抗鐮刀菌單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性表達(dá)條件的研究

胡祖權(quán)李和平吳平廖玉才張靜柏

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽　550004；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類作物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，武漢　430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢　430070；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢　430070）

抗鐮刀菌單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性表達(dá)條件的研究

胡祖權(quán)1，2，3李和平2，4吳平2，4廖玉才2，3張靜柏2，3

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽550004；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類作物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢430070；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢430070）

通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)抗鐮刀菌單鏈抗體在大腸桿菌周質(zhì)中高效可溶性表達(dá)。將抗鐮刀菌單鏈抗體FvSG7轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中，確定誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)時間條件下培養(yǎng)重組大腸桿菌，通過Western雜交和ELISA檢測分析單鏈抗體的可溶性表達(dá)情況以及抗體的活性。重組大腸桿菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5時加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，25℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h可獲得最大量的可溶性單鏈抗體。通過對誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間等表達(dá)條件的優(yōu)化，可以顯著提高FvSG7抗體在大腸桿菌XL1-Blue周質(zhì)中的表達(dá)量。

單鏈抗體；可溶性表達(dá)；大腸桿菌；優(yōu)化

鐮刀菌（Fusarium）是一種世界范圍內(nèi)非常重要的植物病原真菌，能侵染小麥、玉米和水稻等多種作物造成嚴(yán)重病害［1］。鐮刀菌不僅能夠污染田間作物、倉貯糧食和飼料，還能夠引起蔬菜水果以及玉竹、黃芪、三七和半夏等藥用植物的根（莖）腐病［2-5］。同時，一些茄腐鐮刀菌（F. solani）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和串珠鐮刀菌（F. verticillioides）等還能引起難于根治的人皮膚炎、角膜炎或系統(tǒng)性感染［6］。更嚴(yán)重的是，鐮刀菌在侵染過程中會產(chǎn)生大量真菌毒素，包括脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、伏馬菌素（Fumonisin，F(xiàn)B）和T-2毒素等，這些毒素在作物、糧食和飼料中積累，進(jìn)入食物鏈，嚴(yán)重危害人、畜健康［1，7］。鐮刀菌毒素具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性以及致癌、致畸和致突變等作用，能夠引起人和動物急性或慢性中毒，如DON能夠引起嘔吐、FB可誘導(dǎo)馬腦白質(zhì)軟化癥（ELEM）和豬肺水腫（PPE）等。我國鐮刀菌毒素的污染處于高發(fā)生率和高含量的嚴(yán)峻態(tài)勢［8，9］，監(jiān)控鐮刀菌的污染情況有助于在田間病害大面積發(fā)生前采取有效的預(yù)防措施，也可控制真菌毒素進(jìn)入食品或飼料中。

免疫學(xué)檢測方法具有操作簡單、價格低廉、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)，已被廣泛用于真菌及其毒素的檢測分析［10-12］。單鏈抗體（Single-chain variable fragment，scFv）是具有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段，由VH片段和VL片段通過連接肽（Linker）連接而成，不僅具備良好的親和力和特異性，還可以在大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，制備過程簡單，生產(chǎn)周期短［13，14］，在免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用前景十分廣泛。為了發(fā)展高效廉價的鐮刀菌免疫學(xué)檢測方法，本課題組在構(gòu)建雞源單鏈抗體基因文庫的基礎(chǔ)上，通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得高親和力的抗鐮刀菌單鏈抗體FvSG7及其編碼基因［10］，已用于構(gòu)建抗體融合蛋白及免疫檢測，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。單鏈抗體表達(dá)后由于不需要糖基化修飾過程，可以采用比真核表達(dá)系統(tǒng)更為簡單的大腸桿菌生產(chǎn)技術(shù)制備。但是，包涵體表達(dá)的單鏈抗體復(fù)性后的生物活性往往受到影響，而且增加生產(chǎn)成本，限制了單鏈抗體的應(yīng)用。因此，高效可溶性表達(dá)是其生產(chǎn)應(yīng)用的前提條件。影響蛋白原核表達(dá)的影響因素很多，包括宿主菌、表達(dá)載體、目的基因、溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時間等，課題組在前期工作中已成功在大腸桿菌XL1-Blue中表達(dá)出可溶性FvSG7單鏈抗體［10］，但其表達(dá)量需進(jìn)一步提高。因此，本研究重點(diǎn)對該單鏈抗體的最適誘導(dǎo)表達(dá)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間等因素進(jìn)行優(yōu)化，以提高重組大腸桿菌周質(zhì)中可溶性單鏈抗體的表達(dá)量，為后期大規(guī)模的表達(dá)、純化和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 抗鐮刀菌單鏈抗體編碼基因FvSG7（GenBank登錄號：KC304795）為本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得；重組質(zhì)粒pHENHi-FvSG7由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌（Escherichia coli）XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞購于Stratagene公司；重組大腸桿菌XL1-Blue［pHENHi-FvSG7］由本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pHENHi-FvSG7到XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞中獲得。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨和酵母提取物購自英國Oxiod公司；堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記羊抗鼠抗體購自美國Sigma公司；抗His單克隆抗體購自天根生化科技（北京）有限公司；BCIP/NBT顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。Ni-NTA蛋白純化基質(zhì)購自Qiagen公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司；對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）購自Amresco公司；氨芐青霉素（Amp）和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自中國MDBio公司；引物由上海英駿有限公司合成。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑配制 LB培養(yǎng)基：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）NaCl，pH 7.0；2× TY培養(yǎng)基：1.6%（w/v）胰蛋白胨，1%（W/V）酵母提取物，0.5%（W/V）NaCl，pH7.0；PBS緩沖液：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH7.2-7.4；PBST溶液：含0.1%（V/V）的PBS溶液；TBS緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，150 nmol/L NaCl，pH8.0；TBST溶液：含0.1%（V/V）Tween-20的TBS溶液；PPP溶液：30 mmol/L Tris-HCl，20%（W/V）蔗糖，pH 8.0；Buffer B：50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0；Buffer C：50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的選擇 取5 μL甘油保存的重組大腸桿菌XL1-Blue［pHENHi-FvSG7］接種于20 mL含1%（W/V）葡萄糖和100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液分別接種至100 mL含100 μg/mL Amp的LB和2× TY培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.5，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h，收集周質(zhì)蛋白進(jìn)行ELISA檢測。

