基于Aβ生成、聚集機(jī)制研究中藥防治阿爾茨海默病的進(jìn)展

于臻 王凱 徐家淳 孫偉明 張琳琳

(1天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；2天津中醫(yī)藥大學(xué)；3天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶減退為主要臨床癥狀，是癡呆的最常見類型〔1〕。AD病理上主要表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白(Aβ)過度沉積形成老年斑、tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)和進(jìn)行性的神經(jīng)元突觸缺失〔2〕，其中Aβ在腦內(nèi)異常增多聚集產(chǎn)生神經(jīng)毒性是AD的始動(dòng)與中心環(huán)節(jié)〔3〕，并可增強(qiáng)tau病理變化〔4〕，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、葡萄糖及能量代謝障礙等一系列病理過程〔5〕，造成突觸功能障礙、神經(jīng)元丟失導(dǎo)致AD認(rèn)知障礙〔6〕，且這一病理改變?cè)贏D臨床癥狀出現(xiàn)前15～20年就已開始〔7〕。因此，減少Aβ生成和聚集，進(jìn)而減輕Aβ的神經(jīng)毒性作用是AD防治的重要方面。AD屬祖國醫(yī)學(xué)“癡呆”“健忘”等病癥范疇〔8〕，中醫(yī)藥方法多樣，具有多途徑、多靶點(diǎn)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已得到越來越多的關(guān)注。針對(duì)AD至今尚無有效的防治手段，本文將Aβ生成、聚集機(jī)制及近年來中藥靶向于此的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Aβ生成

Aβ來源于神經(jīng)元中淀粉樣前體蛋白(APP)，由APP基因編碼產(chǎn)生，廣泛存在于全身組織細(xì)胞的一種跨膜蛋白，包括一段較長的細(xì)胞外N端和一段較短的細(xì)胞內(nèi)C端，主要有2種代謝方式〔9〕：①非淀粉樣代謝途徑，新生的APP通過反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(TGN)進(jìn)入細(xì)胞表面，首先經(jīng)其上α-分泌酶剪切形成可溶性的N端片段(sAPPα)分泌到細(xì)胞外，sAPPα具有神經(jīng)保護(hù)作用〔10〕；細(xì)胞內(nèi)的C端片段(αCTF)經(jīng)過γ-分泌酶分解成可溶性的短肽鏈和APP蛋白細(xì)胞片段。②淀粉樣代謝途徑：APP首先經(jīng)β-分泌酶(BACE)1剪切形成可溶性的N端片段(sAPPβ)分泌到細(xì)胞外；細(xì)胞內(nèi)C端片段(βCTF)經(jīng)γ-分泌酶剪切后可生成大量含有36～43個(gè)氨基酸殘基的Aβ單體，分子量為4 kD左右，人體內(nèi)約90%為含有40個(gè)氨基酸的Aβ40，其次是比Aβ40在C端多出2個(gè)氨基酸的Aβ42片段〔11〕。這2種代謝方式是相互競爭的〔12〕，因此增加α-分泌酶的表達(dá)可相應(yīng)的減少APP進(jìn)入淀粉樣代謝途徑生成Aβ。而γ-分泌酶由早老素(PS)1和2基因參與編碼產(chǎn)生，主要包括4個(gè)亞基，水解底物眾多，故抑制γ-分泌酶的藥物常因影響Notch等重要信號(hào)通路的正常生理功能而產(chǎn)生多種嚴(yán)重的不良反應(yīng)〔13〕。BACE1在腦內(nèi)神經(jīng)元中高表達(dá)，研究顯示〔14〕，在散發(fā)型AD和AD源性輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)患者的大腦或腦脊液中BACE1的表達(dá)或活性明顯高于正常對(duì)照，所以常通過抑制BACE1的表達(dá)活性減少Aβ的生成〔15〕。

在淀粉樣代謝途徑中，APP經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)，形成內(nèi)體，在內(nèi)體中被BACE1和γ-分泌酶連續(xù)切割產(chǎn)生Aβ單體，隨后可通過胞吐釋放到細(xì)胞外。其中Vps10p家族中分揀蛋白相關(guān)受體1(SorLA)作為APP的分選受體，可介導(dǎo)其與逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體Retromer復(fù)合物結(jié)合由內(nèi)體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至TGN中，并延長其在TGN內(nèi)的停留時(shí)間〔9〕，使APP重新回到細(xì)胞膜上參與非淀粉樣代謝，以降低APP進(jìn)入淀粉樣代謝途徑的概率〔16〕。同時(shí)SorLA還可直接引導(dǎo)新生成的Aβ進(jìn)入溶酶體中降解〔17〕，從而減少Aβ的釋放和沉積。由上可見，Aβ的生成與APP及α、β、γ各分泌酶均密切相關(guān)，促進(jìn)APP的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制其被水解為Aβ單體，也是減少Aβ生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2 Aβ聚集

