傳統(tǒng)食醋釀造中微生物的研究進(jìn)展

程荷芳

上海太太樂食品有限公司（上海 201800）

食醋為我國(guó)傳統(tǒng)的酸性調(diào)味品和保存劑，與人們的日常生活息息相關(guān)。傳統(tǒng)的釀造技術(shù)多采用固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵工藝，在開放或半開放式的環(huán)境下，通過微生物群落的盛衰交替和協(xié)同作用釀制食品的過程[1-3]。國(guó)內(nèi)食醋主要以谷物醋為主，采用谷物為原料，以加入大曲的方式引入多種微生物和酶，通過復(fù)雜的糖化、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵等過程而制得[4-5]。霉菌、酵母和醋酸菌屬是食醋生產(chǎn)過程中的主要微生物。

食醋除作為酸性調(diào)味品和保存劑，還有其他生理作用。已開展研究的食醋功能主要有殺菌抗菌、促進(jìn)食欲、緩解疲勞、降低血糖、降血壓、減肥、美容美顏、抗癌防癌等[6]。Beh等[7]研究表明，醋酸菌產(chǎn)生以醋酸為主的有機(jī)酸，對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠具有良好的抗肥胖和抗炎活性。

食醋釀造是一個(gè)復(fù)雜的生化和微生物作用的過程，在微生物學(xué)研究領(lǐng)域，99%以上的微生物都未（難）被純培養(yǎng)的，這對(duì)于具有高度物種多樣性的傳統(tǒng)釀造食品食醋而言，進(jìn)一步了解其微生物群落結(jié)構(gòu)和功能具有更大挑戰(zhàn)[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)釀造食品微生物群落結(jié)構(gòu)的研究不僅僅局限于傳統(tǒng)的可分離培養(yǎng)微生物研究[9]。高通量測(cè)序技術(shù)的更新、測(cè)序成本的降低及測(cè)序通量的擴(kuò)展等優(yōu)勢(shì)不斷加強(qiáng)，為直接分析群落中全部微生物的種群組成、分布及其動(dòng)態(tài)演替提供了有利的技術(shù)支撐[10-12]。宏基因組測(cè)序技術(shù)不僅提供更為豐富的微生物物種的基因信息，而且還能有效提高檢測(cè)效率和結(jié)果準(zhǔn)確性，為研究者更全面地解析微生物群落結(jié)構(gòu)、變化規(guī)律并挖掘潛在的功能基因提供契機(jī)，從而得以進(jìn)一步開展對(duì)傳統(tǒng)釀造食品的深入探索[13]。

通過綜述利用高通量測(cè)序及宏基因組測(cè)序技術(shù)等前沿技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)食醋釀造中的微生物進(jìn)行檢測(cè)研究，并分析討論其面臨的主要問題和發(fā)展趨勢(shì)，為傳統(tǒng)釀造食醋的科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1 大曲中主要微生物研究

大曲是以大麥、小麥或豌豆混合物為原料，經(jīng)粗粉碎，加入一定量的水后壓制成磚狀曲坯，人工控制在一定的溫度、濕度條件下經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)而成的粗酶制劑[14]，食醋大曲的生產(chǎn)環(huán)境相對(duì)開放，其環(huán)境、原料及器具中的微生物均可能溶入大曲體系中，使其集聚了食醋釀造所老古板大部分微生物。為傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵如食醋、白酒釀造等過程提供了重要的菌系、酶系和物系。大曲中微生物群落多樣，由多種細(xì)菌、酵母菌和霉菌等組成。霉菌中最重要的是曲霉菌和根霉菌[15]。

