糖尿病腎病患者腸道菌群及炎癥因子變化的臨床意義

郭世強 劉春林 吳清念

1.華南理工大學(xué)附屬第六醫(yī)院臨床科研中心實驗室，廣東佛山 528200；2.華南理工大學(xué)附屬第六醫(yī)院檢驗科，廣東佛山 528200

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellius，T2DM）是以胰島素抵抗和胰島素分泌不足的病理生理為基礎(chǔ)的內(nèi)分泌代謝性疾病，糖尿病腎病是其常見的慢性并發(fā)癥，由于糖尿病腎病疾病進程快且缺少有效的干預(yù)手段，已成為終末期腎病的主要病因。T2DM 和腸道菌群關(guān)系密切，而腸道菌群會通過對腎素-血管緊張素系統(tǒng)產(chǎn)生影響，進而影響腎臟功能。研究證實，相比健康對照，糖尿病腎病患者腸道菌群存在失衡，表現(xiàn)厚壁菌門比例下降、擬桿菌門比例上升，同時腸道菌群介導(dǎo)炎癥的發(fā)生，加劇了腎功能的惡化。然而關(guān)于糖尿病腎病患者腸道菌群如何變化以及與炎癥因子的關(guān)聯(lián)性研究報道較少?；诖耍狙芯糠治鎏悄虿∧I病患者腸道菌群及其炎癥因子的變化，為臨床干預(yù)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至12月在華南理工大學(xué)附屬第六醫(yī)院住院治療的101 例T2DM 患者作為研究對象，根據(jù)24 h 尿白蛋白排泄率（24 h urinary albumin excretion rate，UAER）分成A 組（UAER≤30 mg/24 h，糖尿病正常蛋白尿，n=49）、B 組（30 mg/24 h300 mg/24 h，糖尿病腎病，n=22），同期選擇25 例健康者作為D 組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準（2019056），所有患者知情并簽署知情同意書。納入標準：患者符合2016年美國糖尿病協(xié)會發(fā)布的《糖尿病醫(yī)學(xué)診療標準》。排除標準：①有慢性腎臟疾病、慢性腸道疾病、腹部手術(shù)史者；②30 d 內(nèi)使用抗生素者；③年齡<18 歲者。

1.2 方法

通過醫(yī)院病歷系統(tǒng)收集研究對象基線特征包括年齡、性別、病程、體重指數(shù)（body mass index，BMI）等；實驗室相關(guān)檢查結(jié)果空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），試劑由北京利德曼生化有限公司提供，檢測儀器為日立7600；糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c），檢測儀器為HA-8180-日本愛科來糖化血紅蛋白儀HA-8180 及其配套試劑等。

1.3 炎癥因子檢測

抽取研究對象清晨空腹靜脈血3 ml，以離心力1000 g 離心10 min，吸取500 μl 血清于EP 管并放置-70℃冰箱保存。白介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，酶標儀為安圖生物PHNOMO 型，全部操作均嚴格按試劑盒說明書進行（購于武漢博迪萊莎生物科技有限公司）。

1.4 腸道菌群分析

采用傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法，參照文獻光岡法，對雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、梭菌屬四種腸道菌群進行定量培養(yǎng)。稱取研究對象5 g 新鮮糞便，加入生理鹽水稀釋，標本按照10 倍稀釋呈梯度系列至10。將標本接種在雙歧桿菌培養(yǎng)基、乳桿菌培養(yǎng)基、擬桿菌培養(yǎng)基、梭菌培養(yǎng)基上，分別放入普通培養(yǎng)箱（35℃，48 h）和厭氧培養(yǎng)箱（35℃，48～72 h）進行培養(yǎng)。根據(jù)菌落特征、菌體形態(tài)和革蘭染色并結(jié)合質(zhì)譜儀將細菌鑒定到屬或種水平，由本單位微生物實驗室提供MALDITOF MS 質(zhì)譜儀（布魯克-道爾頓公司）。根據(jù)平板菌落計數(shù)和稀釋度，按照公式（CFU/ml）=（標本質(zhì)量+稀釋量）/標本質(zhì)量×稀釋度×菌落數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究對象基線特征

四組的年齡、性別和BMI 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。D 組的FBG 和HbA1c 水平低于A 組、B組和C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；A 組、B 組和C 組的FBG 和HbA1c 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。C 組的糖尿病病程長于A 組和B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），A 組和B 組的糖尿病病程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 研究對象基本特征比較（±s）

