基因工程和代謝工程在甜菊糖生產(chǎn)上應(yīng)用進展

余波穎王寧琳李國婧夏亦薺

（1.香港浸會大學(xué)生物系，香港　999077；2.浙江商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州　310083；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特　010018）

基因工程和代謝工程在甜菊糖生產(chǎn)上應(yīng)用進展

余波穎1王寧琳2李國婧3夏亦薺1

（1.香港浸會大學(xué)生物系，香港999077；2.浙江商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州310083；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018）

甜菊糖是由原產(chǎn)于南美的多年生草本植物甜葉菊所產(chǎn)生的一種糖苷。中國廣西一帶的甜茶樹也產(chǎn)生類似的糖苷。它們作為一種低能量、高甜度的天然甜味劑近幾年在歐美、日本及中國得到越來越普遍的利用。中國是世界上最大的甜葉菊種植國。近年來甜菊糖代謝途徑中的酶蛋白和有關(guān)基因的分離以及甜葉菊轉(zhuǎn)化體系的建立，為通過遺傳和代謝工程提高甜菊糖產(chǎn)量和改變甜菊糖苷的組成奠定了基礎(chǔ)，也為利用微生物和其他高生物量作物產(chǎn)生甜菊糖提供了新的途徑。就甜葉菊的生產(chǎn)、甜菊糖的利用現(xiàn)狀以及甜菊糖在植物體內(nèi)的代謝途徑進行了總結(jié)。

甜葉菊；甜菊糖；甜味劑；代謝工程；遺傳工程

甜菊糖，或稱甜菊糖苷（Steviol glycoside），原產(chǎn)于南美洲，是甜葉菊（Stevia rebaudiana）的提取物。甜菊糖（Stevia sugar）作為新一代的天然高倍甜味劑已在近幾年得以迅速發(fā)展?，F(xiàn)在，甜菊糖已成為第一代糖源（蔗糖）和第二代糖源（阿斯巴甜）的替代品，被稱為世界“第三代天然零熱量（零卡）健康糖源”甜葉菊長期以來被當?shù)鼐用裼糜谂莶韬取Ｔ诎臀骱桶屠?，甜菊糖作為天然食糖已?jīng)有幾百年的歷史。這類糖苷的化學(xué)成分由雙萜苷元和糖基組成。其甜度為蔗糖的200-300倍，且在人體內(nèi)基本不會被吸收和代謝，因而是一種天然的無能量甜味劑。甜葉菊的甜菊糖主要在葉片合成，自甜葉菊葉片提取的甜菊苷是一種白色晶狀粉末，外觀與蔗糖、葡萄糖類似，但帶輕微的苦味。

目前中國是甜葉菊種植的第一大國，而美國、日本是甜菊糖的主要消費國［1，2］。隨著對低能量高甜度的甜味劑的需求量不斷增加，甜菊糖這一天然甜味劑的市場潛力將持續(xù)增長。但目前甜菊糖種植加工仍屬新興產(chǎn)業(yè)，在原料的生產(chǎn)、提取純化及銷售利用等方面都有發(fā)展?jié)摿?。對于甜菊糖合成途徑有關(guān)基因的分離和現(xiàn)代基因工程的發(fā)展又為甜菊糖的生產(chǎn)提供了新的手段。本文就甜菊糖利用現(xiàn)狀以及甜菊糖在植物體內(nèi)的代謝途徑進行了總結(jié)并進一步分析了基因工程及遺傳和代謝工程在甜菊糖生產(chǎn)上的應(yīng)用現(xiàn)狀和進展。

1 甜菊糖的生物合成途徑及在體內(nèi)代謝

甜葉菊中的甜菊糖是從甜葉醇（Steviol）這一萜類化合物所合成的多種甜菊糖苷（Steviol glycoside）的混合物。甜菊糖苷的基本分子結(jié)構(gòu)，見圖1和表1。

圖1 甜葉醇及甜菊糖苷的結(jié)構(gòu)

表1 常見的甜菊糖苷

甜菊糖苷是由甜葉醇加糖基（主要是葡萄糖）后形成。非糖體部分的甜葉醇為雙萜類（Diterpenoid）衍生物，與植物體內(nèi)其他萜類化合物（Terpenoid）一樣，是通過異戊二烯生物合成途徑所產(chǎn)生（圖2）［3］。

