苗藥五香血藤提取物對(duì)CIA大鼠血清VEGF、ASIC3表達(dá)的影響

寧燕 羅康華 蔣催蓉 黨榮敏 葉勁松 劉運(yùn)麟

(1黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558013;2黔南州人民醫(yī)院病理科)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病〔1〕，RA在全球的平均發(fā)病率為1%，我國(guó)的發(fā)病率為0.2%～0.5%，患者的臨床表現(xiàn)多為受累關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及功能下降，如果不進(jìn)行及時(shí)有效的治療，約50%的患者在2年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)畸形和功能受損，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔2,3〕。RA發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)〔4,5〕，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、三型酸敏感離子通道(ASIC3)參與了RA炎癥、疼痛等過(guò)程，并在其中發(fā)揮重要作用。目前，RA治療藥物主要是糖皮質(zhì)激素(GCs)、非甾體抗炎藥(NASDs)等，但該類藥物能夠引起不良反應(yīng)，對(duì)心血管造成一定風(fēng)險(xiǎn)〔6〕。隨著RA治療藥物的不斷研發(fā)，中醫(yī)藥以其副作用小，療效好等特點(diǎn)展現(xiàn)了巨大的挖掘潛力。五香血藤〔7〕是貴州特色苗藥，具有治療關(guān)節(jié)炎、跌打損傷等骨科疾病等作用，然而，有關(guān)五香血藤治療關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究未見(jiàn)報(bào)道，為此，本研究以膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠為模型，進(jìn)一步探索苗藥五香血藤提取物對(duì)VEGF、ASIC3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年SD大鼠60只，雌雄各30只，體重230～250 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠隨機(jī)分為6組，空白對(duì)照組(正常組)，模型對(duì)照組(模型組)，地塞米松對(duì)照組(陽(yáng)性藥物組)，五香血藤提取物低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半，分籠喂養(yǎng)，每籠5只，自由取食，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.1.2藥物 五香血藤購(gòu)自貴州都勻市中藥材市場(chǎng)，并由廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院進(jìn)行鑒定和質(zhì)控，15 kg干五香血藤，粉碎，加入萃取釜中，用80 L 80%的乙醇萃取3次，得到浸膏1 200 g，將浸膏配制成10 mg/ml濃度的儲(chǔ)備液備用。醋酸地塞米松片，辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H37021898；牛Ⅱ型膠原，美國(guó)Chondrex公司提供，批號(hào)：20022；完全弗氏佐劑(IFA)，美國(guó)Sigma公司提供，批號(hào)：20080301。

1.1.3主要試劑與儀器 大鼠血清VEGF及ASIC3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)置武漢基因美科技有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀,型號(hào)：Victor X3，由美國(guó)Perkin Elmer公司提供。

1.2方法

1.2.1CIA大鼠模型制備 依據(jù)文獻(xiàn)〔8,9〕，取2 mg/ml牛Ⅱ型膠原乙酸溶液與等體積完全弗氏佐劑配成1 mg/ml膠原乳劑備用。將0.2 ml膠原乳劑注入每只大鼠的右后足及背皮內(nèi)，1 w后，采用同樣的方法進(jìn)行第2次免疫，每只大鼠的右后足及背皮內(nèi)注射劑量為0.1 ml。第2次免疫后開始計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)(AI)，AI為4個(gè)關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分總和，AI≥4即為造模成功。

1.2.2CIA炎癥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 大鼠的每個(gè)爪子最高評(píng)為4分，每只大鼠最高評(píng)為16分，AI具體標(biāo)準(zhǔn)如下〔10〕:0分=無(wú)關(guān)節(jié)紅腫；1分=關(guān)節(jié)輕度紅腫；2分=關(guān)節(jié)中度紅腫；3分=關(guān)節(jié)重度紅腫；4分=關(guān)節(jié)畸形或不能負(fù)重。

1.2.3足腫脹測(cè)量及計(jì)算 足腫脹度=造模后足趾厚度-造模前足趾厚度〔11〕，分別在造模前和給藥后的第7、14、21、28天，使用游標(biāo)卡尺對(duì)各組大鼠右后足趾進(jìn)行足趾厚度測(cè)量,并進(jìn)行炎癥評(píng)分，直至給藥結(jié)束。

