同時(shí)測定醬油中4種甜味劑LC-MS/MS法的建立

雷軍

綿陽師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院（綿陽 621000）

醬油是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品，因其獨(dú)特的風(fēng)味、色澤及豐富的營養(yǎng)價(jià)值，已成為我國、日韓、東南亞各國乃至歐美人民飲食生活中不可或缺的調(diào)味品[1]。甜菊糖苷和甜菊雙糖苷是一類來源于甜葉菊葉片的四環(huán)二萜類糖苷物質(zhì)，被稱為繼甘蔗、甜菜之后，第三類健康綠色糖源[2-3]。甘草酸和甘草次酸等三萜類化合物是甘草的主要成分，也是甘草甜味的主要來源[4]。近年來，在醬油中陸續(xù)檢出甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸等物質(zhì)。這類物質(zhì)加入醬油中，可抑制鹽味和苦味，增加醬油的風(fēng)味[5]。但是甜菊糖苷加入醬油中有限量要求、甜菊雙糖苷和甘草次酸并未進(jìn)入食品添加劑管理[6]，若在加工過程中為了改善醬油口感超限量、超范圍添加此類物質(zhì)，對(duì)人身體有一定的損害。目前，檢測其中一種或兩種成分的方法有薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、液質(zhì)聯(lián)用法[9]，同時(shí)檢測這4種組分的方法只有高效液相色譜法[10]，這種方法存在靈敏度不高、假陽性以及甜菊糖苷和甜菊雙糖苷色譜峰未完全分開的問題[10]，導(dǎo)致無法對(duì)這4種物質(zhì)準(zhǔn)確定性及甜菊糖苷和甜菊雙糖苷準(zhǔn)確定量。

針對(duì)以上問題，試驗(yàn)建立了同時(shí)測定醬油中的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的LC-MS/MS法。在提高此類物質(zhì)定性能力的同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)甜菊糖苷、甜菊雙糖苷完全分離并實(shí)現(xiàn)甜菊糖苷和甜菊雙糖苷準(zhǔn)確定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙酸乙酯（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；無水硫酸鎂（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；C18粉末（批號(hào)：W103678，納譜分析技術(shù)有限公司）；甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（天津阿爾塔科技有限公司CAS：57817-89-7 99.7%）、甜菊雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（天津阿爾塔科技有限公司 CAS：41093-60-1 99.8%）、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品（天津阿爾塔科技有限公司 CAS：1405-86-3 80.6%）、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品（天津阿爾塔科技有限公司 CAS：471-53-4 99.9%）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DGU20A-API4500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；FA124型電子天平（上海市舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16型臺(tái)式高速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫培養(yǎng)振蕩器（常州冠軍儀器制造有限公司）；KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZH-2型旋渦儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1.3 色譜條件

液相色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C184.6 mm×150 mm 3.5 μm；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A：甲醇；B：0.1%甲酸。

1.4 質(zhì)譜條件

DGU20A-API4500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，質(zhì)譜參數(shù)：ESI正負(fù)離子同時(shí)掃描。離子源溫度：400 ℃；離子源電壓：4 500 V；CUR：20 psi；CAD：5 psi；GS1：30 psi；GS2：30 psi；多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)如表2所示。

表1 梯度洗脫

表2 多反應(yīng)監(jiān)測

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

1.5.1 4種甜味劑準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精確稱取10 mg甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、甜菊雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品至4個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，此溶液4種甜味劑的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，冷藏保存。

1.5.2 4種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)混合中間液的制備

準(zhǔn)確移取甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.01 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，此混合溶液中4種甜味劑的質(zhì)量濃度為1 μg/mL。

1.5.3 4種甜味劑混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

分別稱取6份空白醬油樣品各2.0 g（精確至0.01 g）置于25 mL離心管中，準(zhǔn)確移取0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)混合中間液，按照1.6小節(jié)進(jìn)行提取和凈化，配成質(zhì)量濃度為0，4，8，16，24，32和40 ng/mL的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.6 供試品溶液的制備

1.6.1 提取

稱取2.0 g（精確至0.01 g）混勻后的醬油試樣置于25 mL塑料離心管中，加入10 mL甲醇、4 g無水硫酸鎂、2 g C18粉末，旋渦1 min，振蕩提取10 min，超聲提取10 min，按10 000 r/min離心5 min，取上清液置于另一25 mL塑料離心管，重復(fù)上述步驟，合并兩次上清液，用甲醇定容至25 mL，待凈化。

1.6.2 凈化

取1 mL上述待凈化溶液至于10 mL塑料離心管中，加入100 mg無水硫酸鎂、50 mg C18粉末，渦旋混合2 min，按10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，濾液供上機(jī)分析。

