基于TLR/NF-κB信號通路探討電針治療失眠癥模型大鼠的作用及機制

張金媛，顧銀銀，葛玲玲，李立文

（1.張家港第一人民醫(yī)院針灸康復科，江蘇 張家港 215600；2.張家港第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 張家港 215600；3.張家港市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，江蘇 張家港 215600）

失眠是指入睡困難、睡眠中途易醒、睡眠時間減少或睡眠質量低下，對日常工作和生活會造成不同程度的影響[1]。目前，臨床常用鎮(zhèn)定類藥物進行治療，短期內有效，但長期治療效果尚未得到證明，鎮(zhèn)定類藥物會對記憶、反應能力帶來一定的影響，同時患者會對鎮(zhèn)定類藥物產生一定的依賴性[2]。研究[3-4]表明，針灸在治療失眠的過程中既有良好的療效，且不良反應方面具有獨特的優(yōu)勢，但其作用機制尚不明確。失眠與機體免疫能力下降有關，且TLR/NF-κB通路是介導免疫功能的重要通路，因此推測電針對失眠癥的調控作用與TLR/NF-κB通路有關。內關作為八脈交會穴，能寧心安神、寬胸理氣，具有主治療失眠等相關病癥的功效[5]。本研究建立失眠癥大鼠模型，對雙側內關進行電針，探究電針通過調控TLR/NF-κB通路對失眠癥大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級、SD雄性大鼠，6周齡，體質量175～230 g，平均（200±15） g，購于南京醫(yī)科大學，許可證為[生產許可SCXK（蘇）2021-0001]。

1.2 主要材料與儀器

氯苯丙氨酸（PCPA）購于上海易恩化學技術有限公司；NaOH和HCL溶液購入西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；安定注射液（地西泮）（國藥準字H62020554，甘肅蘭藥藥業(yè)集團有限責任公司）；TNF-α、sTNF-RⅡ酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；FITC標記F4/80單抗，PE標記TLR3、TLR4單抗均購于北京百奧萊博科技有限公司；總RNA提取試劑盒購于愛必信（上海）生物科技有限公司；TRIzol試劑盒、逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購于上海恪敏生物科技有限公司；兔抗大鼠MyD88、TAB2、NF-kB一抗、山羊抗兔二抗均購于北京百奧萊博科技有限公司。

華佗牌SDZ-Ⅱ電子針療儀及一次性無菌針灸針（規(guī)格：0.25 mm×25 mm）均購于蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；酶聯(lián)免疫以檢測儀（型號：BIOBASE1001，濟南來寶醫(yī)療器械有限公司）；流式細胞儀[型號：CytoFLEX，貝克曼庫爾特國際貿易（上海）有限公司]；美國伯樂高壓電泳儀（型號：Powerpac HV，上海奧陸生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠模型建立及分組 根據(jù)失眠動物造模法[6]進行模型建立，即氯苯丙氨酸（PCPA）造模法，用NaOH和HCL水溶液，將42 mL生理鹽水調至pH為7.8左右的弱堿性溶液，取1.25 g PCPA，用配置好的弱堿性溶液配制為混懸液（300 mg·kg-1），每日1次，連續(xù)腹腔注射2 d。當?shù)?次注射28～30 h后，大鼠晝夜節(jié)律消失，而對照組大鼠晝夜節(jié)律正常，即大鼠失眠模型建立成功。

選用40只雄性大鼠，隨機選取10只為對照組，不作處理，其余大鼠均成功建立失眠模型，并隨機分為模型組，安定組及電針組，每組10只。

1.3.2 藥物處理 建模成功后，根據(jù)人與大鼠的體質量及給藥劑量換算公式[7]，安定組腹腔注射安定注射液（地西泮）0.92 mg· kg-1·d-1；電針對雙側內關進行針刺，設置電針儀參數(shù)為電流強度2 mA，頻率2/15 Hz，留針20 min，隔日1次，均連續(xù)治療15 d共8次；對照組與模型組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.3 酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、可溶性人腫瘤壞死因子受體Ⅱ（sTNF-RⅡ）水平 治療后，對大鼠進行麻醉處理，腹腔注射40 mg· kg-1，2%戊巴比妥鈉，采集5 mL腹主動脈血，室溫靜置2 h，4 000 rpm低溫（4℃）離心10 min，取上清液。根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書，將標準品配制不同的濃度，并加入上清液50 μL，混勻后依次加入酶標記物，顯色劑進行顯色，最終加入終止液，使反應終止，采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測TNF-α、sTNF-RⅡ測光密度值，根據(jù)標準曲線計算待測樣濃度。