這一合成途徑也參與植物體內(nèi)其他多種重要代謝產(chǎn)物的合成，包括胡蘿卜素、葉綠素、赤霉素和油菜素。甜葉醇是由異貝殼杉烯酸（ent-kaurenoic acid，ent-KA）合成，而異貝殼杉烯酸也是赤霉素合成的前體（圖2）。甜葉菊這類植物含有其所特有的貝殼杉烯酸-13-羥化酶（ent-kaurenate 13-hydroxylase，KAH），它將異貝殼杉烯酸羥化成甜葉醇。隨后幾個葡糖基轉(zhuǎn)化酶（UGT）再用UDP-葡糖基為底物將糖基轉(zhuǎn)移到甜葉醇的C-13和C-19的羥基上以合成不同的甜菊糖苷。貝殼杉烯酸-13-羥化酶催化甜菊糖苷合成的第一步，是這一合成途徑最關(guān)鍵的酶。

甜菊糖占葉片干重的10%左右，其濃度及不同糖苷比例根據(jù)不同的甜葉菊品種、生長條件和生長時期而變化。其中甜菊雙糖苷A（Rebaudioside A）（表1）約占20%-50%。從甜葉菊提取的甜菊糖混合物略帶苦澀味及薄荷醇味，但甜菊雙糖苷A的甜味特性較好，其甜度較其他甜菊糖苷大而苦味弱［4］，因而甜菊雙糖苷A純提取物作為甜味劑的用途更廣，而增加甜菊雙糖苷A的產(chǎn)量也是甜葉菊育種的重要目標之一。降低甜菊糖的苦澀味也可以在提取后通過化學(xué)修飾的方法來達到，如用α-淀粉酶處理［5］。甜葉菊還含有低量的甜菊雙糖苷M（Rebaudioside M），它的甜度不亞于甜菊雙糖苷A，并且苦味比甜菊雙糖苷A弱［6］，因而有望在將來有更廣的利用。

作為糖苷，甜菊糖含有葡萄糖和來自甜葉醇的非糖體部分。甜菊糖苷的甜味是由人體舌頭味覺細胞上的糖受體對甜菊糖苷中的葡萄糖起反應(yīng)而感覺到。一般糖基多的甜菊糖苷（如甜菊雙糖苷A、甜菊雙糖苷M）比糖基少的甜菊糖苷（如甜葉苷、甜葉醇單糖苷等）味道更甜。甜菊糖所帶苦味是因其非糖體部分被舌頭味覺細胞上的苦味受體所識別而致。進入人體的消化道后，甜菊雙糖苷A被轉(zhuǎn)化為甜葉苷，甜葉苷再被降解為葡萄糖和甜葉醇。此時釋放的葡萄糖不會被吸收到血液中，而是被結(jié)腸里的大腸桿菌所利用。甜菊醇不能被人體降解而被排泄出去［7］。

2 參與甜菊糖合成的重要酶及基因

參與甜菊糖苷合成的基因大多已被克隆。作為甜葉醇前體的異貝殼杉烯酸也參與赤霉素的合成，而赤霉素是調(diào)控植物正常生長發(fā)育必需的激素，因而植物都能合成異貝殼杉烯酸。但一般植物缺乏將異貝殼杉烯酸轉(zhuǎn)化為甜葉醇這一催化甜菊糖合成途徑關(guān)鍵步驟的貝殼杉烯酸-13-羥化酶（Kaurenoicacid_13hydroxylase，KAH）。 已 從 甜葉菊中克隆編碼KAH的基因，該基因?qū)儆诩毎豍450（Cytochrome p450）家屬的一員［8，9］。甜葉醇的C-13和C-19上羥基都有可能被糖基化而產(chǎn)生甜菊糖苷。這一系列的糖基化是由葡糖基轉(zhuǎn)化酶（UDP-glucosyltransferase，UGT）所催化。UGT也是一個大的基因家族，植物有上百個不同的UGT。有些UGT有底物特異性，而有的則顯多功能性。甜葉醇的糖基化是由C-13開始，然后C-19羧基才能被糖基化。Richman 等［10］從12個甜葉菊的UGT中找到了3個參與甜菊糖苷合成的UGT。其中UGT85C2催化C-13的糖基化，UGT74G1將葡萄糖加到C-19上，而UGT76G1則將另一葡萄糖加到C-13葡萄糖的C3位上產(chǎn)生甜菊雙糖苷A（圖3）。Yang等［11］發(fā)現(xiàn)一個UGT76G1基因的功能缺失的甜葉菊突變體，其甜菊雙糖苷A的含量極低。此發(fā)現(xiàn)進一步證明UGT76G1對甜葉菊體內(nèi)合成甜菊雙糖苷A起主要作用。利用RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測序）技術(shù)，Chen 等［12］近來對3個甜菊糖含量或糖苷成分有差異的甜葉菊材料的轉(zhuǎn)錄組作了測序發(fā)現(xiàn)143個UGT。這些材料與甜菊糖合成有關(guān)的某些UGT基因的序列或表達的差異，可能與它們之間甜菊糖苷成分的差異有關(guān)聯(lián)。

