柚皮素通過調(diào)控Nrf2-GPX4介導(dǎo)的鐵死亡途徑保護腦出血大鼠*

黎玉環(huán)， 熊光潤， 鄭 力， 李 敏， 鄭永強

（宜昌市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 宜昌 443008）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種破壞性神經(jīng)損傷，占所有中風(fēng)的10%～15%，具有高發(fā)病率和高死亡率等特點［1］。由于缺乏有效的治療選擇，ICH 患者的預(yù)后較差［2］。血腦屏障（blood brain barrier，BBB）損傷、腦水腫和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，造成不良預(yù)后的主要原因［1］。在大腦中，ICH 會導(dǎo)致各種類型的神經(jīng)元死亡，包括鐵死亡［3］。鐵死亡是一種受調(diào)節(jié)的非凋亡性細胞死亡形式，由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化積累引起。據(jù)報道，鐵死亡有助于ICH 引起的腦損傷，并且可能是ICH 后有影響的細胞死亡類型之一［4］。因此，靶向抑制鐵死亡的治療可有效預(yù)防神經(jīng)元死亡。

核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是一種重要的鐵死亡抑制劑，激活Nrf2 可通過直接上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的轉(zhuǎn)錄來保護細胞免受鐵死亡［5］。據(jù)報道，在 ICH 后，腦內(nèi) GPX4 水平逐漸降低，24 h 達到最低水平，而GPX4 水平升高可緩解ICH 后腦水腫、BBB 損傷、神經(jīng)元功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥［6］。因此，用特異性抑制劑抑制鐵死亡或上調(diào)GPX4 可能是減輕ICH 引起的腦損傷的潛在策略。柚皮素（naringenin，NAR）是一種天然抗氧化劑，屬于黃酮類化合物，因可以激活Nrf2而被認為是一種神經(jīng)保護劑［7］。NAR 可以通過激活神經(jīng)元中的Nrf2 信號通路，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平以減輕氧化應(yīng)激［8］。有資料顯示，NAR可通過調(diào)節(jié)Nrf2/GPX4 軸抑制鐵死亡進而減輕心肌缺血/再灌注損傷［9］。然而，NAR 是否能抑制 ICH 中的鐵死亡還未見相關(guān)報道。

材料和方法

1 動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 94 只，7～8 周齡，體質(zhì)量（280±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號為SCXK（魯）2019-0003。飼養(yǎng)在濕度為45%～55%、溫度為20～23 ℃的環(huán)境中，并保持12 h 的明暗循環(huán)，自由獲取水和食物。

2 主要試劑與儀器

NAR（純度≥95%）購自Sigma-Aldrich；Nrf2 特異性抑制劑ML385 購自MedChemExpress；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（WST-1 法）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（TBA 法）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（微板法）均購自南京建成生物工程研究所；Fluoro-Jade C（FJC）退化神經(jīng)元染色試劑盒購自艾美捷科技有限公司；亞鐵離子（Fe2+）含量檢測試劑盒（比色法）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE；超氧化物陰離子熒光探針）及兔源Nrf2、GPX4、溶質(zhì)載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）、lamin B1 和 GAPDH 抗 體 購 自 Thermo Fisher Scientific。DB006-1型數(shù)顯腦立體定位儀（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司）；iMark680 多功能酶標儀（Bio-Rad）；Axio Scope A1熒光顯微鏡（Zeiss）。

3 主要方法

3.1 模型制備、分組及給藥 采用腦內(nèi)注射自體血液的方法建立ICH 模型［1］：用戊巴比妥鈉（45 mg/kg）通過腹腔注射麻醉大鼠，并用加熱墊使動物體溫維持在37 ℃；然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，暴露前囪，在前囪后1 mm，向右旁開3.8 mm 處用顱骨鉆鉆一直徑為1 mm的小孔（深度達硬腦膜）；將26號針立體定向插入右側(cè)紋狀體（坐標：前0.1 mm、腹側(cè)5.5 mm 和前囟外側(cè) 3.8 mm），于 10 min 內(nèi)注入 100 μL 自體全血（剪斷尾尖取血），注射速度10 μL/min，注射結(jié)束后停留20 min 以防回流（sham 組在相應(yīng)時間內(nèi)注入等容量生理鹽水）；隨后拔出針頭，用骨蠟密封注射孔，縫合切口。其中，有4 只大鼠在手術(shù)中死亡。

