高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定深圳梧桐山野生蘑菇中5種鵝膏肽類毒素的含量

葉小莉,岳亞軍,賴璟琦,朱 波,賴少陽,葉 敏,莊輝元

(深圳市羅湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心,深圳 518020)

毒蘑菇也稱毒蕈、毒菌等,我國的毒蘑菇種類豐富,已記載的有400多種[1],由毒蘑菇引起的中毒事件頻頻發(fā)生。在我國,約90%蘑菇中毒死亡是由含鵝膏肽類毒素的鵝膏菌引起的[2-3]。致毒的鵝膏肽類毒素主要有鵝膏毒肽和鬼筆毒肽。目前已分離出9種鵝膏毒肽,均為雙環(huán)八肽結(jié)構(gòu),其中α-鵝膏毒肽(α-AMA)和β-鵝膏毒肽(β-AMA)在毒蘑菇中含量高、毒性大,是引起中毒的主要毒素,半數(shù)致死劑量分別為0.3,0.5 mg·kg-1[4-5]。鬼筆毒肽共有7種,均為雙環(huán)七肽結(jié)構(gòu),其中羧基二羥鬼筆毒肽(PCD)、羧基三羥鬼筆毒肽(PSC)和二羥鬼筆毒肽(PHD)為主要毒性成分,半數(shù)致死劑量分別為1.5,4.5,2.0 mg·kg-1[4-5]。鵝膏肽類毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,耐高溫、干燥和酸堿,易溶于甲醇、乙醇、液氨、吡啶和水,其毒性不能被常規(guī)烹飪方法破壞。

據(jù)文獻(xiàn)[6]統(tǒng)計(jì),2000-2019年間,華南地區(qū)共發(fā)生毒鵝膏中毒事件45起,其中深圳占8起。深圳梧桐山地處亞熱帶地區(qū),有豐富的生物資源,野生蘑菇種類眾多,近年來報(bào)道的因采摘野生蘑菇導(dǎo)致的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生。致命鵝膏往往生長于黧蒴樹下[3],而梧桐山上自然分布著兩大片黧蒴林。2020年3月,發(fā)生了一起與梧桐山相關(guān)的致命鵝膏中毒事件,根據(jù)患者的描述,本項(xiàng)目組成員前往事發(fā)地先后采集包括致命鵝膏在內(nèi)的共23種野生蘑菇,并帶回實(shí)驗(yàn)室分析。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的成熟與更新升級,近年來,鵝膏肽類毒素的檢測方法主要有高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法[7-8]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-17]。基于三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)的檢測方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、定性定量準(zhǔn)確以及普及率廣等優(yōu)點(diǎn)。本工作以高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定野生蘑菇中α-AMA、β-AMA、PCD、PSC、PHD等5種鵝膏肽類毒素的含量,同時(shí)應(yīng)用該方法對深圳梧桐山不同生長時(shí)期(生長期、成熟期和衰老期)致命鵝膏中的鵝膏肽類毒素含量進(jìn)行測定,可為發(fā)生蘑菇中毒后毒源鑒定、衛(wèi)生應(yīng)急處置和中毒后能夠準(zhǔn)確診斷患者中毒程度以及搶救病人贏得時(shí)間,為該地區(qū)蘑菇中毒防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1200SL-6410B型RRLC-QQQ 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;Turbovap II型定量濃縮儀;3-30KS型臺(tái)式冷凍離心機(jī);T25型組織勻漿機(jī);Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)。

PSC標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 g·L-1,由湖南師范大學(xué)陳作紅教授贈(zèng)送。

單標(biāo)準(zhǔn)溶液:100 mg·L-1,分別取α-AMA、β-AMA、PCD 和PHD 標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg,用乙腈超聲溶解15 min,并分別定容至10 mL 容量瓶中,搖勻后置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:2 mg·L-1,分別取α-AMA、β-AMA、PCD 和PHD 單標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL,PSC 標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL,用水定容至5 mL容量瓶中。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10,25,50,100,250μL,分別用水定容至1mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度分別為20.0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

α-AMA 標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于95%;β-AMA 標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于98%;PCD 和PHD 標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于90%;乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純;乙酸、氨水為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),柱溫40℃;流動(dòng)相A為5mmol·L-1乙酸銨溶液,B為乙腈;流量0.3 mL·min-1;進(jìn)樣體積20.0μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI+)模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;干燥氣溫度350 ℃;干燥氣流量11.0 L·min-1;霧化壓力262kPa;毛細(xì)管電壓4kV。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2,其中“*”為定量離子。

表2 5種鵝膏肽類毒素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters of the 5 Amanita toxoids

1.3 試驗(yàn)方法

稱取新鮮蘑菇1 g或干蘑菇0.2 g,置于50 mL離心管中,加10 mL 水,勻漿后超聲10 min。以10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,分取1 mL 上清液過0.22μm 水相濾膜,濾液上機(jī)測定。如果蘑菇中鵝膏肽類毒素含量較高,超出線性范圍,可減少稱樣量或者增大稀釋倍數(shù)后再上機(jī)測定;如果蘑菇中鵝膏肽類毒素含量較低,可先對上清液進(jìn)行凈化、濃縮后再測定,即依次用2 mL 甲醇、2 mL 水活化Oasis HLB固相萃取柱,分取上清液5 mL過柱,用5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液1 mL 淋洗,抽干柱子后再用2 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,于50 ℃氮吹至干,再用水溶解并稀釋至1 mL,渦旋混勻后,用0.22μm 水相濾膜過濾,濾液上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

