜相似度(WES)[19]系統(tǒng)預(yù)測獲得活性成分對應(yīng)作用靶點(diǎn)。首先利用SysDT即兩個數(shù)學(xué)工具,隨機(jī)森林(RF)和支持向量機(jī)(SVM))系統(tǒng)對潛在作用靶點(diǎn)打分,選擇參數(shù)SVM≥0.8 和RF≥0.7 的靶點(diǎn)作為有效作用靶點(diǎn),利用WES模型挖掘藥物直接靶點(diǎn),該模型在預(yù)測敏感性和特異性方面表現(xiàn)良好,準(zhǔn)確度達(dá)到78%。對篩選到的靶點(diǎn)進(jìn)行整理,利用Gene Cards Suite(https://www.genecard.org)對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,將標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)映射到CTD(http://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫,獲得與腫瘤相關(guān)靶點(diǎn),這些靶點(diǎn)作為硬皮馬勃活性成分的藥理學(xué)靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的探討。

    1.2.3 活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(C-T)的構(gòu)建及分析

    為明確硬皮馬勃潛在活性成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系,基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出的活性成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件,構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖(C-T),并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析。在C-T 網(wǎng)絡(luò)圖中,節(jié)點(diǎn)表示硬皮馬勃活性成分和靶點(diǎn),邊表示活性成分和靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用。在C-T 網(wǎng)絡(luò)圖中,與節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)量為“度值”,根據(jù)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)的邊數(shù)的多少來評價節(jié)點(diǎn)的重要程度,邊數(shù)越多,該節(jié)點(diǎn)越重要,節(jié)點(diǎn)也越大,反之越小,遴選出關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)。

    1.2.4 靶點(diǎn)的生物功能和通路富集分析

    為了揭示活性成分潛在的作用機(jī)制,利用在線分析平臺 DAVID(https://david.ncifcrf.gov)和 Metascape(https://metascape.org)對靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene Ontology)生物功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。設(shè)定閥值p-value <0.01,篩選排名靠前的通路,使用柱狀圖對富集結(jié)果進(jìn)行展示,利用在線分析平臺Metascape 構(gòu)建抗癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò),揭示硬皮馬勃潛在活性成分在治療腫瘤中參與的生物學(xué)過程和涉及的通路。

    1.2.5 靶點(diǎn)-通路(T-P)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及通路整合分析

    為了探究活性成分作用靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系,利用富集分析獲得KEGG 通路,構(gòu)建靶點(diǎn)-通路(T-P)網(wǎng)絡(luò)圖,用Cytoscape3.8.0 軟件對T-P 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化,并利用網(wǎng)絡(luò)分析模塊對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析。在TP 網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點(diǎn)表示活性成分作用靶點(diǎn)和KEGG 通路,邊表示靶點(diǎn)和通路之間的隸屬關(guān)系。在T-P 網(wǎng)絡(luò)圖中,與節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)量為“度值”,根據(jù)節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊數(shù)多少來評價節(jié)點(diǎn)的重要程度,邊數(shù)越多,該節(jié)點(diǎn)越重要,節(jié)點(diǎn)也越大,反之越小,篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)和主要作用通路。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 野生真菌形狀和顯微鑒別

    M-1 菌株子實(shí)體呈(圖2a)梨形、近球形,菌柄較短,子實(shí)體較硬,菌蓋有裂口,外表淺黃色,局部微褐色,內(nèi)部潔白。無菌條件下將子實(shí)體接種于PDA 培養(yǎng)基上,分離純化后的菌落干燥潔白,圓形,邊緣整齊,平板背面無菌絲分泌物呈現(xiàn)(圖2b)。菌絲粗壯,有橫隔,分支較多,頂端略圓(圖2c)。形態(tài)學(xué)鑒定在本校微生物教研室王宜磊教授的指導(dǎo)幫助下完成。