將大鼠分為假手術(shù)組（sham 組）、ICH 組、低劑量（60 mg/kg）NAR（low-dose NAR，NAR-L）組、高劑量（120 mg/kg［10］）NAR（high-dose NAR，NAR-H）組和NAR（120 mg/kg）+Nrf2 抑制 劑 ML385（30 mg/kg［11］）組，每組 18 只。分組完成后，NAR-L 組和 NAR-H 組大鼠灌胃給予相應(yīng)劑量的NAR（溶解于5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液），NAR+ML385 組大鼠在灌胃給予120 mg/kg NAR 的同時腹腔注射30 mg/kg ML385（DMSO 溶解稀釋），sham 組和 ICH 組給予等體積的5%羧甲基纖維素鈉灌胃和DMSO 腹腔注射，每日1次，灌胃和腹腔注射的體積均為10 mL/kg，連續(xù)給藥7 d。

3.2 神經(jīng)功能評分 使用改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）量 表［12］評估ICH 后大鼠的行為缺陷，神經(jīng)功能由對動物分組不知情的研究人員進行評估。mNSS 由運動、感覺、平衡和反射測試組成。神經(jīng)功能通過0～18 分進行分級（1～6 分，輕度損傷；7～12 分，中度損傷；13～18分，重度損傷；0 和18 分分別代表正常表現(xiàn)和嚴重神經(jīng)功能缺損）。在神經(jīng)功能損傷的嚴重程度評分中，不能完成測試或沒有測試反射為1 分，得分越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴重。

3.3 腦含水量測定 腦含水量通過濕/干重法進行評估。每組隨機選擇6 只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠，然后將其斷頭。立即將大鼠的大腦取出并分成5 個部分，即對側(cè)皮質(zhì)（contralateral cortex，Cont-CX）、對側(cè)基底神經(jīng)節(jié)（contralateral basal ganglia，Cont-BG）、同側(cè)皮質(zhì)（ipsilateral cortex，Ipsi-CX）、同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)（ipsilateral basal ganglia，Ipsi-BG）和小腦（cerebellum，CB）。CB 用作內(nèi)部對照。將各部分放在預(yù)先稱重的鋁箔片上，用電子分析天平稱量腦組織并記錄濕重，然后在電烘箱中100 ℃干燥72 h，測得恒重。使用以下公式評估含水量：含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

3.4 BBB 通透性測定 BBB 通透性的定量分析通過伊文思藍（Evans blue，EB）染料外滲進行評估［13］。每組隨機選擇6 只大鼠，將大鼠麻醉并通過尾靜脈注射給予溶于生理鹽水中的2%EB 溶液（4 mL/kg）。循環(huán)2 h 后，在深度麻醉下用250 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）進行心內(nèi)灌注，以清除腦循環(huán)中殘留的EB染料。隨后，取出大腦，稱重并在1 mL 50%三氯乙酸溶液中均質(zhì)化。4 ℃、21 000×g離心20 min，上清液用乙醇以1∶3 稀釋，在610 nm 處測定吸光度（A）。根據(jù)標準曲線計算EB 含量，EB 含量以μg/g 腦組織重量來表示。