鵝膏肽類毒素的提取溶劑種類繁多,如含1%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸的乙腈溶液、甲醇、體積比1∶1的含10%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的甲醇-水混合溶液、50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液、水。試驗(yàn)對比了這5種提取溶劑的提取效果。結(jié)果顯示:直接用含有機(jī)溶劑的提取溶劑提取蘑菇中低含量的毒素時(shí),回收率低于70.0%,需要氮吹至干、用水復(fù)溶、過HLB固相萃取柱富集后再上機(jī)測定,由于新鮮蘑菇含水量大或含水提取溶劑用量較多,氮吹至干步驟耗時(shí)較長,10 mL 提取液耗費(fèi)時(shí)間至少約30 min;水無毒且容易獲取,提取液直接過HLB 固相萃取柱即可得到較高的回收率(＞80.0%)。從節(jié)約試驗(yàn)成本及時(shí)間等角度考慮,試驗(yàn)選擇以水作提取溶劑。

2.2 流動(dòng)相的選擇

α-AMA 和β-AMA 的碳原子數(shù)均較多且母離子m/z很接近。當(dāng)α-AMA 中1 個(gè)碳被13C 取代后,其母離子的m/z920.4(由自然界中13C 天然豐度1.10%計(jì)算得α-AMA 中13C 的豐度為43%,并由此計(jì)算m/z)和β-AMA 母離子的m/z920.3基本一致,二者具有相同的定性定量離子對。為了解決以上問題,使α-AMA 和β-AMA 實(shí)現(xiàn)基線分離,試驗(yàn)比較了分別以0.03%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水-乙腈體系、5 mmol·L-1乙酸銨-含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的甲醇體系和5 mmol·L-1乙酸銨-乙腈體系作流動(dòng)相,以Agilent SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)作固定相時(shí)5種鵝膏肽類毒素的色譜分離效果。

結(jié)果顯示:以Agilent SB-C18色譜柱作固定相時(shí),各毒素分離效果不佳,PCD 色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象;以ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱作固定相時(shí),各毒素峰均能完全分開,且PCD 色譜峰無拖尾現(xiàn)象;以0.03%氨水-乙腈體系為流動(dòng)相時(shí),各毒素出峰較快,α-AMA、β-AMA 和PCD 色譜峰挨在一起,整體出峰效果不佳;以5 mmol·L-1乙酸銨-含0.1%甲酸的甲醇體系為流動(dòng)相時(shí),α-AMA 與β-AMA 色譜峰挨在一起,PCD、PHD 色譜峰出現(xiàn)重疊;以5 mmol·L-1乙酸銨-乙腈體系為流動(dòng)相時(shí),5種鵝膏肽類毒素的分離度均大于1.5,可實(shí)現(xiàn)完全分離,且峰形尖銳、對稱。因此,試驗(yàn)選擇ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱為固定相,5 mmol·L-1乙酸銨-乙腈體系為流動(dòng)相。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,500.0μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 5種鵝膏肽類毒素的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 5 Amanita toxoids

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以5種鵝膏肽類毒素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,各毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為20.0～500.0μg·L-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 線性參數(shù)Tab.3 Linearity parameters

分別以3 倍、10 倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),各毒素所得檢出限均為6 ng·g-1,測定下限均為20 ng·g-1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對空白樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表4。

由表4 可知,5 種鵝膏肽類毒素的回收率為78.3%～98.3%,測定值的RSD 為0.30%～11%。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析采集到的23種野生蘑菇,其中在1種當(dāng)?shù)厮追Q“白毒傘”的野生蘑菇中檢出了α-AMA、β-AMA、PCD 和PSC,該蘑菇經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所鑒定為致命鵝膏,而其他22種野生蘑菇中均未檢出5種毒素,這與其他相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果[11,16,18,19]一致。

參考文獻(xiàn)[18-20],將致命鵝膏子實(shí)體分為3個(gè)生長階段:菌柄伸長、菌蓋未打開、菌環(huán)與菌蓋邊緣相連的生長階段為生長期;菌蓋完全打開、菌環(huán)與菌蓋邊緣完全分離的生長階段為成熟期;子實(shí)體開始枯萎、菌蓋邊緣上翹或開裂的生長階段為衰老期。按照試驗(yàn)方法分析梧桐山不同生長階段的致命鵝膏子實(shí)體,所得檢測結(jié)果(均為濕重)見表5。

表5 致命鵝膏分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of Amanita exitialis mg·g-1

由表5 可知:毒素總量在成熟期最高(1.50 mg·g-1),衰老期次之(1.19 mg·g-1),生長期最低(1.05 mg·g-1),不同生長階段的毒素含量差異可能與降水量有關(guān);3個(gè)生長階段的子實(shí)體中β-AMA 含量均最高,成熟期、衰老期、生長期的檢出量分別為0.57,0.48,0.37 mg·g-1,α-AMA 含量次之,成熟期、衰老期、生長期的檢出量分別為0.39,0.31,0.28 mg·g-1,這與云南[16,18]和廣州[19]的致命鵝膏以α-AMA 含量最高不同,推測可能與不同采集地土質(zhì)和氣候差異有關(guān)。

本工作以用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定深圳梧桐山野生蘑菇中5種鵝膏肽類毒素的含量。該方法操作簡單、精密度高、準(zhǔn)確度好,可為蘑菇中毒采集地追溯以及區(qū)域食品安全教育提供依據(jù)。