圖2 甜菊糖苷的生物合成途徑

甜菊糖苷的合成應(yīng)在細胞質(zhì)中進行，因上面所述3個甜菊糖苷合成的UGT蛋白都定位于細胞質(zhì)［8］。而甜菊糖苷合成后則主要積累于細胞中的液泡里。它們從細胞質(zhì)到液泡的轉(zhuǎn)運可通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ABC transporter）、多藥和有毒化合物擠出蛋白（Multidrug and toxic compound extrusion，MATE）來實現(xiàn)。

擬南芥一般并不具備甜菊糖苷合成途徑。不過Kamiya和Yamaguchi等［13］發(fā)現(xiàn)擬南芥的其中一個細胞色素p450蛋白CYP714A2可使貝殼杉烯酸轉(zhuǎn)化成為甜葉醇。CYP714A2的過量表達可使擬南芥積累甜葉醇。尚不清楚其他正常不累積甜菊糖的植物是否也有類似功能的基因。

Guleria等［14］近來用在甜葉菊葉片中注射（Infiltrate）農(nóng)桿菌的辦法通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）來抑制甜菊糖合成途徑中的幾個UGT基因的表達。對編碼KAH、UGT74G1和UGT76G1等幾個基因分別用RNAi進行不完全的沉默后，葉片中甜菊糖苷的含量降低了22%-63%。不過此研究未能將甜菊糖苷的不同成分作分別檢測，因而難以說明這些基因在甜菊糖苷生物合成的這幾個步驟中的具體功能。因為用注射農(nóng)桿菌的辦法，RNAi構(gòu)建物不能進入葉片的所有細胞，并且RNAi基因只能瞬時表達，所以一般只能對有關(guān)基因表達作部分沉默，使這一方法的效果受到限制。建立有效的甜葉菊穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系對甜葉菊進行分子生物學(xué)研究和分子改良將是重要的關(guān)鍵技術(shù)問題。最近已有關(guān)于將甜葉菊轉(zhuǎn)化成功的報道［15］。

3 甜葉菊和甜菊糖的食用安全性

雖然甜葉菊在飲食上的利用已有幾十年（如日本）至幾百年（如南美）的歷史，但1985年的一項報道指出甜菊醇會引起小鼠致癌［16］。這一報道及其他原因使得美國和歐洲一些國家在20世紀90年代對甜菊糖實施禁用或者限制使用。但這一研究結(jié)果已被認為有誤［17］。隨后的多項研究表明甜菊醇或甜菊糖苷對人體均無害處［8，18］。2006年世界衛(wèi)生組織（WHO）對多個有關(guān)甜葉菊和甜菊糖的毒性研究報告作評定后認定甜菊糖對人體安全［19］。WHO的食品添加劑專家委員會將甜菊糖苷可接受的每日攝取量定為每公斤體重0-4 mg［20］。美國聯(lián)邦藥檢局（FDA）于2008年批準甜菊糖可作為甜味劑在飲料、食品和醫(yī)藥中的甜味劑使用。并于2009年將甜菊雙糖苷A定為“公認安全的成分（Generally recognized as safe，GRAS）”［21］。甜菊雙糖苷M也在近期被FDA認定為“公認安全的成分”［6］。甜葉菊的粗提物尚未被FDA批準作為食品添加劑使用。歐盟于2011年批準甜菊糖可用作甜味劑用于食品和飲料［22］。除了作為甜味劑外，也有不少報道稱甜菊糖或廣西甜茶可治療或預(yù)防多種疾病或有其他保健功效，如抗癌、抗高血壓、抗高血糖、消炎等［23-26］。這類報道中有些未經(jīng)嚴密的科學(xué)論證，所以結(jié)論有待進一步證實。但是作為甜味劑，國際上對甜菊糖的需求在近幾年還將逐年增長。