3.5 FJC染色檢測腦組織中退化神經(jīng)元 為了檢測退化的神經(jīng)元，進行FJC 染色［14］。每組隨機選擇6只大鼠，用戊巴比妥鈉麻醉后，大鼠用PBS 溶液和4%多聚甲醛經(jīng)心灌注，迅速取出腦組織，預(yù)冷的生理鹽水沖洗殘留的血跡后，于冰上將腦組織分為三部分，一部分制備10%的組織勻漿，一部分-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪徊糠种苽浔鶅銮衅耗X組織用30%蔗糖溶液脫水、OCT 包埋，用冷凍切片機小心地將組織切成薄片。將腦組織冰凍切片（14 μm）浸入1%氫氧化鈉溶液5 min，然后用蒸餾水沖洗切片并浸入0.06%高錳酸鉀溶液中10 min。再次用蒸餾水沖洗后，將載玻片轉(zhuǎn)移到溶解在0.1%乙酸載體中的0.0001%FJC 溶液10 min。用蒸餾水洗滌后，將載玻片放入50℃的烘箱中20 min。最后，切片在二甲苯中清洗5 min 并用DPX 封片劑固定。使用熒光顯微鏡在每張切片的血腫周圍拍攝4張高倍圖像，計數(shù)FJC 染色陽性（FJC+）神經(jīng)元。

3.6 腦組織中 Fe2+、MDA 和 GSH 含量及 SOD 活性檢測 切取部分腦組織，稱重，按1∶9 的比例加入生理鹽水于研磨機中進行研磨，制備組織勻漿，離心取上清液，BCA 法測定勻漿上清液中的總蛋白濃度。（1）按照Fe2+含量檢測試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，于593 nm 處測得吸光度（A），繪制標準曲線并計算Fe2+濃度。（2）按照試劑盒說明書檢測勻漿中MDA 和GSH 含量及SOD 活性，MDA 含量用酶標儀在532 nm波長下測定A值，GSH 含量在420 nm 波長下測定A值，SOD活性在520 nm波長下測定A值。

3.7 DHE 熒光染色法檢測腦組織ROS 水平 取腦組織冰凍切片（10 μm），與10 μmol/L DHE 在37 ℃下避光孵育30 min，PBS 洗滌切片3 次，封片，然后通過共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長535 nm，發(fā)射波長610 nm）觀察DHE 染色的熒光強度，并用ImageJ 軟件分析平均熒光強度，表示腦組織中ROS水平。熒光強，表明ROS含量高。

3.8 Western blot 檢測腦組織中鐵死亡相關(guān)蛋白表達 取-80 ℃冰箱保存的腦組織，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中勻漿提取總蛋白，并采用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白（用于檢測Nrf2 水平）。12 000×g離心 10 min 取上清液，使用 BCA 法測定蛋白濃度。通過10% SDS-PAGE 分離等量的蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，將膜用5%脫脂牛奶封閉2 h，然后分別與Ⅰ抗［Nrf2（1∶1 000）、SLC7A11（1∶1 000）、GPX4（1∶500）、lamin B1（1∶1 000）和 GAPDH（1∶2 000）］在4 ℃下孵育過夜。隨后，將膜與山羊抗兔IgG（HRP，1∶2 000）在室溫下孵育2 h，使用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒顯影觀察蛋白質(zhì)條帶。使用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值。以GAPDH（總蛋白）和lamin B1（胞核蛋白）作為內(nèi)參照，量化目標蛋白的表達。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 9.0 軟件，多組間比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用SNK-q檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NAR對ICH大鼠神經(jīng)功能的影響

與sham組相比，ICH組大鼠mNSS評分顯著升高（P＜0.05）；與 ICH 組相比，NAR-L 組和 NAR-H 組大鼠mNSS評分顯著降低（P＜0.05）；與NAR-H 組相比，NAR-L 組和 NAR+ML385 組大鼠 mNSS 評分顯著升高（P＜0.05），見圖1。

2 NAR對ICH大鼠腦含水量的影響

各組中，Cont-CX、Cont-BG 和 CB 的含水量無顯著差異（P＞0.05）。在Ipsi-CX 和Ipsi-BG 中，與sham組相比，ICH 組含水量顯著升高（P＜0.05）；與ICH 組相比，NAR-L 組和NAR-H 組含水量顯著降低（P＜0.05）；與 NAR-H 組相比，NAR-L 組和 NAR+ML385組含水量顯著升高（P＜0.05），見圖2。

