液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鳙魚(yú)中硝基呋喃代謝物含量的方法研究

文 史君 呂永恒 孟桂芳 秦臻 鄒城市檢驗(yàn)檢測(cè)中心

在陰性鳙魚(yú)中加入鹽酸溶液和2-硝基苯甲醛后，以現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中37℃衍生16h為對(duì)照，優(yōu)化衍生溫度和衍生時(shí)間，45℃衍生4h。而后乙酸乙酯液-液萃取濃縮，初始流動(dòng)相復(fù)溶，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。通過(guò)驗(yàn)證，（45℃；4h）的衍生條件，在校準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度的表現(xiàn)上和標(biāo)準(zhǔn)方法接近，說(shuō)明該衍生條件不但能夠滿足鳙魚(yú)中硝基呋喃類代謝物的測(cè)定，還縮短了前處理時(shí)長(zhǎng)，大大提高了檢測(cè)效率。

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲(chóng)等病原體均有殺滅作用，曾廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對(duì)人體有致癌、致畸胎的副作用，2019年12月27日，硝基呋喃被列入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號(hào)）。

硝基呋喃類藥物在脊椎動(dòng)物體內(nèi)會(huì)迅速分解，生成相應(yīng)的代謝物，而代謝物容易和動(dòng)物組織中蛋白質(zhì)結(jié)合并長(zhǎng)期殘留，故常利用代謝物的檢測(cè)來(lái)反應(yīng)硝基呋喃類藥物的殘留狀況。

目前，國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法來(lái)測(cè)定硝基呋喃代謝物是主流方法。本文通過(guò)優(yōu)化衍生溫度與衍生時(shí)間，縮短了整個(gè)衍生過(guò)程，建立了鳙魚(yú)中硝基呋喃代謝物測(cè)定的快速前處理方法。通過(guò)3個(gè)高中低水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)驗(yàn)證該前處理方法的精密度與準(zhǔn)確度。

1. 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（SCIEX 4500）；電子分析天平（Mettler Toledo MS204S)；pH計(jì)（Mettler Toledo FiveEasy Plus）；水浴恒溫振蕩器（常州潤(rùn)華電器有限公司SHABA）；高速離心機(jī)（cence H1850）；渦旋振蕩器（IKA MS3 digital）。

1.2 材料與試劑

AOZ標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，100μg/mL)；AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，100μg/mL）；AHD標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，100μg/mL）；SEM標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，100μg/mL）；AOZ-D標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心，100μg/mL）；AMOZ-D標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心，100μg/mL)；AHD-C標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心，100μg/mL)；SEM·HCl-CN標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心，100μg/mL)；2-硝基苯甲醛（色譜純）；二甲亞砜（色譜純）；乙酸乙酯（色譜純）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；無(wú)水磷酸氫二鉀（優(yōu)級(jí)純）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取AOZ、AMOZ、AHD、SEM標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成100μg/L和10μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別準(zhǔn)確吸取AOZ-D、AMOZ-D、AHD-C、SEM·HCl-CN標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成100μg/L的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 測(cè)定步驟

取試樣2.00g于50mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入50μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/L）、5mL鹽酸（0.5mol/L）、150μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），渦旋混合1min。在水浴恒溫振蕩器中，將衍生時(shí)間和衍生溫度分別設(shè)置為（37℃；16h）和（45℃；4h）。取出離心管冷卻至室溫，用磷酸氫二鉀溶液（1.0mol/L）調(diào)pH至7.0-7.5，加入8mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30s，6000r/min離心5min，取上清液至10mL玻璃離心管中，40℃氮?dú)獯蹈?。用初始流?dòng)相復(fù)溶后，過(guò)膜上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別準(zhǔn)確移取10μg/L和100μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各0.05mL、0.1mL、0.2mL于6個(gè)50mL離心管中，除不加樣品外，按照1.3.2測(cè)定步驟進(jìn)行處理，最終濃度為0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L。按1.3.4上機(jī)測(cè)定，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定2次。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱C（150mm×3.0mm，粒徑5μm）；流動(dòng)相洗脫條件見(jiàn)表1。質(zhì)譜條件：ESI+，具體參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

表2 四種硝基呋喃代謝物及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 線性范圍的驗(yàn)證

按照1.3.3步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的驗(yàn)證。對(duì)于準(zhǔn)確定量的方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99。

1.3.6 靈敏度的驗(yàn)證

在對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中，硝基呋喃類代謝物在水產(chǎn)品中的檢測(cè)限為0.5μg/kg，定量限為1.0μg/kg。分別在檢測(cè)限及定量限水平上進(jìn)行加標(biāo)，重復(fù)測(cè)定10次，驗(yàn)證信噪比是否符合要求（檢測(cè)限S/N≥3；定量限S/N≥10）。

1.3.7 準(zhǔn)確度的驗(yàn)證

根據(jù)《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)》規(guī)定，硝基呋喃類代謝物為禁用藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出。因此，在檢測(cè)限、2倍檢測(cè)限和10倍檢測(cè)限進(jìn)行驗(yàn)證，即0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg三個(gè)濃度水平上進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照1.3.2進(jìn)行前處理，1.3.4進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定10次?；厥章蕬?yīng)在60%-120%之間。

1.3.8 精密度的驗(yàn)證

根據(jù)《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)》規(guī)定，硝基呋喃類代謝物為禁用藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出。在對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中，硝基呋喃類代謝物在水產(chǎn)品中的檢測(cè)限為0.5μg/kg，定量限為1.0μg/kg。因此，在檢測(cè)限、2倍檢測(cè)限和10倍檢測(cè)限進(jìn)行驗(yàn)證，即0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg三個(gè)濃度水平上進(jìn)行試驗(yàn)，按照1.3.2進(jìn)行前處理，1.3.4進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算RSD。RSD應(yīng)小于15%。

2. 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

以目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度目標(biāo)物峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，得到各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)（見(jiàn)表3）。

表3 AOZ、AMOZ、AHD、SEM 的線性方程及相關(guān)系數(shù)表

由表3可以看出，四種硝基呋喃代謝物的線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99，相關(guān)性良好，可用于準(zhǔn)確定量。

2.2 靈敏度

在檢測(cè)限和定量限水平上加標(biāo)，重復(fù)10次。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)限水平上的加標(biāo)測(cè)定，S/N＞3；定量限水平上的加標(biāo)測(cè)定，S/N＞10。由此可見(jiàn)，本產(chǎn)品的檢測(cè)限和定量限均滿足實(shí)驗(yàn)室要求。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

在檢測(cè)限、2倍檢測(cè)限和10倍檢測(cè)限進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定10次，結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 AOZ、AMOZ、AHD、SEM 的精密度及添加回收率

由表4可以看出，四種化合物的添加回收率在60%-120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜30%，滿足要求。

3. 結(jié)果與分析

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，鳙魚(yú)中硝基呋喃代謝物測(cè)定的衍生時(shí)間為16h，造成整個(gè)前處理時(shí)長(zhǎng)較長(zhǎng)。本文通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，（45℃；4h）的衍生條件，不但在校準(zhǔn)曲線、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度方面表現(xiàn)良好，能夠滿足鳙魚(yú)中硝基呋喃代謝物測(cè)定要求的同時(shí)，還大大縮短了前處理時(shí)長(zhǎng)，提高了檢測(cè)效率，讓硝基呋喃代謝物的檢測(cè)在一天內(nèi)完成已成為可能。