緊密連接蛋白Claudin?4 在腫瘤中的研究進展

鄢騰峰 談胤求 李云濤 徐 陽 劉寶輝 鄧 剛 陳謙學

武漢大學人民醫(yī)院神經(jīng)外科 湖北 武漢 430060

緊密連接蛋白Claudins 是分子質量20～27 kU的蛋白家族，有27 個家族成員，具有4 個跨膜結構域和兩個細胞外結構域（ECL1 和ECL2），這兩個外結構域與嵌入質膜的?NH2 和?COOH 末端結合，能夠維持細胞間完整性并調(diào)節(jié)細胞旁離子轉運［1，2］。Claudins 蛋白家族成員的過表達或表達缺失，在慢性炎癥和惡性腫瘤等疾病的病理過程中發(fā)揮著關鍵作用［3?5］。Claudins 蛋白家族通常作為緊密連接形成蛋白位于細胞膜上，它們通過同型結合形成復合物調(diào)節(jié)物質在細胞間的擴散［6］。本文主要就Clau?dins 蛋白家族中成員Claudin?4（CLDN4）在腫瘤中的表達和功能、核易位現(xiàn)象及作為腫瘤治療靶點的研究進展進行綜述，為進一步探索CLDN4 在腫瘤中的分子機制提供參考。

1 緊密連接的結構及功能

緊密連接（tight junctions，TJ）構成細胞間的最頂端結構，建立細胞極性并調(diào)節(jié)細胞間物質傳遞。緊密連接的結構和成分組成的細胞間黏附復合物，這種復合物能夠維持細胞間連接，也能夠選擇性的調(diào)節(jié)水、離子、大分子的細胞旁途徑物質交換，并能調(diào)節(jié)細胞膜內(nèi)物質移動［7］。緊密連接蛋白CLDN4是Claudin 家族的重要成員，在各種類型腫瘤中廣泛出現(xiàn)高表達或表達缺失。上皮?間質轉化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）既是細胞正常生理過程中的關鍵一環(huán)，又是癌癥病理進展的重要步驟。從上皮過渡到間充質形態(tài)導致了細胞遷移能力的增強，這促進了腫瘤細胞向鄰近組織的侵襲及轉移。EMT 過程包括細胞緊密連接的喪失、細胞骨架重塑和形態(tài)變化［8］。緊密連接的喪失會導致細胞遷移和侵襲能力增強［9］。這些EMT 過程包括了上皮細胞黏附分子和緊密連接蛋白的下調(diào)［10］。Clau?dins 蛋白家族是高度保守的緊密連接的組成部分之一［11］。在癌癥形成和發(fā)展過程中，細胞間緊密連接常被破壞，導致不受控制的腫瘤生長，惡性細胞從原發(fā)部位遠處轉移，從而導致癌癥患者預后不良。此外，許多證據(jù)發(fā)現(xiàn)緊密連蛋白接既可以作為預后因素，也可以作為治療靶點［12］。

2 CLDN4 在腫瘤中的表達及功能

CLDN4 蛋白過表達或表達缺失在多種腫瘤中被觀察到。在具有淋巴結轉移和高復發(fā)率的晚期乳腺癌中，CLDN1 和CLDN2 出現(xiàn)表達降低［13，14］，而在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中出現(xiàn)了CLDN4 的過度表達［15］。在腎癌中，CLDN4 的核易位促進了Yes 相關蛋白（YAP）的核易位，YAP 與CLDN4 結合，從而誘導EMT 表型，EphA2 和PKC的磷酸化可能引起緊密連接障礙并從緊密連接釋放CLDN4，可能增強與YAP 和閉鎖小帶蛋白1（ZO?1）的結合，形成核易位復合物，并可能是腎癌惡性的 機制之一［16，17］。表1顯示了CLDN4 在不同腫瘤組織中的表達情況［15，18?34］。

表1 CLDN4 在腫瘤組織中的表達

在消化道腫瘤，CLDN4 在胃癌中高表達，與癌旁組織或胃上皮細胞相比，胃癌組織和細胞系中CLDN4 的表達顯著升高，并可能是胃癌的獨立預后因素［35］。TSPEAR?AS2 能夠調(diào)節(jié)miR?1207?5p對CLDN4 的抑制作用，從而抑制胃癌的進展［36］。Song 等［28］得到了同樣的結論，揭示了CLDN4 在胃癌中表達上調(diào)，CLDN4 的表達增強了胃癌細胞的增殖、侵襲和誘導胃癌細胞發(fā)生EMT，并與不良預后相關。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)CLDN4 的下降增強了PI3K 和Akt 的磷酸化，并增強了胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲以及胃癌腫瘤發(fā)生，并降低了細胞凋亡和胃癌細胞對化療的敏感性［27］。在胰腺導管腺癌患者中，CLDN4 高表達與預后良好密切相關［37］。但高級別導管內(nèi)乳頭狀黏液性胰腺癌CLDN4 的表達，明顯高于低級別導管內(nèi)乳頭狀黏液性胰腺癌［38］。CLDN4 低表達的食管鱗癌患者往往具有更差的預后［39］。在喉鱗狀細胞癌中，CLDN4 表達下調(diào)，并且與甲基化CpG 結合蛋白?2（MeCP2）呈負相關，CLDN4 在喉鱗狀細胞癌細胞中高度甲基化，CLDN4 抑制了喉鱗狀細胞癌細胞細胞的遷移和侵襲，而CLDN4 敲低則恢復了細胞的遷移和侵襲［31］。同時，CLDN4 還可能成為消化道相關腫瘤診斷的分子標志物，如CLDN4 在膽管癌中強烈表達，而在肝細胞癌中則成陰性［40］。