4 基因工程和植物代謝工程在甜菊糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

參與甜菊糖合成途徑的基因的克隆為通過遺傳和代謝工程改良甜菊糖的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。其中一個可嘗試的途徑是通過轉(zhuǎn)基因的方法將與甜菊糖合成有關(guān)的KAH基因以及UGT基因在甜葉菊里過量表達以促使將更多異貝殼杉烯酸轉(zhuǎn)化為甜菊糖苷。增加異貝殼杉烯酸的合成也有望增加甜菊糖苷的合成。另一個值得考慮的途徑是篩選甜葉菊赤霉素合成缺失突變體，如異貝殼杉烯酸氧化酶的突變體。異貝殼杉烯酸氧化酶通過催化異貝殼杉烯酸的氧化參與赤霉素的合成。這類突變體因不能從異貝殼杉烯酸合成赤霉素，植物體內(nèi)積累較高的異貝殼杉烯酸［26］，因而有更多的異貝殼杉烯酸可用于甜菊糖的合成。但植物的赤霉素含量低或降低其合成對增加甜菊糖合成的效果或許不大。且赤霉素缺失突變會影響植物的正常生長，降低生物量。這一不利之處或許可以通過田間施用合成的赤霉素克服。不過在擬南芥中將甜葉菊的UGT85C2基因過量表達不僅降低了赤霉素含量，還降低了葉綠素的合成，使植物生長受阻［27］。因為甜菊糖合成和累積可能主要發(fā)生在葉片的腺毛細胞中［28］，利用腺毛細胞特異的啟動子來進行這類基因工程操作可能會有更好的效果。

4.1 基因工程在甜菊糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

通過植物基因工程手段來改變甜菊糖合成途徑某個特定基因的表達量有望改變甜菊糖的成分組成。如增強UGT76G1基因的表達，有望增加植物體內(nèi)甜菊雙糖苷A的累積。

近年來基因組編輯（Genome editing）技術(shù)的發(fā)展已使改變植物的內(nèi)在基因變得越來越容易。其中CRISPR［29］被認為是目前改變植物基因最有效的體內(nèi)基因編輯方法［30］，已在擬南芥、水稻、小麥和玉米等植物中成功應(yīng)用。理論上來說，對于任何能進行成功轉(zhuǎn)化的植物，都可利用這項技術(shù)改變特定基因的序列。利用這一方法除了將基因定點敲除外，也可通過改變基因序列來改變其編碼的蛋白的功能。此外，用該方法來改變基因啟動子區(qū)域的序列可達到影響基因表達的目的。

同許多農(nóng)作物相比，甜葉菊生長緩慢。如能將KAH和有關(guān)的UGT基因轉(zhuǎn)入生長快的植物中，如煙草、玉米等，使后者也能合成甜菊糖，則有可能有效地提高甜菊糖的產(chǎn)量。除了利用轉(zhuǎn)基因方法通過其他植物生產(chǎn)甜菊糖外，這些基因工程植物也可能作為新的品種直接食用，如培育出能合成甜菊糖的超甜玉米、甜番茄等。

4.2 代謝工程在甜菊糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

目前甜菊糖的生產(chǎn)主要通過從甜葉菊中提取甜菊糖苷。通過對甜葉菊葉片沸水的過濾液用樹脂吸附、脫鹽、濃縮干燥后得到甜菊糖苷初提物。初提物為各種甜菊糖苷的混合物及少量其他成分。這種初提物的味感并不好，對不同甜菊糖苷進一步提純則需用較復(fù)雜的分離程序，使成本增加。利用甜葉菊懸浮細胞或愈傷組織，也可生產(chǎn)甜菊糖。通過一些脅迫培養(yǎng)基，可使懸浮細胞中甜菊糖的含量達到5%以上［32］。不過與微生物相比，植物細胞培養(yǎng)的成本高、次生產(chǎn)物的產(chǎn)量低，目前利用植物細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)天然次生產(chǎn)物的成功例子還不多。

利用基因和代謝工程方法使微生物合成甜菊糖有望成為未來甜菊糖生產(chǎn)的重要途徑［33］。酵母、大腸桿菌和很多藻類具有生長快、培養(yǎng)成本低、容易進行基因和代謝工程操作、產(chǎn)量高和產(chǎn)物提取容易等優(yōu)越性。這些微生物具有萜類化合物的合成途徑。如酵母能合成單萜和雙萜。還有一些微生物具有合成赤霉素的所有基因。赤霉素最初就是從感染水稻的赤霉菌（Gibberella fujikuroi）中分離所得。因此只需在這類微生物中引入KAH和UTG等少數(shù)幾個基因即可使它們合成甜菊糖苷。利用微生物合成的另一個優(yōu)點是比較容易采用基因定點突變進行操作來提高和鑒定其所編碼的酶蛋白的功能。如能將合成的甜菊糖分泌到體外，則更能降低提取的成本。