APP剪切后形成的Aβ單體并不具有毒性〔18〕，Aβ聚集后方產(chǎn)生神經(jīng)毒性。Aβ因其自身結(jié)構(gòu)的原因，經(jīng)過翻譯后修飾很容易自聚集形成寡聚體、原纖維至成熟穩(wěn)定的纖維聚集體，使Aβ的結(jié)構(gòu)由α螺旋向β折疊轉(zhuǎn)換，并最終在神經(jīng)元外沉積形成老年斑(SPs)〔19〕。Aβ蛋白主要分為親水性較強(qiáng)的N端區(qū)域和疏水性較強(qiáng)的C端區(qū)域兩部分，是一種典型的兩親性多肽，其中C端中的序列Lys16-Phe20是聚集的核心區(qū)域，也是聚集體中β-sheet結(jié)構(gòu)的主要組成部分〔20〕，而N端基本不參與該結(jié)構(gòu)的形成〔21〕，Aβ42因在C端多出幾個(gè)氨基酸使其更易于聚集，不僅聚集的速度更快，其聚集體的毒性也更強(qiáng)〔22〕。翻譯剪切后的Aβ蛋白，在特定條件下會(huì)進(jìn)行翻譯后修飾，對(duì)Aβ的錯(cuò)誤聚集產(chǎn)生一定影響，如磷酸化和焦谷氨酸化修飾都會(huì)增強(qiáng)Aβ聚集成寡聚體和纖維體〔23〕，并與AD的病程發(fā)展具有一定的相關(guān)性〔24〕，或可成為AD發(fā)病過程中不同時(shí)期的診斷標(biāo)志物〔25〕。

Aβ的聚集過程非常復(fù)雜，受多種因素影響〔26〕，聚集動(dòng)力學(xué)上將這個(gè)過程常描述為一個(gè)典型的S形曲線，認(rèn)為Aβ呈“成核生長”機(jī)制，Aβ單體先經(jīng)過一定的構(gòu)象轉(zhuǎn)化聚集形成寡聚體、原纖維，并逐漸形成“聚集核”，此時(shí)為延滯期；當(dāng)聚集達(dá)到一定程度后進(jìn)入伸長期，在“聚集核”的催化下，快速聚集生長，形成成熟的纖維聚集體，達(dá)到穩(wěn)定平臺(tái)期。其中，可溶性的Aβ寡聚體神經(jīng)毒性最強(qiáng)〔27〕，因其與細(xì)胞膜有很強(qiáng)的相互作用，并能和多種受體結(jié)合，比SPs沉積更與認(rèn)知能力變化具有相關(guān)性，被認(rèn)為是造成AD病理的可能“元兇”〔28〕，包括二聚體、三聚體、Aβ56(56 kD)、Aβ來源可溶性配體(35～60 kD)、球聚體(38～48 kD)及環(huán)狀原纖維 (APFs)〔29〕。