    圖2 M-1菌株鑒別

    采用CTAB 法提取菌株DNA,PCR 擴(kuò)增獲得長度530 bp ITS 序列片段,將擴(kuò)增片段回收、測序,測定序列為:CATTATCGAAGTCGAACGCTAGGAGGGAGAAGGGGAGCC CGTCGCTCCTCGGACCTCTCCGAAGCTTCAACCTTCTT CACACCCGTGTGCACCCGCTGTAGGTCCTTCGGGATCC TACGTCTTCGCTCTCGAACTCGCATGTCTACAGAATGTC CATGTCGTGTCGACCGGCGTCCGCGTCGGCGACCGCAA ACCTTTGTACAACTTTCAGCAATGGATCTCTTGGCTCTC GCATCGATGAAGGACGCAGCGAATCGCGATAAGTAATGT GAATTGCAGATTTTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACG CACCTTGCGCTCCTCGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGT TTGAGTGTCATCGAAATCTCGAACCGAAGCCTTCGATCC GTTCGAAGCTCGGTCTCGGAACGTGGGGGTCTGCGGGC GGCGACGTCGGCTCCCCTCAAACGCATCAGCTGTGGGC ACGAGCCCTGCGTGGCACGGCCTCCCCGACGTCGTAACGATCGTCGTGGGCTGGAAGCGCAGTGATCGGCGATCCC ATGCTTTCCAACCTTTTTCTCGAAGCT。 在 線 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸序列比對,該序列與硬皮馬勃對應(yīng)序列同源度100%,結(jié)合子實(shí)體、菌落和菌絲特征,初步認(rèn)為該菌株為硬皮馬勃(Scleroderma sinnamariense)。

    2.2 硬皮馬勃活性成分庫的構(gòu)建及ADME 虛擬篩選

    從文獻(xiàn)中獲得硬皮馬勃的化學(xué)成分59 個,通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找到的化學(xué)成分37個,根據(jù)ADME系統(tǒng)虛擬篩選標(biāo)準(zhǔn),以參數(shù)OB%>18,DL>0.1 進(jìn)行篩選,獲得活性成分7 個,分別為脂肪酸、甾體化合物、脂類和醇類,其藥用動力學(xué)和結(jié)構(gòu)相關(guān)信息在表1 中。其中,活性成分亞油酸(LA)[20]和棕櫚酸(PA)[21]已被報道具有抗腫瘤作用。

    表1 硬皮馬勃活性成分及其藥用動力學(xué)參數(shù)

    2.3 硬皮馬勃活性成分靶點(diǎn)預(yù)測及C-T 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    通過SysDT 和WES 系統(tǒng)獲得7 個活性成分(表1),其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫里僅有5 個潛在活性成分的靶點(diǎn),共獲得38 個無重復(fù)靶點(diǎn),分別為:PTGS1、PTGS2、RXRA、NCOA2、IGHG1、GABRA1、PGR、CTSD、BCL2、IL10、TNF 等,平均每個潛在活性成分靶點(diǎn)為7.6 個。將38 個靶點(diǎn)映射到CTD 數(shù)據(jù)庫中,獲得靶點(diǎn)的功能,以Cancer 為關(guān)鍵詞篩選與腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)16 個。將5個活性成分和腫瘤相關(guān)16 個靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建硬皮馬勃活性成分和藥理學(xué)靶點(diǎn)(C-T)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3),基于21 個節(jié)點(diǎn)(活性成分5 個和靶點(diǎn)16 個)和26條邊構(gòu)建C-T網(wǎng)絡(luò)圖。圖中紅色圓點(diǎn)表示靶點(diǎn),綠色箭頭表示活性成分,邊表示潛在活性成分對靶點(diǎn)的作用。通過拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn),高度值的分子和靶點(diǎn)可能在腫瘤治療過程中發(fā)揮重要作用,硬皮馬勃活性成分LA和PA的度值較高,分別為7和11,這些活性成分可能在硬皮馬勃治療腫瘤中發(fā)揮重要作用。取前6個靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn),分別為 NCOA2、PTGS1、PTGS2、PGR、IGHG1和RXRA等靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)相對較高,表明這些靶點(diǎn)可能是活性成分作用的核心靶點(diǎn)。不同活性成分作用在同一個靶點(diǎn),且同一活性成分作用不同靶點(diǎn),推測這些活性成分可能存在多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用。

