小鼠SMC1A基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物信息學(xué)探討

胡丁旺 邱榮暉 傅梅萍 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 福州 350122

染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白（structural maintenance of chromosome，SMC）在染色體結(jié)構(gòu)細(xì)胞周期性的動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮著重要作用[1]，而SMC1A作為染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白家族的一個(gè)重要成員，它是編碼凝聚素核心復(fù)合物的一個(gè)亞單位，該亞單位將姐妹染色單體束縛在一起，以確保在有絲分裂和減數(shù)分裂中正確的染色體分離[2]。SMC1A基因在參與DNA損傷修復(fù)的過(guò)程中，作為重組蛋白復(fù)合物的組成部分，可通過(guò)重組進(jìn)行DNA修復(fù)，被認(rèn)為是DNA修復(fù)的必要因素，并與細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和凋亡密切相關(guān)[3-5]。

SMC1A不僅在DNA修復(fù)的過(guò)程發(fā)揮重要作用，也是維持基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，而基因組的不穩(wěn)定性被認(rèn)為是發(fā)生癌癥的重要原因之一[6]。臨床研究表明，SMC1A表達(dá)低的急性髓性白血病患者生存時(shí)間明顯更短[7]，而SMC1A基因的突變可導(dǎo)致科妮莉亞德朗熱綜合征[8]，在結(jié)腸直腸癌體細(xì)胞基因突變檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)了SMC1A基因的突變[9]。

SMC1A并不是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白，己經(jīng)參與了多種人類(lèi)疾病的發(fā)生。為探討SMC1A的結(jié)構(gòu)和功能，本研究通過(guò)克隆小鼠SMC1A基因，構(gòu)建pET28a-SMC1A原核表達(dá)系統(tǒng)，分析其遺傳學(xué)和生物信息學(xué)特性，為研究機(jī)體SMC1A基因組穩(wěn)定性和進(jìn)一步探究SMC1A基因在相關(guān)疾病中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 試驗(yàn)用ICR小鼠，體質(zhì)量20 g左右，來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 儀器與試劑 2720 Thermal PCR儀（熱安上海儀器儀表有限公司）；pMDTM19-T Vector Cloning Kit（批號(hào)：6013）和PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)：6110A）均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒（批號(hào)：DP209）、質(zhì)粒小提試劑盒（批號(hào)：DP104）和T4 DNA連接酶（批號(hào)：RT406）均購(gòu)自天根生化科技有限公司；Anti-His Mouse mAb（批號(hào)：HT501）和山羊抗鼠二抗HRP（批號(hào)：HS211）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠SMC1A基因引物設(shè)計(jì) 利用基因庫(kù)中SMC1A的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)SMC1A基因引物對(duì)和載體T7引物對(duì)，序列結(jié)果見(jiàn)表1，引物委托生工生物公司進(jìn)行合成。

表1 引物信息

1.2.2 小鼠SMC1A基因的擴(kuò)增 取小鼠新鮮心臟組織，提取總RNA，再按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit的操作說(shuō)明，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并根據(jù)引物的PCR條件，擴(kuò)增得到目的基因。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 鑒定正確的PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，膠回收樣品與pMD-19T載體按照試劑盒進(jìn)行添加，并置于4℃環(huán)境下過(guò)夜反應(yīng)，反應(yīng)完成后加入50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，次日選取陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.4 SMC1A蛋白序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與功能分析 采用DNAstar軟件建立不同種屬SMC1A核酸遺傳進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行同源性和抗原肽分析。采用軟件SignalP 4.1 Server、NetNG-Lycl.OServer和NetPhos 3.1進(jìn)行信號(hào)肽、N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)分析。采用SWISS-MODEL建立SMC1A蛋白3D結(jié)構(gòu)圖。

1.2.5 pET28a-SMC1A表達(dá)蛋白的Western-blot鑒定 所構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-SMC1A表達(dá)的重組蛋白大小為131.2 kD。將PET-28a(+)質(zhì)粒載體和重組質(zhì)粒PET28a-SMC1A分別轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，采用1.2.3方法進(jìn)行PCR鑒定，并選取陽(yáng)性菌落入恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)，第二天添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)前取1 mL菌液備用。誘導(dǎo)4 h后，菌液取1 mL離心留沉淀，添加上樣緩沖液進(jìn)行變性，截取SDS-page膠上相應(yīng)條帶位置進(jìn)行His標(biāo)簽蛋白Western-blot試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 SMC1A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到SMC1A基因的1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定見(jiàn)圖1。結(jié)果提示，3 000～5 000 bp間可見(jiàn)一條帶，而SMC1A基因大小為3 703 bp，具有一致性。

圖1 SMC1A基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-SMC1A PCR鑒定結(jié)果目的基因SMC1A上下游引物與T7上下游載體引物分別組合進(jìn)行PCR鑒定，1～4號(hào)孔道的條帶均出現(xiàn)在3 000～5 000 bp，大小與預(yù)期一致（見(jiàn)圖2），說(shuō)明pET28a-SMC1A原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 pET28a-SMC1A PCR鑒定結(jié)果