1.2.2 單鏈抗體誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 甘油保存菌過夜培養(yǎng)后，取2 mL菌液接種至200 mL含100 μg/mL Amp的新鮮培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.5，按5 mL/管分裝至細(xì)菌培養(yǎng)管中，對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先，在加入終濃度為1 mmol/L的IPTG條件下，分別在25℃、30℃和37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)8 h，確定單鏈抗體的誘導(dǎo)表達(dá)溫度；接著，在該溫度條件下，分別加入終濃度為0、0.01、0.03、0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8和2.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8 h，分析IPTG濃度對單鏈抗體表達(dá)量和活性的影響；最后，在確定的最適溫度和IPTG濃度條件下，分別誘導(dǎo)表達(dá)0、2、4、6、8、10、12 h，并測定菌液OD600nm值。

1.2.3 滲透壓休克法提取大腸桿菌周質(zhì)蛋白 收集4 mL菌液于離心管中，3 000 r/min離心5 min，菌體用300 μL PPP溶液（含1 mmol/L EDTA）重懸，冰上放置15 min后，在4℃條件下6 000 r/min離心15 min，收集上清。沉淀重懸于600 μL終濃度為5 mmol/L的MgCl2溶液（含1 mmol/L EDTA）中，冰浴15 min后，在4℃條件下6 000 r/min離心15 min，收集上清合并后用于Western blot和ELISA檢測分析。

1.2.4 Western blot分析 取10 μL提取的周質(zhì)蛋白經(jīng)過12% SDS-PAGE電泳后，利用半干轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad）將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC膜）上，于封閉液（含5%脫脂奶粉的TBS溶液）中37℃放置2 h。經(jīng)TBST洗滌3次后，加入10 mL封閉液稀釋（1∶5 000）的抗His單克隆抗體，室溫平緩搖動2 h。TBST洗滌3次，再用封閉液稀釋（1∶5 000）的AP標(biāo)記羊抗鼠抗體孵育2 h。最后，經(jīng)TBST和TBS分別洗滌5次后，用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色10-20 min。加入蒸餾水終止顯色反應(yīng)，觀察顯色情況并用GS-800掃描儀（美國Bio-Rad）掃描。

1.2.5 ELISA檢測 在ELISA板孔中加入100 μL SCWPs（20 μg/mL）或PBS（對照），37℃水浴包被2 h，用PBS洗滌3次；加入150 μL封閉液（含2%脫脂奶粉的PBS溶液），37℃水浴封閉2 h，用PBS洗滌3次；加入90 μL封閉液和10 μL周質(zhì)蛋白，37℃反應(yīng)1.5 h，用PBST和PBS分別洗滌3次；依次加入100 μL封閉液稀釋（1∶5 000）的抗His單克隆抗體和AP標(biāo)記羊抗鼠抗體，37℃反應(yīng)1.5 h，用PBST和PBS分別洗滌3次；加入100 μL 0.2%（W/V）pNPP顯色液，黑暗條件下反應(yīng)15-30 min，再加入50 μL 3 mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD405nm讀值。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基的選擇