1.3.4 流式細胞術檢測大鼠脾臟CD4+、CD5+調節(jié)性T細胞（Treg） 采集血液后處死，取出脾臟，每組5只大鼠脾臟研磨后制成脾細胞混液。取部分脾臟細胞懸液，離心（1 500 rpm，5 min）后棄上清液，加入200 μL溶血劑混勻，溫水?。?0℃）15 min，離心后棄去上清液，沖洗2遍，加入PBS緩沖液，制備1×108·mL-1細胞懸液。吸取10 μL樣本加入流式管，分別加入FITC標記CD4單抗與PE標記CD25單抗各5 μL；冰浴30 min，沖洗后用流式細胞儀進行檢測。

1.3.5 流式細胞術檢測大鼠脾臟單核細胞表面TLR3、TLR4 取制備好的1×108·mL-1脾臟細胞懸液10 μL，分別加入FITC標記F4/80單抗，PE標記TLR3、TLR4單抗各5 μL，冰浴30 min后沖洗；分別加入TLR3、TLR4單抗，冰浴30 min后沖洗。采用流式細胞儀對脾臟單核細胞表面TLR3、TLR4進行檢測。

1.3.6 Western Blot檢測大鼠脾臟MyD88、TAB2、NF-kB蛋白相對表達水平 另5只大鼠脾臟迅速置于液氮中保存，取50～100 mg冷凍保存的脾臟組織，研磨成勻漿，用裂解液對脾臟組織進行裂解，測定脾臟組織的蛋白濃度。采用電泳儀進行電泳，分離目的蛋白質，轉膜后進行1 h封閉，根據(jù)一抗說明書進行稀釋，分別加入MyD88、TAB2、NF-kB及內參一抗、二抗，進行孵育，最后經顯影得到結果。（蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值÷β-Actin 灰度值）[8]。

1.3.7 RT-PCR檢測大鼠脾臟TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表達情況 取50～100 mg冷凍保存的脾臟組織，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取脾臟總RNA，并檢測總RNA的純度及濃度，以總RNA為模板，逆轉錄得到cRNA。取2μLcDNA，與20μL反應體系中進行擴增（2 μL SYBR，上、下游引物各1 μL，純水加至20 μL）；PCR擴增條件：預變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，10 s，退火延伸，60 ℃，34 s，擴增40個循環(huán)[9]。以β-actin為內參，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清TNF-α、sTNF-RⅡ水平比較

見表2。

表2 各組血清TNF-α、sTNF-RⅡ水平比較（±s，n= 70）

表2 各組血清TNF-α、sTNF-RⅡ水平比較（±s，n= 70）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與安定組比較，▲P＜0.05

組別 TNF-α/（pg·mL-1 ） sTNF-RⅡ/（ng·mL-1 ）對照組 81.67±9.28 1.21±0.31模型組 102.68±12.82# 2.23±0.59#安定組 90.42±9.47#△ 1.75±0.42#△電針組 82.35±10.13△▲ 1.23±0.34△▲

2.2 各組脾臟CD4+ Treg、CD4+CD25+ Treg比較

見表3。

表3 各組脾臟CD4+、CD4+CD5+ Treg比較（±s，n = 10） %

表3 各組脾臟CD4+、CD4+CD5+ Treg比較（±s，n = 10） %

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與安定組比較，▲P＜0.05

組別 CD4+ Treg CD4+CD25+ Treg對照組 4.58±0.93 1.31±0.11模型組 2.46±0.41# 4.03±0.01#安定組 3.64±0.56#△ 2.33±0.05#△電針組 4.97±0.87△▲ 1.40±0.07△▲

2.3 各組脾臟單核細胞表面TLR3、TLR4表達情況比較

見表4。

表4 各組脾臟單核細胞表面TLR3、TLR4表達情況比較（±s，n= 10）

表4 各組脾臟單核細胞表面TLR3、TLR4表達情況比較（±s，n= 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與安定組比較，▲P＜0.05

組別 TLR3 TLR4對照組 386.18±25.34 316.57±22.11模型組 524.46±35.71# 468.43±31.61#安定組 425.64±31.56#△ 367.13±26.65#△電針組 395.97±26.63△▲ 323.41±23.21△▲

2.4 各組脾臟MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表達情況比較

見表5、圖1。

表5 各組脾臟MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表達情況比較（±s，n= 10）

表5 各組脾臟MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表達情況比較（±s，n= 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與安定組比較，▲P＜0.05

組別 MyD88 TAB2 NF-kB對照組 1.43±0.24 1.88±0.27 0.87±0.07模型組 3.21±0.35# 3.61±0.34 3.67±0.21#安定組 2.37±0.24#△ 2.11±0.30 2.59±0.14#△電針組 1.51±0.28△▲ 1.64±0.24 0.80±0.08△▲

