鵝膏毒肽中毒動(dòng)物模型建立的研究進(jìn)展

張慧潔楊根夢王浩偉曾曉鋒李楨

（國家衛(wèi)健委毒品依賴和戒治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，昆明 650500）

我國毒蘑菇種類豐富，國內(nèi)中毒事件頻發(fā)，中國疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，在2010 ～2020 年期間共報(bào)告10036 起蘑菇中毒事件，導(dǎo)致788 人死亡［1］。 云南、湖南、四川等地發(fā)生率最高，多集中在5 ～10 月［1］。 灰花紋鵝膏、致命鵝膏、鱗柄白鵝膏及淡紅鵝膏等蘑菇為劇毒。 目前，分離出的毒素主要為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽及毒傘肽3 類，而鵝膏毒肽則是致人死亡的最主要有毒物質(zhì)［2］。

1 鵝膏毒肽

鵝膏菌（Amanita）屬于擔(dān)子菌門中的一種真菌，多由菌蓋、菌褶、菌柄、菌環(huán)及菌托5 部分組成，但存在形態(tài)差異［3］。 有毒鵝膏菌各部位所含鵝膏毒肽含量有所差別，菌蓋及菌褶處含量相對較高。 不同發(fā)育時(shí)期的鵝膏菌所含鵝膏毒肽含量也有不同，早期發(fā)育階段含量相對較高［4］。 鵝膏毒肽不僅存在于鵝膏菌屬部分蘑菇內(nèi)，也存在于盔孢菌屬、環(huán)柄菇屬及絲蓋傘屬等部分的蘑菇中［2］。 根據(jù)側(cè)鏈取代基不同，鵝膏毒肽可以分為α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、ε-鵝膏毒肽、鵝膏酸、鵝膏酰胺、鵝膏蕈、鵝膏蕈酸和普羅馬琳等［5］。 目前，研究多集中在α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽上。 鵝膏毒肽為雙環(huán)八肽，分子量約為900 Da，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫、耐酸堿等的特點(diǎn)使得在加熱烹飪后仍具毒性，僅0.1 mg／kg 劑量可致人死亡。 新鮮蘑菇組織中鵝膏毒肽含量較高時(shí)，食用少于50 g 足以導(dǎo)致中毒死亡［6］。 鵝膏毒肽是一類遲發(fā)性毒素，中毒后早期無明顯癥狀，待出現(xiàn)癥狀后已經(jīng)造成人體損傷，部分患者經(jīng)治療后癥狀會(huì)有所緩解，往往會(huì)被誤以為處于恢復(fù)期，然而隨著中毒時(shí)間的延長，患者則會(huì)出現(xiàn)肝功能衰竭，更甚者出現(xiàn)多器官衰竭［7－8］。 由于鵝膏毒肽特殊毒理特性，可以特異性抑制RNA 聚合酶Ⅱ，其被用于生物轉(zhuǎn)錄相關(guān)研究中。 此外，鵝膏毒肽在抗腫瘤、抗病毒領(lǐng)域也發(fā)揮重要作用［9］。

2 鵝膏毒肽中毒的評估

臨床上，經(jīng)過潛伏期后，患者會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛等胃腸炎癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)脫水，甚至休克。 隨著中毒時(shí)間的延長，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查可以發(fā)現(xiàn)， 血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、膽紅素等會(huì)升高。中毒晚期，患者可能出現(xiàn)多器官衰竭，甚至死亡［2，7－8］。 其他動(dòng)物的生理結(jié)構(gòu)與人類存在一定差異。 因此，在建立動(dòng)物模型時(shí)，需結(jié)合動(dòng)物本身的特點(diǎn)，對動(dòng)物進(jìn)行中毒評估。

2.1 一般觀察指標(biāo)