采用常用的LB和2× TY培養(yǎng)基培養(yǎng)重組大腸桿菌，檢測其生長速度和單鏈抗體的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5時，在LB培養(yǎng)基中需要培養(yǎng)約5 h，而在2× TY培養(yǎng)基中僅需3.5 h左右，說明重組大腸桿菌在2× TY培養(yǎng)基中生長速度更快，這可能與其含有更多的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8 h后，ELISA檢測顯示LB和2× TY培養(yǎng)基培養(yǎng)后收集的菌體周質(zhì)蛋白的平均值分別為1.019和1.472，后者約為前者的1.5倍。因此，選擇2× TY培養(yǎng)基作為FvSG7抗體的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基。

2.2 溫度對單鏈抗體表達(dá)的影響

在加入IPTG終濃度為1 mmol/L的情況下，分別在25、30和37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)重組E. coli表達(dá)8 h，滲透壓休克法提取細(xì)胞周質(zhì)蛋白，通過Western blot分析單鏈抗體的表達(dá)情況如圖1所示，單鏈抗體在25℃誘導(dǎo)表達(dá)時獲得最高的表達(dá)量。同時，該溫度誘導(dǎo)表達(dá)的單鏈抗體在ELISA檢測時也得到相對較高的值（圖2）。因此，F(xiàn)vSG7抗體的誘導(dǎo)表達(dá)溫度確定為25℃。

圖1 Western blot分析溫度對單鏈抗體表達(dá)量的影響

圖2 ELISA檢測溫度對單鏈抗體活性的影響

2.3 IPTG濃度對單鏈抗體表達(dá)的影響

在25℃培養(yǎng)條件下，分別加入不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8 h，滲透壓休克法提取細(xì)胞周質(zhì)蛋白，通過Western blot分析單鏈抗體的表達(dá)情況，圖3顯示IPTG在低于1.0 mmol/L時，濃度對單鏈抗體的表達(dá)量沒有太大的影響，更高的IPTG濃度反而得到較少的抗體表達(dá)量。同時，ELISA檢測結(jié)果也顯示IPTG濃度對周質(zhì)蛋白的活性影響不大，與其表達(dá)量的影響基本一致（圖4）。此外，在沒有IPTG的情況下，也有少量單鏈抗體在周質(zhì)蛋白中表達(dá)。通過對單鏈抗體的表達(dá)量和活性，以及實(shí)驗(yàn)操作和成本等方面的考慮，我們認(rèn)為約0.1 mmol/L的IPTG濃度用于單鏈抗體的表達(dá)比較合適。

圖3 Western blot分析IPTG濃度對單鏈抗體表達(dá)量的影響

圖4 ELISA檢測IPTG濃度對單鏈抗體活性的影響

2.4 誘導(dǎo)時間對單鏈抗體表達(dá)的影響

在25℃和0.1 mmol/L IPTG條件下，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)0、2、4、6、8、10和12 h，測定菌液濃度，并且采用滲透壓休克法提取細(xì)胞周質(zhì)蛋白，通過Western blot分析單鏈抗體的表達(dá)情況，圖5顯示在誘導(dǎo)前已有少量抗體表達(dá)，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h即可得到最大抗體量。在誘導(dǎo)表達(dá)2-12 h內(nèi)，周質(zhì)蛋白中的單鏈抗體積累量逐漸減少，與菌液濃度（圖6）呈正相關(guān)。通過ELISA檢測周質(zhì)蛋白中單鏈抗體的活性，結(jié)果（圖7）表明其活性在誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h時達(dá)到最大值，與菌液濃度和單鏈抗體的積累量相一致。

圖5 Western blot分析誘導(dǎo)時間對單鏈抗體表達(dá)量的影響

圖6 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)時間對菌液濃度的影響

2.5 單鏈抗體超量表達(dá)、純化及檢測

通過對FvSG7抗體表達(dá)條件的優(yōu)化，確定在2× TY培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，25℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h即可從重組大腸桿菌周質(zhì)中獲得大量的可溶性抗體。在該條件下表達(dá)提取的周質(zhì)蛋白經(jīng)Ni-NTA柱純化后，其產(chǎn)量可達(dá)到13 mg/L。在加入200 nmol/L純化的抗體進(jìn)行ELISA檢測時，顯色反應(yīng)30 min后的OD405nm值達(dá)到2.268，表明FvSG7抗體純化后仍保持很高的親和力。