Zheng等[16]利用傳統(tǒng)可培養(yǎng)手段從汾型大曲中分離鑒定190株菌株，其包含109種細(xì)菌及81種酵母和霉菌。Wang等[17]通過PCR-DGGE方法在中國(guó)白酒釀造使用的大曲中檢測(cè)到米黑根毛霉、布氏犁頭霉、米曲霉、土曲霉等霉菌。PCR-DGGE即polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis的縮寫，是一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)，它無需純培養(yǎng)，能鑒定出豐度較高或參考數(shù)據(jù)庫中可供參考的基因信息，從而可更全面地了解不同發(fā)酵階段的微生物群落組成[18]。蘭玉倩等[19]通過PCR-DGGE指紋技術(shù)，分析清香型大曲在制作過程中真菌類的群落演替規(guī)律，共檢測(cè)到畢赤酵母屬（Pichia kudriavzevii）、東方伊薩欽基氏菌（Issatchenkla orientalis）、球囊菌門（Glomeromycota）、酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌屬（Saccharomycopsis fibuligera）、地霉（Geotrichum）和根霉屬（Rhizopus oryzae）7個(gè)真菌分類屬微生物。Li等[20]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大曲中細(xì)菌和真菌微生物種類及豐度進(jìn)行分析，每克大曲樣品OTU（operational taxonomic unit）（97%）在600以上，對(duì)微生物多樣性的分析非常有效。李申奧[21]以兼香型白云邊酒高溫大曲不同發(fā)酵階段9個(gè)樣品為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵過程中大曲的微生物群落進(jìn)行分析，細(xì)菌群落16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序分析結(jié)果表明，樣品OTUs數(shù)量在進(jìn)入培菌期后先劇烈下降，后快速上升，又再次下降與回升，進(jìn)入儲(chǔ)藏期后持續(xù)下降；所有樣品中共獲得117個(gè)OTUs分類，優(yōu)勢(shì)菌屬是糖多孢菌（Saccharopolyspora）、嗜熱放線菌（Thermoactinomyces）、未分類的嗜熱放線菌（Unclassified Thermoactinomycetaceae）和乳酸桿菌（Lactobacillus）；真菌群落ITS擴(kuò)增子測(cè)序分析結(jié)果表明，樣品OTUs數(shù)量在整個(gè)發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先下降后回升再下降再回升的變化走勢(shì)；所有樣品共獲得82個(gè)OTUs分類，優(yōu)勢(shì)菌屬是嗜熱菌（Thermomyces），曲霉菌（Aspergillus）和念珠菌（Candida）；相鄰時(shí)間樣品的細(xì)菌和真菌群落組成相似。

Nie等[22]通過高通量PCR-DGGE測(cè)序技術(shù)，研究山西老陳醋大曲中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和真菌菌群結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)山西老陳醋大曲中的主要細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)主要包括糖多孢菌（Saccharopolyspora）、葡萄球菌（Staphylacocca）、芽孢桿菌（Bacillus）、鏈霉菌屬（Straphonyces）、魏斯氏菌屬（Weisseria）、乳酸菌屬（Lactobacilus）、泛菌屬（Pantoea）、醋酸菌屬（Acetobacter）、單胞菌屬（Monomonas）、高溫放線菌屬（Thermoactinomycetes）、糖單胞菌屬（Saccharomonas）、假單胞菌（Pseudomonas）、短小桿菌屬（Brevibacterium）、短桿菌屬（Brevibacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）等。真菌菌群結(jié)果有復(fù)膜孢酵母屬（Polycystis）、曲霉菌屬（Aspergillus）、畢赤酵母屬（Pichia）、紅曲霉（Monascus）等。

大曲中的微生物群落通過PCR-DGGE指紋、高通量測(cè)序及16S rDNA測(cè)序等技術(shù)，更好更全面地分析大曲中的微生物群落組成和分布情況，但各微生物在大曲中的主要作用、如何作用，對(duì)食醋的風(fēng)味貢獻(xiàn)是正向還是負(fù)向的，仍有待進(jìn)一步探索和研究。

2 醋酸發(fā)酵過程中的微生物研究

中國(guó)的四大名醋，即山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川麩醋及福建永春老醋風(fēng)味各有特色，除其工藝差異，另一個(gè)核心就是與醋酸發(fā)酵過程中的微生物有很大關(guān)系。下面重點(diǎn)綜述醋酸發(fā)酵過程中的微生物研究現(xiàn)狀。

劉廷銳[23]利用二代基因測(cè)序技術(shù)探究四川麩醋醋酸發(fā)酵過程中細(xì)菌菌落的多樣性。分析表明在整個(gè)醋酸發(fā)酵過程中，通過Shannon和ace指數(shù)的變化表明發(fā)酵初期細(xì)菌種類最為豐富，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，豐富度和多樣性開始降低，在末期又處較高位置。乳桿菌屬和醋桿菌屬在發(fā)酵過程中呈優(yōu)勢(shì)菌屬。此外還有一些豐度較低但伴隨整個(gè)發(fā)酵過程的如葡萄糖桿菌屬，假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等。