    圖3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    2.4 馬勃靶點(diǎn)的生物功能和通路富集分析

    為進(jìn)一步證實(shí)硬皮馬勃活性成分靶點(diǎn)與腫瘤相關(guān)性,應(yīng)用Metascape 工具和DAVID 數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能和通路富集分析(圖4)。為了更好的明確活性成分作用靶點(diǎn)過程和位置,對其生物功能分析,分別從生物學(xué)過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和 細(xì) 胞 組 分(cellular component, CC)3 個水平對 16 個靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 富集分析,按照P<0.01 的閾值過濾,共富集到65 條生物功能,選取富集顯著程度靠前的條目進(jìn)行繪制可視化圖形(圖4a)。富集度較高的生物學(xué)過程主要包括:糖皮質(zhì)激素分泌、一氧化碳合成正向調(diào)控、鐵離子對初始轉(zhuǎn)移的正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、細(xì)胞對缺氧反應(yīng)、正調(diào)控序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、免疫反應(yīng)、發(fā)熱產(chǎn)生的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子分泌的負(fù)調(diào)控參與免疫反應(yīng);分子功能包括:prostaglandin-endoperoxide 合酶活性、酶結(jié)合、過氧化物酶活性、相同的蛋白結(jié)合、細(xì)胞外配體門控離子通道活性、類固醇激素受體活性、PDZ結(jié)合功能域、特異性DNA結(jié)合、鋅離子結(jié)合等;細(xì)胞組分包括:突觸后膜、質(zhì)膜的外部、胞外區(qū)、胞器膜、細(xì)胞外空隙(圖4a)。KEGG 富集通路分析顯示(圖4b),硬皮馬勃活性成分參與的通路有小細(xì)胞肺癌信號通路(hsa05222),MAPK 信號通路(hsa04071),NF-kappa B信號通路(hsa04064)等多個信號通路,這些通路參與不同的腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)或加速腫瘤細(xì)胞的凋亡,活性成分在通路上主要作用的靶點(diǎn)有IL10、PTGS1、PTGS2、TNF、RXRA 和BCL2 等,這些靶點(diǎn)參與免疫應(yīng)答,腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過程。

    圖4 GO和通路富集分析。

    2.5 靶點(diǎn)-通路(T-P)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

    為了進(jìn)一步揭示硬皮馬勃活性成分作用靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系,提取富集分析結(jié)果中KEGG 通路及通路相關(guān)靶點(diǎn),利用Cytoscape3.8.0 軟件構(gòu)建T-P 網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。T-P 網(wǎng)絡(luò)圖含有25 個節(jié)點(diǎn)(9 個靶點(diǎn)和16條通路)和45 條邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析表明,網(wǎng)絡(luò)的某些通路與多個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián),如小細(xì)胞肺癌通路(hsa05222)和Toll-like receptor(hsa05152)等通路分別與4 個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián),該通路主要參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。MAPK通路(hsa04071)與4個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián),主要參與免疫與腫瘤細(xì)胞增殖。NF-Kappa 通路(hsa04064)與3 個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián),主要參與腫瘤細(xì)胞的凋亡。由此我們推斷硬皮馬勃活性成分整合多信號通路抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能。目標(biāo)靶點(diǎn)也與多個通路相關(guān)聯(lián),如:TNF靶點(diǎn)與11 個通路相關(guān)聯(lián),其次BCL2 靶點(diǎn)與8 個通路相關(guān)聯(lián),IL10靶點(diǎn)與7個通路相關(guān)聯(lián),說明這些靶點(diǎn)是硬皮馬勃活性成分主要作用的靶點(diǎn)。

