結(jié)直腸癌中NAT10與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

劉英竹，程先碩，蔡昕怡，羅 含，江 凡，張麗娟

結(jié)直腸癌是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)。2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率位居第3位，病死率位居第2位[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵性因素。腫瘤局限于結(jié)直腸的結(jié)直腸癌患者5年生存率約90%，而發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率則會(huì)大幅降低[2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多基因變化的一系列復(fù)雜過(guò)程，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)使其從原發(fā)灶脫落而更具侵襲性，是其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，其過(guò)程涉及包括Wnt通路在內(nèi)的多條信號(hào)通路。目前已有研究證實(shí)[3]，結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與EMT密切相關(guān)。N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶10(N-acetyltransferase 10, NAT10)是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，由1 025個(gè)氨基酸組成的核蛋白，包含1個(gè)乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)富含賴氨酸的羧基末端。NAT10在正常組織中表達(dá)定位于核仁中；而在腫瘤細(xì)胞中，NAT10存在易位表達(dá)如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜。目前已有研究表明[4]，NAT10表達(dá)上調(diào)可促使EMT進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞性肝癌的轉(zhuǎn)移。然而，NAT10在結(jié)直腸癌中研究甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)NAT10、E-cadherin、β-catenin、vimentin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，探究NAT10表達(dá)與結(jié)直腸癌EMT的相關(guān)性及與臨床病理特征的關(guān)系，旨在為探索結(jié)直腸癌患者新的抗腫瘤治療方法提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集云南省腫瘤醫(yī)院2016年8月～2021年9月存檔的原發(fā)性結(jié)直腸腺癌根治性標(biāo)本95例作為實(shí)驗(yàn)組，30例癌旁正常組織(距離癌組織5 cm以上的正常腸黏膜組織)作為對(duì)照組。95例結(jié)直腸腺癌中，男性55例，女性40例；<50歲者21例，≥50歲者74例；高+中分化62例，低分化33例；腫瘤浸潤(rùn)至T1(黏膜下層)14例，T2(固有肌層)34例，T3(漿膜下層)有46例，T4(穿透漿膜層)1例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0(無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)48例，N1(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)3枚及以下)34例，N2(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)4枚及以上)13例；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期44例，Ⅲ+Ⅳ期51例；無(wú)脈管內(nèi)癌栓或神經(jīng)侵犯57例，有脈管內(nèi)癌栓或神經(jīng)侵犯38例；無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移80例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移15例。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理診斷證實(shí)初診為結(jié)直腸腺癌的根治術(shù)術(shù)后標(biāo)本；(2)患者術(shù)前未行放、化療及靶向治療；(3)未合并其它惡性腫瘤；(4)有完整的臨床病理資料。

1.2 主要試劑E-cadherin、β-catenin、vimentin鼠抗人單克隆抗體均購(gòu)自福州邁新公司，免疫化檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司。NAT10購(gòu)自Abcam公司。

1.3 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片。NAT10抗體為濃縮液，1∶2 000比例稀釋。將已知陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。一抗包括NAT10、E-cadherin、β-catenin、vimentin，免疫組化采用MaxVision 3HRP法，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判讀

1.4.1NAT10判讀 NAT10在正常結(jié)直腸黏膜組織中表達(dá)定位于細(xì)胞核核仁，因此當(dāng)≥10%的結(jié)直腸腺癌細(xì)胞呈細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞膜易位表達(dá)時(shí)，即判定為陽(yáng)性[5]。

1.4.2E-cadherin、vimentin判讀 觀察高倍(400×)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞未染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐為3分?？傇u(píng)分=不同染色狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)×對(duì)應(yīng)的染色評(píng)分。將E-cadherin評(píng)分<200稱為表達(dá)下降，將vimentin評(píng)分>30稱為表達(dá)上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)將E-cadherin表達(dá)下降稱為陰性，反之稱為E-cadherin陽(yáng)性；將vimentin表達(dá)上調(diào)稱為陽(yáng)性，反之稱為vimentin陰性。結(jié)果判定由2名醫(yī)師采用雙盲法讀片確定。