1.7 提取溶劑的選擇

根據(jù)4種甜味劑的特性，試驗(yàn)依此選擇水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯為提取溶劑，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸為質(zhì)控樣，按照1.6小節(jié)供試液的制備步驟，比較測得的含量。

1.8 提取次數(shù)的選擇

采用1.7小節(jié)確定的提取溶劑，按照1.6.1小節(jié)的提取步驟，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸為質(zhì)控樣，提取1，2，3和4次，其余步驟同1.6小節(jié)，比較測得的含量。

1.9 監(jiān)測模式的選擇

將4種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)混合中間液注入液質(zhì)聯(lián)用儀，分別記錄這4種物質(zhì)的一級(jí)質(zhì)譜圖，分別選取特異性強(qiáng)的監(jiān)測模式作為試驗(yàn)中甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸的監(jiān)測模式。

1.10 方法的準(zhǔn)確性

稱取9份2.0 g混勻后的空白醬油試樣于25 mL塑料離心管，3份為一組，分別加入0.1，0.4和0.8 mL甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按照1.6小節(jié)供試品溶液制備方法操作，配制成為50，200和400 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸質(zhì)控樣。

1.11 精密度試驗(yàn)

稱取6份2.0 g混勻后的空白醬油試樣于25 mL塑料離心管，按照1.6小節(jié)樣品制備方法，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸質(zhì)控樣。將上述6份溶液注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀，測得甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸的峰面積，分別代入各自基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度及SRSD值，即得精密度結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表3可知，4種甜味劑在0～40 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)R均＞0.99。表明這4種甜味劑在0～40 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。故選用0～40 ng/mL為試驗(yàn)的線性范圍。

表3 4種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取溶劑的選擇

由圖1可知，甘草次酸在水溶液中溶解度較小，甘草酸在乙醇中難溶，除了甘草次酸，其余三種化合物在乙酸乙酯中的溶解度均較小。這四種化合物在甲醇中均有很好的溶解性?？赡艿脑蚴巧鲜鋈軇┑臉O性不同，化合物按照“相似相溶”原則，在每種溶液中溶解度不同。綜上，選擇甲醇為試驗(yàn)的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的考察

2.3 提取次數(shù)的選擇

由圖2可知，這四種化合物在僅提取一次的情況下，測得值均在80 μg/kg左右，不能提取完全，提取2次以上的測得值明顯高于僅提取一次的測得值，且隨著提取次數(shù)的增加，測得值無明顯提升，考慮到操作的簡便性、經(jīng)濟(jì)性以及環(huán)保等因素，試驗(yàn)選擇提取2次。

圖2 不同提取次數(shù)的考察

2.4 監(jiān)測模式的選擇

由圖3～圖4可知：4種甜味劑在負(fù)模式下均有響應(yīng)，甘草酸在正模式下沒有響應(yīng)；甜菊糖苷和甜菊雙糖苷在正模式下以加鈉峰的形式出現(xiàn)。由圖5～圖6可知：甜菊糖苷在負(fù)模式下同時(shí)出現(xiàn)803.5和641.4兩個(gè)分子離子峰，嚴(yán)重干擾甜菊雙糖苷的分子離子峰，這與朱靜雯等[11]研究結(jié)果相同。為避免干擾，甜菊糖苷、甜菊雙糖苷選取正模式的監(jiān)測模式；甘草酸、甘草次酸選擇負(fù)模式的監(jiān)測模式。

圖3 4種物質(zhì)負(fù)模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 4種物質(zhì)正模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖

圖5 甜菊糖苷負(fù)模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖

圖6 甜菊糖苷負(fù)模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖

2.5 方法的準(zhǔn)確性

由表4可知，甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸在50，200和400 μg/kg回收率依次在90.5%～94.9%，87.7%～94.6%，86.9%～97.3%和87.1%～96.5%之間，滿足試驗(yàn)要求。

表4 不同濃度下4種甜味劑回收率結(jié)果

2.6 方法的精密度

由表5可知，4種甜味劑用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD表示，SRSD＜5%。表明此方法的精密度良好，符合要求。

表5 4種甜味劑精密度結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了同時(shí)測定醬油中甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的LC-MSMS法，優(yōu)化了試驗(yàn)的提取溶劑及次數(shù)，考察了方法的線性方程、監(jiān)測模式、專屬性、檢出限、定量限、方法回收率以及精密度。該方法的監(jiān)測模式為甜菊糖苷、甜菊雙糖苷正模式；甘草酸、甘草次酸為負(fù)模式。該方法具有操作簡單、定性能力強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，解決了現(xiàn)有液相方法定性能力不強(qiáng)、甜菊糖苷和甜菊雙糖苷因無法完全分開導(dǎo)致的定量不準(zhǔn)確的問題。