圖1 各組脾臟MyD88、TAB2、NF-kB蛋白免疫印跡

2.5 各組脾臟TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表達情況比較

見表6。

表6 各組脾臟TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表達情況比較（±s，n= 10）

表6 各組脾臟TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA表達情況比較（±s，n= 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與安定組比較，▲P＜0.05

組別 TLR3 mRNA TLR4 mRNA MyD88 mRNA TAB2 mRNA NF-kB mRNA對照組 0.97±0.07 0.98±0.05 0.95±0.06 1.03±0.05 1.04±0.07模型組 2.07±0.66# 2.25±0.52# 1.45±0.27# 2.24±0.31# 3.01±0.74#安定組 1.27±0.21#△ 1.19±0.19#△ 1.21±0.23#△ 1.07±0.25#△ 1.56±0.34#△電針組 0.90±0.18△▲ 0.87±0.21△▲ 1.06±0.22△▲ 0.81±0.31△▲ 1.17±0.29△▲

3 討論

失眠的作用機制復雜，研究證實，針灸對于神經遞質具有一定的調節(jié)作用，通過調節(jié)中樞神經，從而改善睡眠[10]。炎癥細胞水平受到心情、疼痛等精神狀態(tài)的影響，有研究[11]顯示在抑郁癥患者的炎癥因子水平異常，IL-6、TNFα水平明顯升高。另外失眠還會影響機體的免疫功能，但其作用機制尚不明確。NGF/TrkA通路是介導炎癥反應與免疫作用的重要通路，因此推測電針對于失眠癥的調節(jié)可能與NGF/TrkA通路有關[12]。目前對于NGF/TrkA通路在失眠癥中的研究較少，本研究通過建立失眠癥大鼠模型，探究電針對該通路的調節(jié)作用[13]。

TNF的表達受到晝夜節(jié)律的影響，參與睡眠的調節(jié)，相關研究[12]表明，向家兔腦或靜脈注射TNF，能夠延長其睡眠時間。TNF-α與其他因子共同激活免疫反應，sTNF-R為TNF-α受體，能夠反應TNF-α的活性[13]。本研究中模型組TNF-α、sTNF-RⅡ水平升高，即失眠癥會促進機體炎癥反應的發(fā)生，而安定注射液及電針會使機體TNF-α、sTNF-RⅡ水平，降低機體炎癥反應。其中電針的效果更明顯，使炎癥因子恢復至正常機體水平。CD4+CD25+Treg能夠直接反應機體的免疫情況，正常狀態(tài)下，CD4+CD25+Treg能夠維持機體的免疫耐受，防止機體過免疫，而非正常狀態(tài)下，CD4+CD25+Treg或導致機體出現(xiàn)免疫抑制，降低T細胞的增殖能力，導致機體免疫能力下降，相反CD4+Treg在炎癥存在的情況下，則具有抑制炎癥的作用[14]。本研究中模型組CD4+Treg占比降低，而CD4+CD25+Treg占比升高，說明在失眠的狀態(tài)下，機體處于炎癥狀態(tài)，免疫力降低，而經過西藥治療或電針治療后，CD4+Treg占比升高，而CD4+CD25+Treg占比降低，表明機體炎癥減少，免疫能力提高，提示藥物治療與電針治療均有一定作用，其中電針效果更明顯。

當機體受到外界細菌或病毒入侵時，機體會激活免疫系統(tǒng)抵抗病原體的入侵，也可通過炎癥反應，激活細胞因子殺死病原體[15]。有研究[16]證實，受到外界感染時，會引起發(fā)熱和促進睡眠，睡眠能夠對免疫細胞與細胞因子的活性造成一定影響，睡眠與機體的免疫功能與炎癥反應存在某種聯(lián)系。MyD88依賴型是TLR/NF-κB通路的經典途徑，該途徑中NF-κB被激活，并與TNF-α與IL-1β的啟動子結合，激活機體的免疫系統(tǒng)，調節(jié)炎癥反應[17]。研究結果顯示，模型組TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA及MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表達均上調，表明失眠或激活TLR/NF-κB通路，引起炎癥反應TNF-α、sTNF-RⅡ等分泌升高，同時導致CD4+Treg占比降低，而CD4+CD25+Treg占比升高，機體免疫能力下降。本研究大鼠經過電針治療后，TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-kB mRNA 及 MyD88、TAB2、NF-kB蛋白表達下調，TLR/NF-κB通路受到抑制，提示電針雙側內關穴能夠抑制TLR/NF-κB信號通路，降低炎癥反應，提高機體免疫能力，從而緩解失眠的癥狀，改善睡眠。