圖7 ELISA檢測不同誘導(dǎo)時間對單鏈抗體活性的影響

3 討論

原核表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)周期短和簡單經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，單鏈抗體最初構(gòu)建時即是在E. coli中表達(dá)［15，16］。原核生物E. coli也是目前發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)［13］。單鏈抗體在E. coli中的表達(dá)主要有3種形式，即直接在細(xì)胞質(zhì)中以包涵體形式表達(dá)、與菌體蛋白融合表達(dá)或分泌表達(dá)［14］。包涵體通過變復(fù)性獲得具有生物活性的蛋白仍然是本領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)之一，Skerra和Plückthun［17］最早發(fā)展的細(xì)胞周質(zhì)分泌表達(dá)體系已成為各種單鏈抗體最常用的表達(dá)途徑［13］，但其突出的缺點(diǎn)是相對表達(dá)量較低［14］。單鏈抗體在E. coli中誘導(dǎo)表達(dá)的影響因素很多，包括氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)等抗體的固有特性以及一些外在因素或宿主理化環(huán)境，如培養(yǎng)溫度、抗體表達(dá)加工環(huán)境和過程、抗體對細(xì)胞的毒性及分子伴侶等輔助分子的存在情況等［14，18，19］。目前，各種抗原的特異單鏈抗體可以通過直接從雜交瘤細(xì)胞中克隆或噬菌體等展示技術(shù)篩選獲得，可溶性高效表達(dá)則是獲得單鏈抗體后需要研究的又一重點(diǎn)和難點(diǎn)［13］，大量研究試圖通過改造宿主菌、構(gòu)建融合蛋白、突變抗體基因或優(yōu)化表達(dá)條件等手段來改善抗體的表達(dá)量、穩(wěn)定性或活性［14，20，21］。本研究在優(yōu)化FvSG7抗體的原核表達(dá)條件時，無論是菌液濃度和周質(zhì)蛋白中的單鏈抗體積累量，還是周質(zhì)蛋白中的抗體活性，都沒有隨著誘導(dǎo)時間的延長而得到更多的積累和提高，分析其原因可能是表達(dá)的FvSG7抗體對菌體具有一定的細(xì)胞毒性，而菌體量的減少使得周質(zhì)蛋白中單鏈抗體總量相應(yīng)減少?？傊?，本研究通過對單鏈抗體表達(dá)條件的優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)抗鐮刀菌單鏈抗體在大腸桿菌中的可溶性高效表達(dá)，純化后的單鏈抗體仍具有很高的活性，為FvSG7抗體的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時為大腸桿菌生產(chǎn)小分子重組抗體提供了有價值的參考。

4 結(jié)論

相對于LB培養(yǎng)基，重組大腸桿菌在2× TY培養(yǎng)基中表達(dá)FvSG7抗體的效率更高。通過比較不同誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)時間對可溶性抗體表達(dá)的影響，確定FvSG7抗體的優(yōu)化表達(dá)條件為：重組大腸桿菌培養(yǎng)至OD600nm為0.5時，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，25℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h。FvSG7抗體在該條件下大量表達(dá)純化后，產(chǎn)量可達(dá)到13 mg/L，并保持很高的親和力。

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（責(zé)任編輯 李楠）

A Study on the Optim ization of Condition for Soluble Expression of Fusarium-specific scFv Antibody in Escherichia coli

Hu Zuquan1，2，3Li Heping2，4Wu Ping2，4Liao Yucai2，3Zhang Jingbo2，3
（1. College of Biology and Engineering，Guizhou Medical University，Guiyang550004；2. Molecular Biotechnology Laboratory of Triticeae Crops，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070；3. College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070；4. College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070）

The objectives of the work is to optimize the conditions for inducing expression， and obtain the soluble and high-yield expression of a Fusarium-specific single-chain variable fragment（scFv）antibody in the periplasmic space of Escherichia coli XL1-Blue. The recombinant plasmid containing a Fusarium-specific scFv antibody FvSG7 was transferred into E. coli XL1-Blue. After the culture medium for inducing selected， the soluble expression level and activity of FvSG7 antibody were analyzed by Western blot and ELISA detection for studying the influence of temperature， IPTG concentration and induction time on expression level. The maximum productivity of soluble FvSG7 antibody was obtained after induction at 25℃ for 2 h， with a final concentration of 0.1 mmol/L β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）and the cultured bacteria growing to the OD600value of 0.5. In conclusion， the soluble expression of FvSG7 antibody in the periplasm of E. coli XL1-Blue increased significantly by optimizing the expression’s conditions of induction temperature， IPTG concentration and induction time.

single-chain variable fragment antibody；soluble expression；Escherichia coli；optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.034

2015-03-02

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB127801），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201475）

胡祖權(quán)，男，博士，研究方向：抗體基因工程；E-mail：huzuquan@gmc.edu.cn

張靜柏，女，博士，研究方向：抗體基因工程；E-mail：jingbozhang@mail.hzau.edu.cn