Figure 1. Effects of NAR on mNSS score of ICH rats. Mean±SD. n=18.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.圖1 NAR對ICH大鼠mNSS評分的影響

Figure 2. Effects of NAR on brain water content（BWC）in ICH rats. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.圖2 NAR對ICH大鼠腦含水量的影響

3 NAR對ICH大鼠BBB通透性的影響

與 sham 組相比，ICH 組 EB 含量顯著升高（P＜0.05）；與ICH組相比，NAR-L組和NAR-H組EB含量顯著降低（P＜0.05）；與NAR-H 組相比，NAR-L 組和NAR+ML385 組 EB 含量顯著升高（P＜0.05），見圖3、4A。

Figure 3. EB staining of rat brain tissues in each group.圖3 各組大鼠腦組織EB染色

4 NAR對ICH大鼠腦組織退化神經(jīng)元的影響

與sham 組相比，ICH 組FJC+神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；與 ICH 組相比，NAR-L 組和 NAR-H 組FJC+神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與NAR-H 組相比，NAR-L組和NAR+ML385組FJC+神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P＜0.05），見圖5、4B。

5 NAR 對 ICH 大鼠腦組織 Fe2+、ROS、MDA 和GSH含量及SOD活性的影響

與 sham 組相比，ICH 組 Fe2+、ROS 和 MDA 含量顯著升高，GSH 含量和SOD 活性顯著降低（P＜0.05）；與 ICH 組相比，NAR-L 組和 NAR-H 組 Fe2+、ROS 和MDA 含量顯著降低，GSH 含量和SOD 活性顯著升高（P＜0.05）；與 NAR-H 組相比，NAR-L 組和 NAR+ML385 組 Fe2+、ROS 和 MDA 含量顯著升高，GSH 含量和SOD活性顯著降低（P＜0.05），見圖6。

6 NAR 對 ICH 大 鼠 腦 組 織 Nrf2、SLC7A11 和GPX4蛋白水平的影響

Figure 6. Effects of NAR on Fe2+（A），ROS（B），MDA（C）and GSH（D）content，and SOD activity（E）in brain tissues of ICH rats. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.圖6 NAR對ICH大鼠腦組織Fe2+、ROS、MDA和GSH含量及SOD活性的影響

與 sham 組相比，ICH 組大鼠腦組織 Nrf2、SLC7A11 和 GPX4 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與ICH 組相比，NAR-L 組和 NAR-H 組大鼠腦組織 Nrf2、SLC7A11 和 GPX4 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與NAR-H 組相比，NAR-L 組和 NAR+ML385 組大鼠腦組織Nrf2、SLC7A11 和GPX4 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖7。

討 論

鐵是一種血紅蛋白降解產(chǎn)物，ICH 后鐵會在血腫周圍積聚，引起急性腦水腫和延遲性腦萎縮，進而導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。此外，鐵對于鐵死亡的發(fā)生至關(guān)重要，細胞內(nèi)鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物積累，可降低GPX4 表達，誘導(dǎo)鐵死亡；而通過鐵螯合劑結(jié)合游離的鐵離子可以減少鐵死亡。在本研究中，我們觀察到在ICH 大鼠神經(jīng)元中發(fā)生了鐵死亡，這可以通過ROS、Fe2+含量和MDA（脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物）含量的增加以及GSH 含量、SOD 活性和GPX4 表達的減少來證明。這與以往的研究結(jié)果一致，表明鐵死亡在ICH中具有重要作用。Li 等［15］報道，鐵死亡導(dǎo)致 ICH 后神經(jīng)元死亡，抑制神經(jīng)元鐵死亡可以減輕ICH 后腦損傷。