3 中藥對(duì)AD中Aβ生成和聚集的調(diào)控作用

3.1減少Aβ生成 針對(duì)上述Aβ生成過程中的各關(guān)鍵靶點(diǎn)，中藥復(fù)方益腎化濁方在快速老化小鼠(SAMP8)和AD模型大鼠上進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其可通過下調(diào)APP、PS1基因的表達(dá)〔30〕，上調(diào)α-分泌酶和sAPPα的表達(dá)水平〔31〕，進(jìn)而減少海馬區(qū)Aβ含量〔32〕，保護(hù)海馬神經(jīng)元和突觸，從而在行為學(xué)上顯著改善模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔33〕。古代名方地黃引子〔34〕正符合AD腎精虧虛為本痰瘀阻竅為標(biāo)的病機(jī)特點(diǎn)，故可用于AD的防治中，其對(duì)于Aβ生成也具有一定的干預(yù)作用，采用免疫組化法探索其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)該復(fù)方通過顯著下調(diào)β-APP和BACE1，減少淀粉樣代謝途徑，實(shí)現(xiàn)顯著降低AD模型大鼠腦內(nèi)Aβ的表達(dá)水平。湖北中醫(yī)藥大學(xué)團(tuán)隊(duì)〔35〕依據(jù)AD本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)，由“五補(bǔ)丸”(《太平惠民和劑局方》)化裁創(chuàng)制固本健腦液，用黨參、枸杞子分別顧護(hù)先后天之本，酸棗仁、茯苓合山楂以奏健腦之效，從APP加工及轉(zhuǎn)運(yùn)過程探討其對(duì)Aβ生成的影響，發(fā)現(xiàn)該方可通過上調(diào)AD模型大鼠SorLA mRNA和蛋白及逆轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體的表達(dá)，降低海馬中Aβ42的水平，進(jìn)而改善AD模型的學(xué)習(xí)記憶能力。養(yǎng)血清腦方〔36〕由黃連解毒湯加減化裁而來，內(nèi)含黃連、黃芩、黃柏、丹參、延胡索、鉤藤6種中草藥，可通過降低3XTg-AD 和5XFAD兩種轉(zhuǎn)基因小鼠的APP及其C端片段的表達(dá)，降低Aβ的生成及負(fù)荷，顯著改善兩種小鼠的記憶和認(rèn)知功能。北京宣武醫(yī)院團(tuán)隊(duì)運(yùn)用慢性腦低灌注的體內(nèi)外模型研究遠(yuǎn)志湯及其有效成分遠(yuǎn)志皂苷元和β-細(xì)辛腦〔37〕治療老年人認(rèn)知功能障礙的具體機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該方及活性成分在體外可通過降低APP分泌酶BACE1和PS1的表達(dá)水平，降低Aβ40和Aβ42的含量，提高神經(jīng)元的存活率，進(jìn)而降低體內(nèi)大鼠模型中Aβ的聚集。

中藥單體也可減少細(xì)胞和動(dòng)物模型中Aβ的生成，如石菖蒲的主要成分之一β-細(xì)辛腦〔38〕在PC12細(xì)胞AD模型中可通過降低APP、PS1、BACE1蛋白的表達(dá)水平，抑制體外Aβ的表達(dá)；補(bǔ)腎中藥女貞子的有效成分齊墩果酸〔39〕可顯著下調(diào)SAMP8小鼠海馬組織中APP、PS1基因的表達(dá)水平，抑制Aβ的形成，保護(hù)神經(jīng)元形態(tài)；β-谷甾醇〔40〕具有神經(jīng)保護(hù)作用，可通過降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦中BACE1的表達(dá)減少Aβ生成，改善小鼠空間學(xué)習(xí)和識(shí)別記憶障礙，提示其可能在一定程度上預(yù)防AD；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和Western印跡直接檢測(cè)羌活中的提取物羌活呋喃考馬林〔41〕干預(yù)HEK-APPswe293T細(xì)胞后Aβ的水平，發(fā)現(xiàn)其呈劑量依賴性抑制Aβ的分泌和產(chǎn)生，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示其能顯著降低APP/PS1小鼠海馬和皮層中Aβ的含量，改善AD模型的認(rèn)知功能；同樣，傳統(tǒng)天然化合物枸杞多糖〔42〕也可降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ的水平，體外實(shí)驗(yàn)采用神經(jīng)元細(xì)胞SK-N-SH和AD細(xì)胞模型HEK293/APPswe中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果一致，提示其可顯著減少Aβ的生成，且不影響細(xì)胞活力；丹參酮ⅡA磺酸鈉〔43〕干預(yù)Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，ELISA和Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示其可降低Aβ水平，ELISA和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)提示其可能通過提高α分泌酶活性及降低BACE1活性調(diào)控Aβ的產(chǎn)生，從而減輕Aβ對(duì)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3.2抑制Aβ聚集 中藥復(fù)方養(yǎng)血清腦方〔44〕從Aβ自聚集及其介導(dǎo)的細(xì)胞毒性角度進(jìn)行了系統(tǒng)研究，采用生物化學(xué)、生物物理和基于細(xì)胞的方法發(fā)現(xiàn)，該方明顯減少了Aβ42的纖維形成，并改變其β-sheet構(gòu)象，表明其可抑制淀粉樣蛋白的一級(jí)成核作用，在Aβ?lián)p傷的SH-SY5Y細(xì)胞模型中，大劑量的養(yǎng)血清腦方可減弱約60%的Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，同時(shí)有效改善細(xì)胞畸形，從而通過Aβ42的毒性聚集發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，顯示出防治AD的潛力。韓國研究由薏苡仁、龍眼、桔梗、菖蒲、酸棗仁、五味子、遠(yuǎn)志等14味中草藥共64 g組成的調(diào)胃升清湯復(fù)方〔45〕，通過體外硫黃素(Th)T實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)5XFAD小鼠模型4G8、ThS組織化學(xué)分析均表明該復(fù)方具有顯著抗Aβ聚集的作用，補(bǔ)中益氣湯體內(nèi)研究也顯示其可增強(qiáng)抑制Aβ聚集〔46〕。