陶京蘭等[24]利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-FQPCR技術(shù)監(jiān)測(cè)鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中微生物的變化情況，并證實(shí)醋醅中的微生物主要為醋酸菌、乳酸菌和酵母菌屬，三者在細(xì)菌和真菌總和占比中超過80%。RT-FQPCR技術(shù)是一種通過監(jiān)測(cè)PCR過程中所加入熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)未知樣品進(jìn)行定量分析的一種核酸定量技術(shù)[25]。通過RT-FQPCR技術(shù)監(jiān)測(cè)鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程，對(duì)醋酸發(fā)酵階段醋醅中的總細(xì)菌數(shù)、總真菌數(shù)、醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行定量分析，這對(duì)于食醋發(fā)酵過程中的控制及提高產(chǎn)品的風(fēng)味具有重要的生產(chǎn)意義。

牟俊[26]利用高通量測(cè)序方法重點(diǎn)分析山西老陳醋發(fā)酵階段乳酸菌和醋酸菌的組成和演替規(guī)律，結(jié)果顯示醋酸發(fā)酵過程中，乳酸菌的豐度逐漸降低，而醋酸菌的豐度逐漸增加，共檢測(cè)到5種乳桿菌，占乳酸菌豐度的98%，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）占乳桿菌豐度的55%，是最主要的乳酸菌。共檢測(cè)到12種醋桿菌，占醋酸菌豐度的95%，其中巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）占醋桿菌豐度的70%，是最主要的醋酸菌。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)其相互作用機(jī)制進(jìn)行初步解析，為深入了解山西老陳醋發(fā)酵過程中的釀造機(jī)理提供理論。

王俊奇等[27]利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，分別以16S rRNA和18S rRNA基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)醋酸發(fā)酵過程中、1個(gè)月成品、1年陳釀和10年陳釀4個(gè)主要品質(zhì)的永春老醋中細(xì)菌與真菌群落多樣性動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，醋酸發(fā)酵過程中1個(gè)月成品、1年陳釀中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌皆為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和芽孢桿菌綱（Bacilli），屬水平以醋酸桿菌屬（Acetobacter＞60%）和乳桿菌屬（Lactobacillus＞20%）為優(yōu)勢(shì)菌，10年陳釀產(chǎn)品中未檢測(cè)到16S rRNA基因；真菌類群方面，四者皆以酵母綱（Saccharomycetes）和散囊菌綱（Eurotio-mycetes）為優(yōu)勢(shì)真菌綱。

聶志強(qiáng)等[28]應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)天津獨(dú)流老醋醋酸發(fā)酵過程中的群落變化研究中發(fā)現(xiàn)，在醋酸發(fā)酵過程中，醋醅中相對(duì)豐度較低的細(xì)菌（相對(duì)豐度0.01%以上）也發(fā)生著較大的變化。其中，類諾卡氏菌屬（Nocardioides）的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)，在末期相對(duì)豐度達(dá)到0.06%，說明其具有較強(qiáng)的醋酸耐受性。假單胞菌屬（Pseudomonas）隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，其相對(duì)豐度從0.14%下降到0.04%后逐漸消失，醋酸對(duì)假單胞菌屬的影響較大。另外，埃希菌屬在發(fā)酵前期到中期呈增加趨勢(shì)，克雷伯菌屬僅出現(xiàn)在發(fā)酵末期。整個(gè)發(fā)酵周期中，相對(duì)豐度＞0.01%的細(xì)菌達(dá)10種，食醋固態(tài)釀造過程中來源于樣品和環(huán)境中的多種微生物能自發(fā)地繁殖、富集，也是傳統(tǒng)食醋風(fēng)味豐富的主要原因。

Wu等[29]采用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)香醋的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能微生物進(jìn)行研究，進(jìn)而了解與食醋風(fēng)味相關(guān)的微生物菌群。結(jié)果顯示，食醋中細(xì)菌、真核生物和古細(xì)菌的相對(duì)豐度分別為91.75%，0.19%和8.06%。此外，共有來自951屬細(xì)菌的蛋白編碼基因被鑒定出來，其中42.3%與代謝通路相關(guān)、28.3%與遺傳信息相關(guān)、10.1%與環(huán)境信息相關(guān)。食醋的風(fēng)味研究結(jié)果表明，乙偶姻是在醋酸發(fā)酵過程中提高香醋風(fēng)味的重要物質(zhì)，其合成受多種代謝途徑的調(diào)控[30]。