據(jù)報道，NAR 在鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［16］，可減輕大鼠海馬中鐵過載誘導(dǎo)的焦慮樣行為障礙、線粒體功能障礙和乙酰膽堿酯酶活性，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，可作為一種鐵螯合抗氧化劑［17］。為了進一步評估NAR 對ICH 大鼠模型腦損傷的影響，我們評估了行為缺陷、BBB 損傷、腦水腫和血腫周圍腦組織的退化神經(jīng)元，結(jié)果顯示，NAR 可以改善ICH 大鼠的神經(jīng)功能，降低腦水腫和BBB 通透性，并顯著減少了ICH大鼠的神經(jīng)元退化，說明NAR 對ICH 誘導(dǎo)的腦損傷具有保護作用。這與以往的研究結(jié)果一致，再次證實NAR 的神經(jīng)保護作用。但在BBB 通透性檢測中，可以觀察到EB 以穿刺點為中心向外擴散，表明EB外滲與注血導(dǎo)致的機械創(chuàng)傷有關(guān)，這可能會對BBB通透性的分析產(chǎn)生不利影響，在未來的研究中將考慮是否存在非創(chuàng)傷性的造模方法可以減少機械創(chuàng)傷對BBB 通透性的影響。此外，本研究結(jié)果顯示，NAR降低了ICH 大鼠腦組織中Fe2+含量和脂質(zhì)過氧化標志物（ROS 和MDA）水平，并增加了GSH 含量、SOD活性和GPX4 表達。GPX4 是一種抗氧化酶，可將脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒脂質(zhì)，從而抵抗脂質(zhì)過氧化，進而防止鐵死亡。當(dāng)GPX4活性降低時，無法抑制細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累和致死量的 ROS，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生鐵死亡［18］。GSH 是GPX4 的合成底物，是GPX4 發(fā)揮抗氧化功能的輔助因子，目前被認為是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［19］。提示，NAR 對ICH 大鼠腦損傷發(fā)揮保護作用的分子機制可能與鐵死亡有關(guān)。

Figure 7. The protein expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in rat brain tissues in each group. Western blot was used to detect the protein expression levels of Nrf2，SLC7A11 and GPX4. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.圖7 各組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11和GPX4的蛋白表達

Nrf2 是 NAR 發(fā)揮神經(jīng)保護作用的重要靶點［20］。Xu 等［9］的研究顯示，NAR 可通過激活 Nrf2-GPX4 軸抑制鐵死亡來減輕心肌缺血/再灌注損傷。Nrf2在抗氧化中起關(guān)鍵作用，也被認為是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控鐵死亡途徑中大多數(shù)酶和蛋白質(zhì)的表達，如 GPX4、SLC7A11、FTH1 和 TfR1［21］。SLC7A11是一種關(guān)鍵的鐵死亡調(diào)節(jié)劑，通過維持氧化還原的穩(wěn)定狀態(tài)作為鐵死亡的負調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，ICH 大鼠腦組織神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡的同時伴隨著Nrf2（胞核）的下調(diào)，表明Nrf2 核易位被抑制，導(dǎo)致抗鐵死亡基因和蛋白表達降低。而NAR促進了Nrf2的表達和核轉(zhuǎn)位，上調(diào)了GPX4 和SLC7A11 表達；與Xu 等［9］的研究結(jié)果一致。因此，推測 NAR 可能通過激活Nrf2 通路減輕ICH 后的腦損傷。為了驗證此推測，本研究在給予NAR 干預(yù)的基礎(chǔ)上，使用Nrf2 抑制劑ML385 抑制Nrf2 的核轉(zhuǎn)位，結(jié)果顯示ML385 能明顯減弱NAR 對Nrf2-GPX4 通路的激活作用以及對ICH 大鼠腦損傷的保護作用。提示，NAR 可能通過激活Nrf2-GPX4通路，抑制鐵死亡。

綜上所述，NAR 可能通過激活Nrf2-GPX4 通路，抑制鐵死亡，減輕ICH 大鼠腦水腫和BBB 損傷，進而發(fā)揮腦保護作用。本研究表明NAR 可作為一種潛在的鐵死亡抑制劑對ICH 誘導(dǎo)的腦損傷提供保護作用。但本研究僅對一種ICH 模型（自體血模型）進行了研究，未對其他ICH 模型（如IV 型膠原酶誘導(dǎo)模型）進行研究；在未來的研究中，將增加其他ICH 模型進一步驗證NAR的腦保護機制。