建立鵝膏毒肽動(dòng)物模型后，密切觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活情況。 由于鵝膏毒肽毒性特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，鵝膏毒肽中毒后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒早期可能會(huì)出現(xiàn)警惕性下降、嗜睡、活動(dòng)減少、攝食減少、體重下降等改變；中毒加深后可能會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、抽搐，甚至死亡［10］。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察標(biāo)準(zhǔn)，如觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)姿勢、整理毛發(fā)等外觀改變；體重、心率、呼吸、精神狀態(tài)等臨床指標(biāo)，依據(jù)觀察標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分［11］。 對于中毒治療模型，可記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟器系數(shù)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某器官的重量與其自身體重的比值可以反應(yīng)器官損害程度，也可作為藥物減輕鵝膏毒肽對器官損害的指標(biāo)［12］。

2.2 設(shè)備輔助觀察與檢測

取出的動(dòng)物器官進(jìn)行甲醛固定、脫水、切片、染色、封片、病理學(xué)觀察等，鏡下較為直觀地觀察組織細(xì)胞的改變，如肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤等改變。此外，有實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果也可反應(yīng)鵝膏毒肽對組織器官的損傷程度。 血液進(jìn)行血生化檢測，檢測肝功能，如ALT、AST、膽紅素等指標(biāo)。 還可通過檢測儀器，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS），檢測血液、尿液、膽汁、組織器官等中的鵝膏毒肽的濃度［13－14］，反應(yīng)鵝膏毒肽在體內(nèi)的代謝與分布情況。

3 建立鵝膏毒肽中毒的動(dòng)物模型

3.1 建立鵝膏毒肽中毒的毒理學(xué)模型

鵝膏毒肽進(jìn)入機(jī)體后，肝細(xì)胞膜上相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)受體可將其轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞內(nèi)。 鵝膏毒肽可特異性抑制真核細(xì)胞RNA 聚合酶Ⅱ，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成障礙。 此外，鵝膏毒肽還導(dǎo)致肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激，活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增多，氧化／抗氧化系統(tǒng)失衡引起肝組織損傷。 鵝膏毒肽通過線粒體途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡外，還可以通過TNF-α 途徑介導(dǎo)凋亡［2］。 鵝膏毒肽可誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬，但自噬與凋亡之間的相互作用關(guān)系，尚不明確［15－17］。

Lu 等［18］建立鵝膏毒肽中毒模型，選用Oatp1b2敲除成年雄性小鼠，腹腔注射1 mg／kg α-鵝膏毒肽，16 h 后在戊巴比妥麻醉下收集血樣及肝組織樣本。選用與實(shí)驗(yàn)組年齡相匹配的雄性C57BL／6 和129Sv小鼠作為野生型對照，驗(yàn)證Oatp1b2 受體轉(zhuǎn)運(yùn)α-鵝膏毒肽的功能。 Dündar 等［13］選用28 ～40 g 的雄性BALB／c 小鼠，分別腹腔注射0.2、0.6、1.0 mg／kg α-鵝膏毒肽，48 h 后取血安樂死小鼠。 通過檢測氧化應(yīng)激等指標(biāo)，說明氧化應(yīng)激在α-鵝膏毒肽誘導(dǎo)肝毒性中的重要作用。 而Chen 等［10］選用7 周18 ～22 g 雄性BALB／c 小鼠，采用0.23、0.28、0.35、0.43、0.53 mg／kg 等比劑量給小鼠腹腔注射α-鵝膏毒肽。 根據(jù)其濃度對小鼠的作用，再選擇0、0.23、0.35 mg／kg 的α-鵝膏毒肽腹腔注射小鼠，于4、8、12、24、48、72 h 各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眶后靜脈叢采血和取肝組織，用于肝功能檢測及對肝組織進(jìn)行病理檢查。 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)α-鵝膏毒肽通過氧化應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑造成肝損傷。 Zhao 等［19］同樣選用雄性BALB／c 小鼠進(jìn)行建模，但采用尾靜脈注射方式注射α-鵝膏毒肽。 將小鼠隨機(jī)分組成0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg／kg 劑量組，靜脈注射α-鵝膏毒肽后觀察小鼠存活，從而得出半數(shù)致死量（lethal dose 50%，LD50）0.327 mg／kg。 根據(jù)LD50再次尾靜脈注射α-鵝膏毒肽，并于0、24、36、48、60 h 各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行左、右眶靜脈采血并取內(nèi)臟器官。 通過計(jì)算臟器指數(shù)反應(yīng)器官的損傷程度。Wu 等［20］根據(jù)相關(guān)研究選擇0.33 mg／kg 及0.66 mg／kg 劑量，采用腹腔注射方式注射α-鵝膏毒肽，但選用2 月齡左右ICR 小鼠建立動(dòng)物模型，研究α-鵝膏毒肽中毒的量效關(guān)系。 綜上，毒理動(dòng)物模型多選用小鼠建立，注射方式多選擇腹腔注射，便于操作。 灌胃方式可較好模擬人食用有毒蘑菇，但操作具有一定難度。 α-鵝膏毒肽的劑量選擇上存在差異，因此，實(shí)驗(yàn)前需確定中毒量效關(guān)系，驗(yàn)證后選擇合適的實(shí)驗(yàn)劑量與時(shí)間。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、注射方式、毒物類型及劑量選擇匯總成下表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、注射方式、藥物及劑量匯總Table 1 Summary of experimental animals， injection methods， types of poison and doses