1.2.4給藥方案 第1次免疫14 d后，AI≥4分，造模成功，1 d后開始給藥。藥物劑量參考文獻(xiàn)〔12〕進(jìn)行確定，陽(yáng)性藥物組給予醋酸地塞米松灌胃，劑量，0.35 mg/kg；五香血藤提取物低、中、高劑量組灌胃劑量分別為63、126、252 mg/kg；模型組與正常組給予灌胃同體積的蒸餾水；各組大鼠給藥次數(shù)為1次/d，連續(xù)給藥28 d。

1.2.5取材與組織處理 于末次給藥結(jié)束后2 h對(duì)大鼠進(jìn)行相應(yīng)處理。先稱取各組大鼠體重并記錄，后股動(dòng)脈取血處死大鼠：①取股動(dòng)脈血，靜置，離心，取上清液，在-20℃下保存待測(cè)。采用ELISA測(cè)定大鼠血清VEGF、ASIC3水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；②取大鼠雙踝關(guān)節(jié)及足爪，分離去除周圍軟組織及肌肉組織，放入4%的多聚甲醛固定，脫鈣、水化、蘇木素-伊紅(HE)染色、透明、固定后，光鏡下觀察病理變化。

1.2.6測(cè)定臟器指數(shù) 待大鼠處死后，解剖取胸腺、脾臟等器官，濾紙吸干，稱重，記錄數(shù)據(jù)備用。臟器指數(shù)=臟器重量/體重×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及多重比較。

2 結(jié) 果

2.1各組右后足腫脹度比較 與正常組比較，各實(shí)驗(yàn)組足腫脹度較為明顯(P<0.05)，給藥不同時(shí)間，各藥物組大鼠足腫脹度與模型組比較，均顯著好轉(zhuǎn)(P<0.05)，第14、21、28天，五香血藤提取物高劑量組與陽(yáng)性藥物組足腫脹度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組關(guān)節(jié)總AI比較 模型組及各給藥組第7、14、21、28天關(guān)節(jié)各AI顯著高于正常組(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性藥物組及五香血藤提取物高劑量組第7、14、21、28天關(guān)節(jié)總AI顯著降低(P<0.05)，五香血藤提取物低劑量組第14、28天及五香血藤提取物中劑量組第14、21、28天關(guān)節(jié)總AI顯著降低(P<0.05)。在給藥的第21天和28天，五香血藤提取物高劑量組與陽(yáng)性藥物組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 各組給藥不同時(shí)間右后足腫脹度比較

表2 各組給藥不同時(shí)間關(guān)節(jié)總AI比較分)

2.3各組血清VEGF、ASIC3水平比較 第28天給藥結(jié)束后，與正常組比較，各實(shí)驗(yàn)組血清VEGF、ASIC3表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各藥物組VEGF、ASIC3表達(dá)顯著降低(P<0.05)；陽(yáng)性藥物組與五香血藤提取物高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組血清VEGF、ASIC3水平比較

2.4各組臟器指數(shù)比較 與模型組比較，各給藥組脾臟、胸腺指數(shù)差異顯著(P<0.05)，與陽(yáng)性藥物組比較，五香血藤提取物中、高劑量組脾臟和胸腺指數(shù)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

2.5各組關(guān)節(jié)病理觀察 正常組踝關(guān)節(jié)滑膜組織光滑完整，組織結(jié)構(gòu)正常,滑膜細(xì)胞、軟骨及骨組織中未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織排列紊亂、增生明顯，軟骨組織破壞明顯，在軟骨面，還可見(jiàn)部分軟骨細(xì)胞增生，周圍組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且組織水腫嚴(yán)重；五香血藤提取物低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織仍有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但其浸潤(rùn)及組織水腫現(xiàn)象較模型組有所減輕；五香血藤提取物中劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織及周圍組織內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，組織輕度水腫，其間少量新生血管及滑膜增生，軟骨輕度增生，少數(shù)關(guān)節(jié)軟骨破壞；五香血藤提取物高劑量組和陽(yáng)性藥物組大鼠踝關(guān)節(jié)均可見(jiàn)明顯新生血管，滑膜組織病理狀況明顯改善，滑膜組織及周圍組織內(nèi)水腫明顯緩解，僅可見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，沒(méi)有明顯的軟骨及骨組織的破壞，見(jiàn)圖1。