    圖5 T-P網(wǎng)絡(luò)圖

    2.6 馬勃活性成分治療通路的整合分析

    為了深入理解硬皮馬勃治療腫瘤的整體機(jī)制,我們整合MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa和小肺癌細(xì)胞中的PI3K-AKT 等關(guān)鍵信號通路,構(gòu)建了硬皮馬勃治療腫瘤的主要通路圖(圖6),這些通路參與細(xì)胞免疫應(yīng)答,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡等生物學(xué)功能。

    圖6 目標(biāo)靶蛋白在精簡癌細(xì)胞途徑上的分布

    3 討論

    根據(jù)國際癌癥研究中心數(shù)據(jù)表明,腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢,已威脅全球居民生命和健康。常規(guī)治療方法容易造成機(jī)體損傷和明顯不良反應(yīng),而中藥治療對機(jī)體安全性相對較高,特別是藥用真菌在一些疑難雜癥和慢性病的治療中顯示其突出優(yōu)勢。硬皮馬勃為當(dāng)?shù)孛耖g藥用大型真菌,在治療老年外陰濕疹及痔瘡手術(shù)后排便困難,阻止傷口止血、凍瘡流水等疾病方面具有較好的療效。為了更好了解、開發(fā)和利用此藥用真菌,對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和核糖體rRNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)方法鑒定,確定為硬皮馬勃(Scleroderma sinnamariense),屬于硬皮馬勃科的一種。

    從已有文獻(xiàn)資料中獲知,硬皮馬勃化學(xué)成分59個,根據(jù)藥用動力學(xué)ADME 系統(tǒng)虛擬篩選獲得7 種活性成分,分別為脂肪酸(2種)、甾體化合物(3種)、脂類(1 種)和醇類(1 種)。由于硬皮馬勃活性成分作用機(jī)制的相關(guān)研究較少,目前僅發(fā)現(xiàn)5種活性成分的靶點(diǎn),其中PA 和LA 作用靶點(diǎn)較多,可能是抑制腫瘤的主要成分。有關(guān)機(jī)制表明,PA通過調(diào)節(jié)膜流動性和糖代謝來抑制腫瘤細(xì)胞的生長[21],也可通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體[26]或下調(diào)靶點(diǎn)基因IL-10 的表達(dá)水平來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[27]。Lei研究發(fā)現(xiàn)PA 通過自噬激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)Saos-2肉瘤細(xì)胞凋亡[28]。而LA 主要通過調(diào)節(jié)雌激素受體(ERa)、G13a G 蛋白、p38 MAP kinase 基因表達(dá),改善細(xì)胞微環(huán)境,間接參與腫瘤細(xì)胞的凋亡[29-30]。甾體化合物是真菌次生代謝產(chǎn)物,屬于天然抗氧化劑,具有抗炎、抑制腫瘤血管生成的作用[31],它主要通過上調(diào)抑癌基因Foxo3 表達(dá)和激活凋亡蛋白Puma 和Bax,有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[32-33]。由此可見,這些成分在抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖、遷移,誘導(dǎo)其凋亡方面具有重要作用。

    通過KEGG 通路分析獲得65 條相關(guān)信號通路,整合 PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa 等關(guān)鍵信號通路及其通路上的靶點(diǎn)蛋白,能夠清晰展示通路、靶點(diǎn)蛋白之間的關(guān)聯(lián),更好揭示硬皮馬勃活性成分治療腫瘤的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),MAPK 、Toll-like receptor 和 NF-Kappa 信號通路參與了免疫應(yīng)答,除了NF-Kappa通路其余4條通路均參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖,此外Toll-like receptor和Jak-STAT 信號通路還參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡,表現(xiàn)出多通路,多層次的協(xié)同增效作用。