3.2 建立鵝膏毒肽中毒的毒代動(dòng)力學(xué)模型

鵝膏毒肽化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，經(jīng)消化道消化后仍可保持活性，吸收入血，經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝，隨之進(jìn)行血液循環(huán)。 鵝膏毒肽在血液中蛋白結(jié)合率極低，同時(shí)較快被清除，經(jīng)尿液排出體外［25］。 超過48 h 后不易從血液中檢測，而3 d 后仍可從尿液中檢測出鵝膏毒肽，在體內(nèi)不經(jīng)轉(zhuǎn)化以原形排出。 部分鵝膏毒肽隨膽汁排泄后經(jīng)腸道吸收再次入血，形成肝腸循環(huán)。 鵝膏毒肽不經(jīng)母乳排出，也不能通過胎盤屏障［2，26－27］。

Li 等［28］用大鼠建立動(dòng)物模型，選用6 ～8 周185 ～215 g SD 大鼠，腹腔注射0.5 mg／kg α-鵝膏毒肽。 通過眶靜脈采血的方式收集5、10、20、30、45、75、135、195 min 的血液至抗凝管內(nèi)，離心后檢測血清中α-鵝膏毒肽。 注射200 min 后，血清中檢測不出α-鵝膏毒肽。 Mao 等［29］選擇SD 大鼠建立動(dòng)物模型時(shí)，采用靜脈注射的方式注射亞急性毒性劑量0.1 mg／kg α-鵝膏毒肽。 并于0、3、8、15、30、45、60、90、120、240、360、480 min 收集血液至抗凝管。離心后檢測血清中α-鵝膏毒肽，結(jié)果顯示α-鵝膏毒肽在注射120 min 內(nèi)，從血液中被迅速清除。 SD 大鼠可以進(jìn)行多次采血，因此，實(shí)驗(yàn)中所需動(dòng)物數(shù)量較少，僅為3 ～6 只，這樣模型多用于建立檢測方法，并且用于α-鵝膏毒肽毒代動(dòng)力學(xué)研究。 Sun等［30］選用8 ～10 月齡9 ～11 kg 的雄性比格犬建立動(dòng)物模型。 提前處理致命鵝膏菌粉末并鑒定粉末中肽類毒素含量，喂食比格犬20 mg／kg 及60 mg／kg 粉末膠囊。 經(jīng)頭靜脈收集0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、24.0、36.0、48.0 h 血液。 收集每天尿液，連續(xù)5 d，分析血漿及尿液中各肽類毒素。 為了驗(yàn)證膽汁引流對致命鵝膏的毒性影響，Sun 等［14］給比格犬靜脈注射戊巴比妥鈉（3%，1 mL／kg），在麻醉后實(shí)施膽道引流手術(shù)。 術(shù)后第8 天，20 mg／kg 及60 mg／kg 組喂食致命鵝膏粉末膠囊，而對照組和膽汁引流組喂食空膠囊。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要收集血液、膽汁、尿液等樣本，并檢測樣本中α-鵝膏毒肽的濃度。 該模型選擇的藥物可以很好反應(yīng)鵝膏菌對于機(jī)體的毒性作用，由于粉末膠囊中含有多種鵝膏毒肽，不利于單一鵝膏毒肽的研究。 