補(bǔ)腎健脾-利濕化瘀方對IgA腎病模型大鼠Tfh細(xì)胞通路影響的研究

王銀萍，張洪寶，鄒 迪，張守琳

（長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

補(bǔ)腎健脾-利濕化瘀方由已故國醫(yī)大師任繼學(xué)教授提出，用于治療慢性腎風(fēng)（IgA腎病），可有效降低IgA腎病患者尿中紅細(xì)胞計數(shù)及尿蛋白含量，有效延緩腎功能惡化。為進(jìn)一步研究補(bǔ)腎健脾-利濕化瘀方治療IgA腎病的作用靶點，課題組開展了此項研究。

1 主要材料

1.1 實驗動物

8周齡雄性清潔級SD大鼠90只，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK（京）2016-0006]。

1.2 實驗藥物

補(bǔ)腎健脾-利濕化瘀方藥物組成：生地黃20 g，生黃芪20 g，黃芩15 g，穿山龍30 g，土茯苓20 g，山藥20 g，生茅根20 g，生蒲黃15 g（包煎），茯苓30 g，葛根15 g，紫荊皮15 g。由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供濃縮劑。洛汀新片（鹽酸貝那普利片）每片10 mg，國藥準(zhǔn)字H20030514。

1.3 實驗主要試劑

ICOS Monoclonal Antibody（mA-6E1），F(xiàn)ITC，eBioscience，11-4204-81；CXCR5 Monoclonal Antibody（LG.7F9），PE，eBioscience，12-0271-82；兔抗Bcl-6，Bioswamp，PAB30215；兔抗IL-21抗體，Bioswamp，PAB33379。

2 實驗方法

2.1 造模方法及分組給藥方法

購買健康清潔級SD大鼠90只，喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、模型組、洛汀新組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組15只，采用陸慧瑜[1]改良造模法進(jìn)行模型制備。造模后第9周末，從各組中隨機(jī)各抽取2只，處死后，腹部解剖，分離出腎組織，標(biāo)本制作，熒光染色，最后在免疫熒光下判斷腎小球系膜區(qū)是否有免疫球蛋白IgA的沉積，如果有沉積，則判斷為模型制備成功。

驗證模型成功后，開始藥物干預(yù)，不同的組別用藥則不同，其藥物用量標(biāo)準(zhǔn)參照按體質(zhì)量系數(shù)進(jìn)行計算。其中中藥高劑量組含有中草藥37.42 g，中劑量組含有中草藥18.71 g，低劑量組含有中草藥9.35 g，洛汀新組含洛汀新片63 mg· kg-1；模型組及空白組無需給藥，給予等量的生理鹽水。藥物干預(yù)觀察到第16周末。

2.2 檢測指標(biāo)及方法

觀察各組的一般狀態(tài)，16周后處死，立即取腎臟、小腸黏膜。新鮮的小腸黏膜表達(dá)的ICOS、CXCR5采用流式技術(shù)進(jìn)行檢測；小腸黏膜表達(dá)的Bcl-6、IL-21采用免疫組化法進(jìn)行檢測；采用電鏡法觀察大鼠腎臟病理的改變。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)將采用SPSS 23.0統(tǒng)計方法進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） ，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況

從模型制備到藥物干預(yù)結(jié)束，共14只大鼠死亡，其中在造模過程中模型組及高劑量組各死亡1只，原因為造模后大鼠進(jìn)食差而死亡；其余12只為每組中各取出的2只，主要用于模型炎癥。在整個實驗過程中，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，食欲強(qiáng)，體質(zhì)量也逐漸增加；其他各組大鼠從造模后的第4周開始，毛發(fā)逐漸枯燥，食欲逐漸減退，精神逐漸變差，體質(zhì)量逐漸減輕；從用藥干預(yù)7周后，與模型組比較，各治療組大鼠一般狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，精神逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量逐漸增長，但仍不如空白組精神狀態(tài)好。

3.2 各組ICOS在小腸黏膜的表達(dá)

在空白組中，小腸黏膜及骨髓中ICOS表達(dá)均較少，在模型組中，ICOS表達(dá)均呈強(qiáng)陽性；給藥后，治療組各組ICOS表達(dá)均減少，以中藥中劑量組減少最顯著。見圖1。

3.3 各組CXCR5在小腸黏膜的表達(dá)

空白組中，小腸黏膜中CXCR5表達(dá)呈微弱表達(dá)；模型組中，CXCR5表達(dá)明顯增強(qiáng)；給藥后，各治療組CXCR5表達(dá)均減少，以中藥中劑量組減少最顯著（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組CXCR5在小腸黏膜的表達(dá)

3.4 各組Bcl-6在小腸黏膜的表達(dá)