在生殖系統(tǒng)腫瘤，卵巢癌中CLDN4 的研究也不統(tǒng)一，既發(fā)現(xiàn)有低表達［20］，也有高表達［19］。在非編碼RNA 的調(diào)控中，Jie 等［18］發(fā)現(xiàn)ELFN1?AS1 能夠通過作為miR?497?3p 的“海綿”促進CLDN4 的表達，從而在卵巢癌中發(fā)揮著癌基因的作用。CLDN4的過表達通過PI3K/Akt 和EMT 轉錄因子Twist1信號通路促進了卵巢癌細胞的EMT［41］。同樣，也有研究表明卵巢癌患者高表達CLDN4 有著更差的預后［42］。在宮頸癌中，有研究表明隨著宮頸病變惡性程度的增加，CLDN4 的陽性表達率也隨之上升，使用CLDN4 和HR?HPV 共同檢測能夠提高診斷的特異性，表明CLDN4 的表達可能與宮頸癌及癌前病變的發(fā)生發(fā)展有關［30］。

CLDN4 對于非小細胞肺癌與上皮樣惡性間皮瘤的區(qū)分，對比MOC?31 和Ber?EP4 具有更大的特異性［43］。研究發(fā)現(xiàn)BHLHE41 表達抑制了腫瘤細胞遷移和侵襲，盡管BHLHE41 通過MAPK/JNK 信號通路抑制MCF?7 細胞侵襲，并下調(diào)CLDN4 的mRNA 和蛋白表達，但它并不影響CLDN4 的細胞內(nèi)定位［21］。

在乳腺癌中，P21 活化蛋白激酶4（PAK4）介導的CCAAT 增強子結合蛋白β（CEBPB）激活上調(diào)CLDN4 表達，促進了乳腺癌細胞的遷移和侵襲［22］。同樣，有發(fā)現(xiàn)CLDN4 高表達的乳腺癌患者（包括接受了化療患者）有著更差的預后［44］。但在乳腺原位癌中，CLDN4 低表達的患者有著更差的預后［45］，和E?cadherin 的表達結合可以更準確預測乳腺癌患者的預后［46］。

3 細菌毒素在CLDN4 靶向治療中的研究

細菌毒素已逐漸成為癌癥治療的有效治療選擇。產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）是具有選擇性細胞毒性的成孔毒素，并且緊密連接蛋白CLDN3 和CLDN4 是 已 知 的 高 親 和 力CPE 受 體［47］。CPE 與Claudins 蛋白的結合會觸發(fā)膜孔復合物的形成，從而導致細胞快速死亡［48］。將表達CLDN4 的人前列腺癌細胞種植入小鼠，在小鼠前列腺癌異種移植物周圍注射CPE 可顯著抑制腫瘤的生長［49］。CPE 的C 端結構域能夠增加和CLDN4 的結合［50，51］，這個特性使研究者更多選擇了一種能與CPE 結合的融合基 因 靶 向CLDN4［52，53］，以 發(fā) 揮 更 大 的 細 胞 毒 性 作用。如CPE 與銅綠假單胞菌外毒素A（ETA）融合，產(chǎn)生免疫毒素（CPEETA'），在頭頸鱗狀細胞癌和乳腺癌中研究了這種免疫毒素抑制CLDN4 陽性癌細胞增殖的能力，并進一步證明CPEETA'對MCF?7乳腺癌和HN5 頭/頸癌細胞系非常有效，而對HeLa細胞（CLDN4 陰性）則沒有細胞毒性作用。同時，免疫毒素隨后在腫瘤定植菌株梭狀芽胞桿菌中表達。最重要的是，厭氧梭狀芽胞桿菌能夠過表達和分泌CPEETA'融合蛋白，這個發(fā)現(xiàn)為厭氧梭狀芽胞桿菌分泌高濃度免疫毒素靶向遞送到腫瘤部位治療CLDN4 陽性癌細胞提供了可能性［54］。在結直腸癌中，CLDN3 和CLDN4 過表達的結腸癌株系顯示出對pCpG?optCPE 表達載體（optCPE）的高度敏感性，導致攜帶人類患者源性結腸癌異種移植物的小鼠體內(nèi)腫瘤生長受到抑制，并伴隨腫瘤內(nèi)optCPE表達而導致大量壞死［48］。有趣的是，有研究表明使用無毒部分CPE（C?CPE）和化療藥物聯(lián)合處理膀胱癌細胞，能夠增加RT4 細胞對絲裂霉素C 和達沙替尼的敏感性［55］。在卵巢癌中，對C?CPE 敏感的卵巢癌細胞，對紫杉醇和卡珀的劑量依賴更低［56］。但是，在口腔鱗狀細胞癌中，研究發(fā)現(xiàn)39%病例顯示CLDN4 表達在核中，并且與CLDN4 陰性病例相比，CLDN4 陽性病例與癌癥進展的相關性更強。CPE 使CLDN4 在人口腔鱗狀細胞癌細胞系HSC3和HSC4 核易位增多，并增強了腫瘤EMT、干性、細胞增殖和侵襲能力［57］。