在研究多種鵝膏毒肽相互作用時(shí)可以考慮選擇這種藥物效應(yīng)方案。 Thiel 等［31］驗(yàn)證鵝膏毒肽肝腸循環(huán)時(shí)，選用雌性德國長白豬建立動(dòng)物模型，經(jīng)門靜脈注射0.15 mg／kg 及0.35 mg／kg α-鵝膏毒肽。 所有實(shí)驗(yàn)豬在麻醉下觀察3 d，并收集實(shí)驗(yàn)所需血液、膽汁及尿液等樣本。 該動(dòng)物模型使用較長時(shí)間的麻醉劑維持麻醉，值得注意的是麻醉劑可能會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響［32］。 選用體格較大的動(dòng)物進(jìn)行建模，需消耗大量的藥物。 其次，實(shí)驗(yàn)實(shí)施難度較大，對于實(shí)驗(yàn)設(shè)備及環(huán)境要求高。Bang 等［33］研究β-鵝膏毒肽毒代動(dòng)力學(xué)選用雄性8周齡ICR 小鼠，體重25.1 ～29.7 g，采用尾靜脈注射和灌胃2 種方式使不同濃度的β-鵝膏毒肽作用于小鼠體內(nèi)。 研究發(fā)現(xiàn)，灌胃組相較于尾靜脈注射組，其血漿中β-鵝膏毒肽半衰期較長。 此外，48 h內(nèi)，尾靜脈注射組尿液清除率高于糞便清除率，而灌胃組與之相反。 研究還發(fā)現(xiàn)，2 種不同注入方式會(huì)對β-鵝膏毒肽組織分布造成影響，灌胃組腸、胃組織的分布較高，靜脈注射組腸、胃的分布則較低，但兩組中腎組織均存在較高分布。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容不同將Bang 等［33］實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)匯總成表2。

表2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、注射方式、劑量、樣本等匯總Table 2 Summary of experimental content， injection methods， doses， samples et al

3.3 建立鵝膏毒肽中毒的藥物治療模型

目前，臨床仍無有效藥物可以完全治愈鵝膏毒肽中毒，但早期及時(shí)清除消化道及血液中的鵝膏毒肽具有一定意義。 鵝膏毒肽中毒后早期無明顯的癥狀，易造成診斷治療的延誤。 除了維持體液平衡及糾正凝血障礙等支持治療，及時(shí)使用藥物進(jìn)行干預(yù)可以降低鵝膏毒肽中毒的病死率。 水飛薊提取物水飛薊賓（silibinin，SIL）、青霉素G 等藥物可以阻止鵝膏毒肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。 N-乙酰半胱氨酸（ N-acetylcysteine，NAC）具有抗氧化的作用，可以降低鵝膏毒肽誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激造成的損傷［2，7－8，34－35］。