但目前更多的是發(fā)現(xiàn)很多中藥小分子可抑制Aβ聚集所引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性，并據(jù)此進(jìn)行藥物的設(shè)計(jì)合成與開發(fā)研制，其中以姜黃素〔47〕、白藜蘆醇〔48〕、阿魏酸〔49〕等為代表的化學(xué)小分子抑制劑，主要針對(duì)Aβ自聚集過程中的特征結(jié)構(gòu)β-片層的形成，從而有效調(diào)節(jié)其聚集。此外，還有以天然產(chǎn)物表兒茶素(EGCG)〔50〕和蘇木中主要活性成分巴西木素〔51〕等為代表的化合物，可通過有效打散Aβ聚集體的方式緩解其聚集造成的神經(jīng)毒性。采用ThT進(jìn)行熒光光譜分析及原子力顯微鏡觀察金銀花中提取純化的果膠多糖LFA03-a發(fā)現(xiàn)〔52〕，LFA03-a呈劑量依賴性抑制Aβ42的聚集并抑制其寡聚體和纖維的形成，同時(shí)LFA03-a可輕度誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)纖維的生成，提示果膠LFA03-a可能是防治AD的一潛在靶向藥物。另一些研究也利用體外ThT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察，如山楂的乙醇提取物〔53〕對(duì)Aβ聚集的影響發(fā)現(xiàn)，該提取物對(duì)Aβ纖維的形成呈濃度依賴性，并能引發(fā)纖維的分解，阻斷Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡；酸棗仁中主要活性成分黃酮類化合物斯皮諾素〔54〕不僅可抑制Aβ1-42的聚集，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示其可通過影響APP過程減少Aβ1-42的產(chǎn)生。燈盞生脈膠囊主要活性成分黃芩苷〔55〕體內(nèi)干預(yù)APP/PS1小鼠發(fā)現(xiàn)其緩解該AD小鼠認(rèn)知功能障礙的作用與黃芩苷上調(diào)其皮層低毒性的淀粉樣斑塊、下調(diào)高毒性的Aβ42和Aβ40水平有關(guān)，體外通過生化分析證實(shí)其可加速Aβ42單體轉(zhuǎn)化為高分子量聚集體，并通過微量熱泳法測(cè)定其與Aβ單體的結(jié)合，利用計(jì)算對(duì)接模型預(yù)測(cè)了其與Aβ纖維的結(jié)合區(qū)域，提示其在AD防治中具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上，中藥減少Aβ生成機(jī)制的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)多圍繞調(diào)控APP及其代謝過程中的3個(gè)分泌酶的相關(guān)表達(dá)進(jìn)行，并采用ELISA、Western印跡、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光等方法予以檢測(cè)，以期從根源上降低Aβ產(chǎn)生、預(yù)防AD；而中藥抑制Aβ聚集的研究較復(fù)雜，多是在體外進(jìn)行觀測(cè)，因涉及蛋白構(gòu)象等轉(zhuǎn)變，常采用ThT動(dòng)力學(xué)、圓二色譜、原子力顯微鏡或透射電鏡、固態(tài)核磁等技術(shù)手段進(jìn)行，且多以中藥單體研究為主，關(guān)注環(huán)節(jié)相對(duì)單一。Aβ的生成和聚集所致神經(jīng)毒性并不是孤立存在，兩者呈鏈?zhǔn)郊?jí)聯(lián)反應(yīng)緊密相連，而中藥的多靶點(diǎn)特性常使其作用于多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮效力。因此，研究中藥復(fù)方在Aβ生成與聚集過程中的調(diào)控作用，對(duì)于闡釋中藥復(fù)方作用機(jī)制及防治AD均具有重要意義。