基因工程的采用為甜菊糖的生產(chǎn)和提取提供了更多的選擇。甜菊糖產(chǎn)量的提高和價格的降低將進一步開拓甜菊糖作為甜味劑的市場。

5 展望

甜菊糖作為高倍甜味劑在近幾年得以日益發(fā)展。一些大的公司如可口可樂、百事可樂等已利用甜菊雙糖苷A作為甜味劑生產(chǎn)零能量飲料。目前，我國已有多家生物技術(shù)公司投入資金到甜菊糖生產(chǎn)的項目。甜菊糖的市場可望在未來繼續(xù)擴大，對以下領(lǐng)域的研發(fā)將促進甜菊糖的生產(chǎn)和利用。

一是通過傳統(tǒng)方法降低甜菊糖原料的生產(chǎn)成本：（1）選擇、培育高產(chǎn)的甜葉菊品種來提高產(chǎn)量以降低成本；（2）通過育種提高甜葉菊葉片中甜菊糖的含量。開發(fā)一些化學(xué)藥劑來改變甜葉菊植物體內(nèi)的相關(guān)代謝途徑，使其大量合成的甜菊糖，特別是提高甜菊雙糖苷A的含量。

二是利用CRISPR等基因組編輯方法對甜葉菊中甜菊糖合成途徑有關(guān)的內(nèi)在基因進行編輯，以提高甜菊糖的含量或改變不同甜菊糖苷的成分組成。從長遠來說，可通過分子生物技術(shù)手段，將合成甜菊糖的途徑轉(zhuǎn)入目前不能合成甜菊糖，但生長快速的植物中，以培育新的生產(chǎn)甜菊糖的作物。

三是基因和代謝工程為提高甜菊糖產(chǎn)量和降低成本提供了極大的發(fā)展空間?？蓪⑻鹁仗呛铣赏緩接嘘P(guān)的基因轉(zhuǎn)入微生物中，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)甜菊糖。

四是開發(fā)國內(nèi)甜菊糖的消費市場。中國居民的高倍甜味劑的消費水平明顯低于世界平均消費水平。但隨著人們對飲食健康要求的提高，甜菊糖在低能量食品和飲料中的利用可望擴大。開發(fā)以甜菊糖為高倍甜味劑的飲料和食品在中國有相當大的市場潛力。

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（責任編輯 狄艷紅）

Application Prospect of Genetic Engmeering and M etabolic Engineering in Im proving Its Production of Steviol G lycoside

Yu Boying1Wang Ninglin2Li Guojing3Xia Yiji1
（1. Department of Biology，Hong Kong Baptist University，Hong Kong999077；2. Zhejiang Business College，Hangzhou310083；3. College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018）

Stevia sugar is a unique glycoside produced from stevia（Stevia rebaudiana）of a perennial herb originally growing in South America. Sweet tea tree（Rubus suavissimus）， mainly growing in the Guangxi area of China， also produces similar glycoside. In recent years，stevia sugar as a natural high-intensity sweetener has increasingly been used in USA， European countries， Japan， and China. Stevia is extensively cultivated in China. Here we review the current status of stevia production and usage of stevia sugar， as well as progresses on understanding its biosynthetic pathway. Recent advances on identifying the enzymes involved in steviol biosynthesis， isolating relevant genes as well establishing stevia transformation system provide the fundamentals toward improving the production of steviol glycoside and altering the constitute of stevia glycoside through genetic and metabolic engineering， also inspire the novel measures of producing stevia sugar using microorganisms and high biomass crops.

Stevia rebaudiana；stevia sugar；sweetener；metabolic engineering；genetic engineering

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.002

2014-11-02

余波穎，女，博士研究生，研究方向：花發(fā)育調(diào)控機理；E-mail：yuboying225@hotmail.com

夏亦薺，男，博士，教授，研究方向：植物抗病分子機理、氧化脅迫和抗性機理、花發(fā)育的調(diào)控機理、功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)；E-mail：yxia@hkbu.edu.hk