4 CLDN4 在腫瘤耐藥中的研究

有研究報道，CLDN4 在在三陰性乳腺癌中的表達高于非三陰性乳腺癌，并且發(fā)現(xiàn)緊密連接在三陰性乳腺癌中保留了乳酸，從而降低了腫瘤內(nèi)的pH值。在小鼠模型中，使用抗CLDN4 細胞外結構域抗體（4D3）削弱了乳腺癌細胞緊密連接的屏障功能，增強了紫杉醇的抗癌作用［58］。CLDN4 在食管鱗狀細胞癌干細胞中上調(diào)，高表達CLDN4 的食管鱗狀細胞癌細胞具有更強干性并導致腫瘤在順鉑化療中耐藥，導致了患者預后差。同時硫胺四氫糠基二硫化物（TTFD）降低了食管鱗狀細胞癌細胞中的CLDN4 表達并減弱了干性［29］。在胰腺導管癌中，4D3 以劑量依賴的方式增強了5?氟尿嘧啶（5?FU）誘導的生長抑制，4D3 抑制了腫瘤緊密連接更大消除了腫瘤屏障，促進了5?FU 化療藥滲透入腫瘤微環(huán)境，從而增強5?FU 的抗腫瘤作用，聯(lián)合用藥后小鼠也并未發(fā)生不良反應［59］。在胃癌中，Nishi?guchi 等［60］發(fā)現(xiàn)4D3 和順式二甲基二氯鉑（CDDP）處理可協(xié)同抑制細胞增殖，并比單獨使用順式二甲基二氯鉑處理更大程度地增加腫瘤壞死和細胞凋亡。同樣，在大腸癌中，該團隊用4D3 和抗上皮生長因子受體（EGFR）抗體C225 的聯(lián)合治療在裸鼠中抑制腫瘤生長，裸鼠模型中，相較于同時治療，以6 h 時間間隔連續(xù)治療4D3 和C225 導致對腫瘤生長的抑制作用更為明顯，先使用4D3 處理腫瘤，讓4D3對腫瘤的屏障作用破壞后，再使用C225 能夠將誘導EGFR 磷酸化作用更強，以發(fā)揮最大的抗腫瘤作用［61］。令人鼓舞的是，該研究團隊在膀胱癌中研究中，發(fā)現(xiàn)在皮下腫瘤和肺轉移的小鼠模型中，聯(lián)合4D3 治療可增強順鉑抑制腫瘤生長的效果［62］。在肝細胞癌中，ZNF703 能夠通過直接與CLDN4 啟動子結合，激活CLDN4 的表達誘導EMT 從而促進腫瘤轉移和索拉非尼耐藥［26］。除此以外，抗CLDN4 單克隆抗體IgG1（KM3934）以劑量依賴性方式增強其細胞毒性，并在小鼠體內(nèi)顯著抑制胰腺癌和卵巢癌異種移植物的腫瘤生長［63］。

5 總結及展望

在CLDN4 沒有發(fā)生核易位時，Sasaki 等［59］和Nishiguchi 等［60］發(fā)明了4D3 可能通過引起腫瘤間緊密連接CLDN4 蛋白的結構分解，降低了癌癥的屏障功能，使化療藥物更容易滲透入腫瘤區(qū)域，從而提高化學療法的有效性。Rambabu 等［64］基于同源建模方法構建了人CLDN4 的三維結構，并基于此篩選出了多個分子可能能與CLDN4 的活性位點結合，并在細胞毒性實驗中使用可能分子充當抑制劑，發(fā)現(xiàn)對乳腺癌（MCF7）和肺癌（A549）癌細胞系具有抑制作用。因此，抗CLDN4 抗體作為一種新型的分子靶向藥物具有潛在的應用前景，能夠增強現(xiàn)有藥物的作用效用。使用CPE 的無毒部分和化療藥物聯(lián)合使用，已經(jīng)證明對正常細胞破壞更小［55］。鑒于CPE 的高效率，并且潛在危險小，對于高表達CLDN4 的腫瘤有著非常重要的潛在應用價值。癌細胞中緊密連接分子對EMT 誘導的存在，可能由于它們以組織特異性和癌癥特異性方式起作用，現(xiàn)在對其了解依然甚少。綜上所述，繼續(xù)深入探究CLDN4 分子機制，對于腫瘤的分子治療有著十分重要的意義。