2.2 四組腸道菌群的比較

C 組的雙歧桿菌和梭菌屬低于A 組、B 組和D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C 組的乳桿菌低于D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。A 組、B 組和D組的雙歧桿菌、乳桿菌和梭菌屬比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。四組的擬桿菌比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 四組腸道菌群的比較（lgCFU/g 濕便，±s）

2.3 四組炎癥因子水平的比較

D 組的IL-6 和TNF-α 水平低于A 組、B 組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；C 組的IL-6 和TNF-α 水平高于A 組、B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；B 組的IL-6 和TNF-α 水平高于A 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

表3 四組炎癥因子水平的比較（ng/L，±s）

2.4 腸道菌群與炎癥因子相關(guān)性分析

雙歧桿菌和梭菌屬與IL-6 和TNF-α 水平呈負相關(guān)（P<0.05）；乳桿菌和擬桿菌與炎癥因子水平無顯著相關(guān)性（P>0.05）（表4）。

表4 腸道菌群與炎癥因子的相關(guān)性

3 討論

腸道菌群與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病患者包括雙歧桿菌、乳桿菌和梭菌在內(nèi)的腸道益生菌群顯著減少，同時也表明益生菌群數(shù)量與炎癥因子表達有關(guān)。本研究采用光岡法對擬桿菌、梭菌、乳桿菌以及雙歧桿菌等四類與人類健康密切相關(guān)優(yōu)勢菌群進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者的雙歧桿菌、 乳桿菌和梭菌屬顯著下降。據(jù)孫雅嫻報道，與無腎病的糖尿病患者相比，糖尿病腎病患者的腸道乳桿菌減少。暴旭廣等采用高通量測序技術(shù)分析腸道菌群，發(fā)現(xiàn)T2DM 和糖尿病腎病患者包括產(chǎn)短鏈脂肪酸的毛螺旋菌屬、 柔嫩梭菌屬和羅斯菌屬等腸道菌群顯著減少。類似本研究腸道菌群的分析方法，李雷等報道，相比T2DM 組，糖尿病腎病組的雙歧桿菌和真桿菌數(shù)量顯著降低。但上述研究者并沒有進一步將糖尿病腎病分層比較。本研究結(jié)果顯示，A 組、B 組和D 組的雙歧桿菌、乳桿菌和梭菌屬比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。據(jù)報道，腸道雙歧桿菌和柔嫩梭菌等益生菌可以發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），參與單磷酸腺苷活化蛋白激酶和過氧化物酶體增殖物激活受體γ 信號通路，調(diào)控糖異生和脂肪合成。SCFAs 還可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子激活G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptors，GPR），促進腸道分泌胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和肽YY（pepetide tyrosine tyrosine，PYY），增強胰島素敏感性改善糖、脂和膽汁酸代謝水平，提示有益菌群的減少加劇了糖尿病腎病的進展。

本研究結(jié)果顯示，炎癥因子IL-6 和TNF-α 水平隨著糖尿病腎病嚴重程度逐漸升高。據(jù)報道，糖尿病腎病患者存在低度炎癥反應(yīng)，一方面革蘭氏陰性菌脂多糖經(jīng)由Toll 受體2 和Toll 受體4 相關(guān)途徑介導(dǎo)宿主的炎癥反應(yīng)，并通過激活核因子（nuclear facor-κB，NF-κB）誘導(dǎo)促炎細胞因子釋放，TNF-α、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和IL-6，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加劇腎臟損害。Winther 等分析不同分期1 型糖尿病腎病患者代謝物指標，發(fā)現(xiàn)三甲胺N 氧化物、硫酸吲哚酚和對甲酚硫酸鹽等代謝物與尿蛋白含量顯著相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，雙歧桿菌和梭菌屬與IL-6 和TNF-α 水平呈負相關(guān)（P<0.05），提示腸道有益菌的減少可能是導(dǎo)致血清炎癥指標上升的原因，與其他報道基本一致。補充益生菌、保持腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能完整性或可作為延緩糖尿病腎病進展的新策略。

綜上所述，腸道菌群與糖尿病腎病患者關(guān)系密切，腸道菌群失調(diào)可影響糖尿病及糖尿病腎病的進展。改變飲食結(jié)構(gòu)、補充益生菌等可能有助于恢復(fù)腸道菌群平衡。