Lu等[31]通過宏基因組測(cè)序技術(shù)，在物種水平上揭示乙偶姻代謝途徑中微生物分布的差異性。乙偶姻代謝途徑主要是在乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶共同調(diào)控下完成。乙酰乳酸合酶主要由布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri，21.0%）和巴氏桿菌（A.pasteurianus，29.3%）產(chǎn)生；而布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri，26.5%）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri，11.6%）、巴氏桿菌（A.pasteurianus，5.6%）、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum，3.2%）和短乳桿菌（L.brevis，2.8%）參與乙酰乳酸脫羧酶的合成代謝。雙乙酰是合成乙偶姻主要的前體物質(zhì)，巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）和4種乳酸菌，包括布氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌是醋酸發(fā)酵過程中促使雙乙酰向乙偶姻轉(zhuǎn)化的功能微生物菌種。

Nei等[32]應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)在傳統(tǒng)食醋中首次發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐度低于0.1%的念珠藻屬（Nostoc），類諾卡菌屬（Nocardioides），丙酸菌屬（Propionibacterium），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和片球菌屬（Pediococcus）。此前通過人工培養(yǎng)方式，僅能分離鑒定出食醋在發(fā)酵過程中的醋酸菌（主要包括醋桿菌屬、葡萄糖桿菌屬和葡萄糖醋酸桿菌屬）、乳酸菌（主要包括乳桿菌屬和乳球菌屬）和芽孢桿菌屬[33]，宏基因組測(cè)序技術(shù)大幅提高微生物菌種的覆蓋率。

3 結(jié)語與展望

通過PCR-DGGE指紋、高通量測(cè)序及16S rDNA等測(cè)序，不同的大曲檢測(cè)出的微生物群落分布有差異，大曲中的微生物群落發(fā)現(xiàn)大曲中有100余種細(xì)菌及80余種真菌；其中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)主要包括糖多孢菌、葡萄球菌（Staphylacocca）、芽孢桿菌、鏈霉菌屬（Straphonyces）、魏斯菌屬、乳酸菌屬（Lactobacilus）、泛菌屬（Pantoea）、醋酸菌屬（Acetobacter）、單胞菌屬（Monomonas）、高溫放線菌屬（Thermoactinomycetes）、糖單胞菌屬（Saccharomonas）、假單胞菌、短小桿菌屬、短桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、鞘氨醇單胞菌等；真菌菌群主要有復(fù)膜孢酵母屬、曲霉菌屬、畢赤酵母屬、紅曲霉、黑根毛霉、布氏犁頭霉、米曲霉、土曲霉等霉菌。

利用二代基因測(cè)序、RT-FQPCR技術(shù)、高通量測(cè)序等技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵過程的微生物菌屬主要優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸菌屬、醋酸菌屬及酵母菌屬和芽孢桿菌屬，醋酸菌屬主要包括醋桿菌屬、葡萄糖桿菌屬和葡萄糖醋酸桿菌屬，乳酸菌屬主要包括乳桿菌屬和乳球菌屬。通過宏基因組測(cè)序技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵過程的乙偶姻代謝途徑主要是在乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶共同調(diào)控下完成。而這2種酶是由以下幾種微生物生成布氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌[34]。

傳統(tǒng)食品食醋種類繁多，風(fēng)味各異，大部分仍沿用傳統(tǒng)的微生物生產(chǎn)工藝，其質(zhì)量的穩(wěn)定性與微生物的多樣性密切相關(guān)。利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)微生物菌群的研究可為食醋的發(fā)酵機(jī)理和代謝過程做出重要解析。隨著高通量測(cè)序技術(shù)、PCR-DGGE等生物技術(shù)與生物數(shù)據(jù)庫、智能信息化技術(shù)的深度結(jié)合，最終將實(shí)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品食醋發(fā)酵機(jī)制的全方位解析，從而推動(dòng)傳統(tǒng)發(fā)酵過程的現(xiàn)代化與智能化升級(jí)。