表4 各組臟器指數(shù)比較

圖1 各組踝關(guān)節(jié)病理(HE染色,×100)

3 討 論

RA是一種慢性炎癥反應(yīng)，近年來(lái)，有關(guān)RA中藥治療的研究逐漸成為RA藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。2015年，國(guó)務(wù)院辦公廳發(fā)布《國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于印發(fā)中醫(yī)藥健康服務(wù)發(fā)展規(guī)劃(2015-2020年)的通知》〔13〕，將中醫(yī)藥服務(wù)醫(yī)療、服務(wù)健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展上升至國(guó)家發(fā)展層面，進(jìn)一步深化醫(yī)藥衛(wèi)生改革，促進(jìn)全面健康。五香血藤為木蘭植物長(zhǎng)梗五味子的莖藤，是貴州常用的民間草藥，具有活血消腫、理氣止痛等功效，其主要活性成分為木脂素，具有抗腫瘤、抗氧化、安定等藥理作用〔14〕。本研究結(jié)果表明，就CIA大鼠足關(guān)節(jié)外部形態(tài)而言，五香血藤提取物發(fā)揮了消除腫脹的作用。

VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，就目前研究得知為最強(qiáng)血管通透劑，能夠促使內(nèi)皮細(xì)胞分化和增生，使血管通透性增強(qiáng)，誘導(dǎo)血管翳的生成〔4，15〕。VEGF與RA關(guān)系研究認(rèn)為〔16，17〕，VEGF對(duì)關(guān)節(jié)滑膜血管翳的形成具有特殊的影響作用，通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，形成新微生血管，使血管內(nèi)物質(zhì)滲出增加，血管通透性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的進(jìn)一步發(fā)展。劉春芳等〔18〕對(duì)風(fēng)濕祛痛膠囊對(duì)CIA大鼠滑膜血管新生的影響進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中VEGF含量明顯增加，VEGF含量與CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥呈正相關(guān)。本研究結(jié)果提示，五香血藤提取物能夠?qū)IA大鼠關(guān)節(jié)的炎癥因子發(fā)揮抑制作用。

ASICs是一類胞外H+激活的陽(yáng)離子通道，屬于阿米洛利敏感的上皮鈉通道/退變素，超家族中的一員，在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛分布，與RA關(guān)系密切〔19〕。已研究發(fā)現(xiàn)〔20，21〕，ASICs能夠促進(jìn)RA關(guān)節(jié)組織中白細(xì)胞介素(IL)-1β等炎癥細(xì)胞的分泌，參與組織酸化調(diào)控。其中3型，ASIC3在痛覺(jué)傳導(dǎo)通路上廣泛存在，在炎癥環(huán)境中痛覺(jué)敏感形成發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，是主要的酸感受器〔22〕。季慶輝等〔23〕對(duì)ASIC3 在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠疼痛中的作用進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASIC3與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性疼痛呈正相關(guān)。

胸腺和脾臟是機(jī)體的重要免疫器官，胸腺、脾臟指數(shù)能夠在一定程度上反映出機(jī)體的免疫水平〔24〕。胸腺能夠產(chǎn)生胸腺細(xì)胞，胸腺細(xì)胞能夠作為T淋巴細(xì)胞的后備細(xì)胞，以備T細(xì)胞不足之需，協(xié)助機(jī)體完成免疫調(diào)控。脾臟作為機(jī)體重要的淋巴器官，能夠?qū)τ泻ξ⑸铩⒛[瘤細(xì)胞等進(jìn)行過(guò)濾，是機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的重要場(chǎng)所。本研究表明，五香血藤提取物能夠?qū)IA大鼠發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，高劑量五香血藤提取物能夠通過(guò)抑制VEGF和ASIC3的表達(dá)，對(duì)CIA大鼠發(fā)揮較好的治療作用，但RA發(fā)病機(jī)制尚未明確，五香血藤對(duì)其治療作用機(jī)制還有待進(jìn)一步挖掘。