    免疫是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,免疫系統(tǒng)對病原體的抑制,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和專業(yè)吞噬細(xì)胞積累到入侵部位[34]。硬皮馬勃活性成分可能通過MAPK、NFKappa 和Toll-like receptor 信號通路(圖6)上的關(guān)鍵靶點(diǎn) IL10、TNFα、BcL2/XL 和 COX2 參與細(xì)胞的免疫反應(yīng)。MAPK、NF-Kappa 和 Toll-like receptor 信號通路參與多種炎癥過程并能促進(jìn)炎癥的發(fā)生[35-36],下調(diào)或抑制這些炎癥通路,可以控制炎癥反應(yīng),提高免疫應(yīng)答[37]。活性成分作用靶點(diǎn)TNFα、BcL2 和 IL10 的通聯(lián)度較高(圖5),分別為11、8 和7,說明這些靶點(diǎn)可能是其關(guān)鍵靶點(diǎn)。我們推測,硬皮馬勃活性成分可能是通過抑制炎癥提高免疫達(dá)到抑制腫瘤增殖和遷移的目的。Hu 沉默 DPP4 基 因和 Zhen 敲除 COL12A1 基因 抑制MAPK 通路,從而抑制細(xì)胞增殖和遷移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[38-39],證明該推測正確,表明硬皮馬勃活性成分在炎癥反應(yīng)和抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

    硬皮馬勃活性成分可能通過PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT信號通路抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖,調(diào)控這些信號通路在腫瘤治療過程中可能具有較好的療效。硬皮馬勃活性成分可能通過調(diào)控基因表達(dá)或沉默基因,抑制通路[40-41]和趨化因子,間接參與抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖[42];也可能抑制AKT磷酸化[43],導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的改變[44],或直接作用于靶點(diǎn)蛋白IFNy,通過Jak-STAT 通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,此推測需要實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)。總之,不同通路在不同類型的腫瘤中可以被不同分子激活,從而呈現(xiàn)出不同表型。

    通過整合通路發(fā)現(xiàn),硬皮馬勃活性成分可能通過Toll-like receptor、Jak-STAT 信號通路,作用于靶點(diǎn)蛋白iNOS,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,這與Li 用姜黃素上調(diào)miR-99a基因抑制JAK/STAT通路,抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)增殖,并促進(jìn)凋亡[45]的研究結(jié)果一致。表明JAK/STAT 通路在很多癌癥中被激活,加強(qiáng)了癌細(xì)胞的擴(kuò)散[46-47],由此可推導(dǎo)抑制該通路可以控制某些腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。

    本研究通過GO 功能和KEGG 通路富集分析,進(jìn)一步揭示硬皮馬勃活性成分作用的16個關(guān)鍵靶點(diǎn),以及它們在基因功能和信號通路中的作用。TNF、IL10、BCL2 和PTGS2 等靶點(diǎn)在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器部位發(fā)生蛋白結(jié)合、調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)、抑制趨化因子和磷酸化等分子反應(yīng),進(jìn)而調(diào)控PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT 和 NF-Kappa 等 信 號 通路,抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲,誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,充分體現(xiàn)了硬皮馬勃活性成分具有多通路,多靶點(diǎn)、多層次的增效作用。

    綜上所述,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定當(dāng)?shù)孛耖g藥用野生大型真菌為硬皮馬勃(Scleroderma sinnamariense)?;谥兴幭到y(tǒng)藥理學(xué)、ADME、靶點(diǎn)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析和通路分析等方法,挖掘潛在的活性成分(PA、LA 等)5 種,這些活性成分主要通過Toll-like receptor、PI3K-AKT、MAPK 和 NF-kappa B 等通路作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白(TNF、IL10、BCL2 等),參與免疫應(yīng)答,抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖,促進(jìn)其凋亡,為傳統(tǒng)藥用真菌研究提供方法,腫瘤新藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了理論支撐和新思路,但潛在活性物質(zhì)的分離及其在體外抑制腫瘤的效果還需要進(jìn)一步驗證。

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