在空白組中，小腸黏膜Bcl-6表達(dá)較少，呈淺黃色散在分布；在模型組中，Bcl-6表達(dá)明顯增多，呈顆粒狀陽性深棕色表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.01）；給藥后，各治療組小腸黏膜Bcl-6表達(dá)明顯減少，中藥中劑量組減少更為明顯（P＜0.01）。見表1、圖3。

表1 各組Bcl-6在小腸黏膜的表達(dá)比較（±s）

表1 各組Bcl-6在小腸黏膜的表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與其他治療組比較，▲▲P＜0.01

組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 F P空白組 13 0.205 0.027 126.447 0.000模型組 12 0.530## 0.033洛丁新組 13 0.345△△ 0.039中藥高劑量組 12 0.320△△ 0.026中藥中劑量組 13 0.270△△▲▲ 0.031中藥低劑量組 13 0.307△△ 0.029

圖3 各組Bcl-6在小腸黏膜的表達(dá)

3.5 各組IL-21在小腸黏膜的表達(dá)

空白組中IL-21在小腸黏膜的表達(dá)較少，呈淺黃色表達(dá)；模型組中IL-21表達(dá)呈強(qiáng)陽性（P＜0.05）；給藥后，各治療組IL-21的表達(dá)均明顯減少，中藥中劑量組減少更為明顯（P＜0.05）。見表2、圖4。

表2 各組IL-21在小腸黏膜的表達(dá)比較（±s）

表2 各組IL-21在小腸黏膜的表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與其他治療組比較，▲▲P＜0.01

組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 F P空白組 13 0.225 0.029 52.180 0.000模型組 12 0.490## 0.037洛丁新組 13 0.337△△ 0.050中藥高劑量組 12 0.321△△ 0.051中藥中劑量組 13 0.275△△▲▲ 0.031中藥低劑量組 13 0.311△△ 0.037

圖4 各組IL-21在小腸黏膜的表達(dá)

3.6 各組腎臟電鏡的改變

空白組中腎小球系膜區(qū)無系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增生，未見電子致密物沉積，足細(xì)胞正常；模型組中腎小球系膜區(qū)可見大量電子致密物的沉積，少數(shù)系膜細(xì)胞增生，足細(xì)胞廣泛融合；其他各治療組顯示腎小球系膜區(qū)電子致密物呈不同程度的減少，足細(xì)胞部分恢復(fù)，系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增生減少，但中藥中劑量組腎臟系膜區(qū)僅表現(xiàn)為少量電子致密物，足細(xì)胞基本恢復(fù)正常。見圖5。

圖5 各組腎臟電鏡的改變

4 結(jié)論

基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，IgA腎病多與腸道黏膜感染有關(guān)[2-4]。在前期工作中已證實補(bǔ)腎健脾-利濕化瘀方可通過調(diào)節(jié)血清及小腸黏膜中Th1/Th2失衡起到治療IgA腎病的作用，同時課題組發(fā)現(xiàn)小腸黏膜T、B淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)中濾泡輔助性T細(xì)胞通絡(luò)相關(guān)的細(xì)胞因子參與IgA腎病的發(fā)病，此發(fā)病機(jī)理與任繼學(xué)教授提出的“脾腎虧虛、腸道濕熱瘀阻”相吻合?；诖?，課題組開展了此項研究，本研究結(jié)果表明：1）與空白組比較，模型組大鼠的Tfh相關(guān)細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子Bcl-6、CXCR5及ICOS、IL-21在小腸黏膜的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），表明小腸黏膜生發(fā)中心T細(xì)胞向Tfh細(xì)胞的分化被加強(qiáng)，促使B細(xì)胞向分泌IgA的漿細(xì)胞分化，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞提前分化，增加糖基化異常的IgA含量，并沉積于腎臟，腎臟病理表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)可見大量電子致密物沉積，系膜細(xì)胞增生，足細(xì)胞廣泛融合，即導(dǎo)致IgA腎??；2）治療后，各治療組與模型組比較，小腸黏膜Bcl-6、CXCR5及ICOS、 IL-21的表達(dá)明顯減弱，且腎臟病理表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)電子致密物呈不同程度的減少，足細(xì)胞部分恢復(fù)，內(nèi)皮細(xì)胞增生減輕，其中中藥中劑量組減弱更為顯著（P＜0.05）。由此可見，補(bǔ)腎健脾-利濕化瘀方可以通過抑制小腸黏膜生發(fā)中心Tfh的過度活化，減少其相關(guān)因子Bcl-6、CXCR5及ICOS、 IL-21的表達(dá)，減少小腸黏膜生發(fā)中心的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為IgA+B細(xì)胞，進(jìn)而減少糖基化異常的IgA的產(chǎn)生，從而緩解腎臟損傷，為臨床治療提供了實驗依據(jù)。