2.3 SMC1A基因同源性分析結(jié)果 從NCBI Gen-Bank下載得到恒河猴源、人源、豬源、小鼠源、大鼠源和斑馬魚(yú)源SMC1A基因，并加入克隆得到的SMC1A基因測(cè)序序列，進(jìn)行核酸遺傳進(jìn)化樹(shù)比對(duì)和同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠源SMC1A基因與大鼠源、恒河猴源和人源的SMC1A基因具有高同源性（見(jiàn)圖3-圖4）。

圖3 核酸遺傳進(jìn)化樹(shù)（×100）

圖4 不同種族來(lái)源的SMC1A基因同源性分析

2.4 SMC1A蛋白功能分析 SMC1A基因可編碼翻譯1 233個(gè)氨基酸，其蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)，SMC1A蛋白無(wú)N-糖基化位點(diǎn)、跨膜螺旋區(qū)域和信號(hào)肽，但在SMC1A蛋白多肽上可能存在82個(gè)達(dá)到閾值的磷酸化位點(diǎn)（見(jiàn)圖5），包括47個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、22個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、13個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

圖5 SMC1A蛋白磷酸化能力預(yù)測(cè)

2.5 抗原肽分析 預(yù)測(cè)SMC1A蛋白的抗原肽35條，選取的代表性抗原肽具體信息見(jiàn)表2。

表2 SMC1A蛋白抗原位肽分析結(jié)果

2.6 SMC1A蛋白3D結(jié)構(gòu) SMC1A蛋白肽鏈經(jīng)多次螺旋、折疊及一系列的結(jié)構(gòu)修飾后，軟件模擬的SMC1A蛋白的3D模型見(jiàn)圖6。

圖6 SMC1A蛋白3D模型

2.7 重組質(zhì)粒pET28a-SMC1A表達(dá)蛋白的Western-blot鑒定 重組質(zhì)粒PET28a-SMC1A所表達(dá)的帶His標(biāo)簽蛋白，約為135.6 kD。根據(jù)預(yù)測(cè)蛋白大小截取相應(yīng)泳道蛋白條帶，利用Anti-His Mouse mAb（1:1 000）對(duì)蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后，100～140 kD位置均出現(xiàn)較為明顯的蛋白印跡，且誘導(dǎo)后的蛋白印跡強(qiáng)于誘導(dǎo)前（見(jiàn)圖7）。

圖7 重組蛋白的Western-blot鑒定

3 討 論

在癌癥的發(fā)生過(guò)程中，內(nèi)聚蛋白的缺陷導(dǎo)致了染色體的不穩(wěn)定性，而SMC1A作為染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白的重要成員之一，對(duì)于染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。眾多研究顯示，SMC1A與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，SMC1A基因的缺失、異位和突變，都可能造成染色體破壞，從而引起相關(guān)疾病的發(fā)生[10]。為了明確SMC1A的結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)克隆SMC1A基因并構(gòu)建至pET-28a(+)原核表達(dá)載體，經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序鑒定，證實(shí)pET28a-SMC1A構(gòu)建成功，與不同種屬核苷酸序列的同源性分析顯示，與大鼠源同源性高達(dá)96.9%，而與人源基因同源性約為91.7%，與人源基因的高同源性確認(rèn)了SMC1A基因?qū)е碌募膊≡谑箢?lèi)動(dòng)物上的開(kāi)展和研究的可行性。

蛋白質(zhì)要發(fā)揮其機(jī)體功能，相關(guān)研究認(rèn)為蛋白質(zhì)之間的相互作用必不可少[12]，DNA損傷修復(fù)、自噬和凋亡等重要過(guò)程的發(fā)生均需要蛋白質(zhì)相互作用的參與和介導(dǎo)，而蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用主要依賴(lài)于蛋白翻譯后的多種修飾作用，常見(jiàn)的蛋白修飾作用有甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等，這些修飾作用常常發(fā)生于賴(lài)氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基上[13]。筆者通過(guò)蛋白磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，SMC1A蛋白多肽上存在較多的磷酸化位點(diǎn)，通過(guò)這些不同磷酸化位點(diǎn)進(jìn)一步篩選分析，或許可以找到SMC1A介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、自噬和凋亡的關(guān)鍵分子機(jī)制。SMC1A蛋白上共有35條抗原肽段，足夠多的抗原肽段可以為SMC1A基因疾病模型的免疫治療提供更多的抗原表位選擇。另外，蛋白肽鏈一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾不同決定了蛋白具有不同的功能，筆者通過(guò)軟件模擬SMC1A蛋白的3D結(jié)構(gòu)圖，初步分析SMC1A蛋白結(jié)構(gòu)的螺旋、折疊和跨膜特性，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行Westernblot鑒定，在IPTG誘導(dǎo)前后蛋白表達(dá)量存在差異，但I(xiàn)PTG的最佳誘導(dǎo)濃度以及最佳誘導(dǎo)時(shí)間還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，對(duì)于SMC1A結(jié)構(gòu)和功能的探討，為SMC1A介導(dǎo)的相關(guān)疾病的研究提供理論方向。通過(guò)研究SMC1A蛋白在癌癥中的表達(dá)狀況與分子功能，對(duì)于進(jìn)一步明確癌癥發(fā)病的分子機(jī)制有著積極的意義，并且可能為癌癥的治療與預(yù)防尋找到新的突破口。