Garcia 等［36］構(gòu)建鵝膏毒肽中毒治療模型，選用20 ～30 g 雄性CD-1 小鼠，腹腔注射0.45 mg／kg 的α-鵝膏毒肽，在注射α-鵝膏毒肽之后，每4 h 注射1 次生理鹽水，直至12 h，建立中毒模型組。 選用環(huán)孢霉素A（cyclosporine A，CsA）作為治療藥物。 在注射0.45 mg／kg 劑量的α-鵝膏毒肽后，再腹腔注射10 mg／kg 劑量的環(huán)孢菌素A，每4 h 注射1 次，直至12 h，構(gòu)建中毒治療模型。 此外，Garcia 等［11］選擇多粘菌素B（polymyxin B，poly B）聯(lián)合甲基強(qiáng)的松（methylprednisolone，MP）治療鵝膏毒肽中毒。 腹腔注射α-鵝膏毒肽的劑量則是0.33 mg／kg，藥物干預(yù)時(shí)間保持一致，仍為4 h，但甲基強(qiáng)的松龍干預(yù)的次數(shù)僅為1 次。 注射鵝膏毒肽4 h 后，腹腔注射10 mg／kg甲基強(qiáng)的松龍，之后每隔4 h 注射生理鹽水，直至12 h。 聯(lián)合治療時(shí)，4 h 后與2.5 mg／kg 多粘菌素B 同時(shí)注射，此后于8、12 h 注射2.5 mg／kg 多粘菌素B。黃艷娟等［12］用靈孢多糖作為α-鵝膏毒肽中毒治療藥物，旨在探究其是否對中毒小鼠的肝腎具有保護(hù)作用。 用KM 小鼠，腹腔注射0.35 mg／kg 劑量α-鵝膏毒肽，4 h 后注射生理鹽水，每日1 次，連續(xù)3 d，建立小鼠中毒模型。 治療組則是注射相同劑量α-鵝膏毒肽，4 h 后，腹腔注射不同劑量的靈孢多糖，每日1 次，治療3 d。 吳鑫等［37］用KM 小鼠建模，腹腔注射α-鵝膏毒肽的劑量則是0.60 mg／kg。 水飛薊賓是較為有效的治療鵝膏毒肽中毒的藥物，故選其作為對照，劑量為20 mg／（kg·d）。 注射0.6 mg／kg α-鵝膏毒肽5 h 后，第1 次腹腔注射水飛薊賓，之后每隔6 h 注射1 次，每日4 次，至48 h。 靈芝總?cè)谱鳛閷?shí)驗(yàn)治療藥物，其采用灌胃方式進(jìn)行干預(yù)，劑量為50、100、200 mg／（kg·d），干預(yù)時(shí)間及次數(shù)與水飛薊賓一致。 劉德明等［38］給KM 小鼠腹腔注射0.10、0.20、0.35、0.70、1.32、2.50 mg／kg 劑量α-鵝膏毒肽，根據(jù)小鼠存活情況計(jì)算出α-鵝膏毒肽的LD50（0.36 mg／kg）。 注射LD50 劑量的α-鵝膏毒肽10 min 后，尾靜脈注射100 mg／kg 水飛薊賓，進(jìn)行治療，治療36 h。 將中毒治療動(dòng)物模型匯總為表3。

表3 α-鵝膏毒肽中毒藥物治療模型匯總Table 3 Summary of α-amanitin poisoning drug treatment models

4 小結(jié)

誤食有毒鵝膏菌會(huì)對人體造成嚴(yán)重的損害，目前對于鵝膏毒肽中毒治療，仍無特效藥可以治愈鵝膏毒肽中毒。 迫切需要理想鵝膏毒肽中毒的動(dòng)物模型，用于毒理機(jī)制、毒代動(dòng)力學(xué)及中毒治療的研究。 由于不同動(dòng)物對鵝膏毒肽的耐受不一，理想的鵝膏毒肽中毒動(dòng)物模型，應(yīng)盡可能模擬人誤食鵝膏菌后臨床表現(xiàn)、病理生理變化、代謝分布及臨床轉(zhuǎn)歸等特點(diǎn)。 從以上建立的動(dòng)物模型不難看出，相同動(dòng)物注射的劑量也存在一定差異；相同治療藥物也存在治療方法及劑量不同。 總之，鵝膏毒肽中毒動(dòng)物模型仍需優(yōu)化和提升，對于揭示鵝膏毒肽毒理機(jī)制和藥物治療等具有重要意義。 有毒蘑菇的危害知識(shí)還需加強(qiáng)普及和宣傳，從“口”防起；其次，對臨床鵝膏毒肽中毒病例也需進(jìn)一步研究，有助于鵝膏毒肽中毒的防治。 鵝膏毒肽對人體可造成嚴(yán)重?fù)p傷，但其本身仍具極高的應(yīng)用價(jià)值。 加強(qiáng)對鵝膏毒肽的開發(fā)與利用，使其在生物研究、腫瘤治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。