1.4.3β-catenin判讀 β-catenin在正常結(jié)直腸黏膜組織中表達(dá)定位于細(xì)胞膜，在結(jié)直腸腺癌中存在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核異位表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用Maruyama等[6]的方法，即當(dāng)10%及以上的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)表達(dá)時(shí)稱為異位表達(dá)，即陽(yáng)性；反之則為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)，采用斯皮爾曼對(duì)NAT10及EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸腺癌和正常腸黏膜組織中NAT10的表達(dá)在30例正常腸黏膜組織中，有90%(27/30)的NAT10表達(dá)定位于細(xì)胞核核仁(圖1)；在95例結(jié)直腸腺癌組織中，有70.5%(67/95)出現(xiàn)細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性(圖2)，29.5%(28/95)為陰性或細(xì)胞核核仁陽(yáng)性。

2.2 結(jié)直腸腺癌與正常腸黏膜組織中E-cadherin、β-catenin、vimentin的表達(dá)結(jié)直腸癌組織中E-cadherin呈陽(yáng)性(圖3)，陽(yáng)性率為56.8%(54/95)；在正常腸黏膜組織中，E-cadherin陽(yáng)性率為96.7%(29/30)，結(jié)直腸癌組織中E-cadherin的陽(yáng)性率明顯低于正常腸黏膜組織(P<0.001)。結(jié)直腸癌組織中β-catenin呈陽(yáng)性(圖4)，陽(yáng)性率為74.7%(71/95)；在正常腸黏膜組織中，β-catenin陽(yáng)性率為0(0/30)，結(jié)直腸癌組織中β-catenin陽(yáng)性率明顯高于正常腸黏膜組織(P<0.001)。結(jié)直腸癌組織中vimentin呈陽(yáng)性(圖5)，陽(yáng)性率為35.8%(34/95)；在正常腸黏膜組織中vimentin陽(yáng)性率為0(0/30)，結(jié)直腸癌組織中vimentin陽(yáng)性率明顯高于正常腸黏膜組織(P<0.001，表1)。

表1 結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜組織中E-cadherin、β-catenin及vimentin的表達(dá)

2.3 結(jié)直腸腺癌中NAT10與E-cadherin、β-catenin、vimentin表達(dá)的相關(guān)性在結(jié)直腸腺癌組織中，E-cadherin、β-catenin、vimentin的陽(yáng)性率分別是56.8%、74.7%、35.8%。相關(guān)性分析顯示，NAT10與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與vimentin、β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)(表2)。

表2 結(jié)直腸腺癌中NAT10與E-cadherin、β-catenin及vimentin表達(dá)的相關(guān)性

2.4 結(jié)直腸腺癌中NAT10表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系NAT10表達(dá)與結(jié)直腸腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度及pTNM分期相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、神經(jīng)及脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P>0.05，表3)。

表3 結(jié)直腸腺癌中NAT10表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

NAT10是乙?；D(zhuǎn)移酶GCN5相關(guān)N端乙酰基轉(zhuǎn)移酶超家族成員，具有組蛋白和非組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶功能[7]。近年來(lái)，研究顯示NAT10參與人體內(nèi)的若干種生理及病理生理過(guò)程，如調(diào)控mRNA穩(wěn)定性及翻譯效率、調(diào)控端粒酶活性、調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展等，且在細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、DNA損傷反應(yīng)和EMT中均有作用，因此NAT10可能是治療癌癥的潛在靶點(diǎn)[8-9]。NAT10在淋巴組織、腎臟、肝臟、小腦、大腦皮層和胚胎時(shí)期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織中廣泛表達(dá)。在功能正常的細(xì)胞中，其表達(dá)定位于核仁；在腫瘤組織中，其存在易位表達(dá)，常位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等。這種易位表達(dá)機(jī)制尚不完全清楚，可能是由同時(shí)缺失68-75、989-1018兩個(gè)基因片段所導(dǎo)致[10]。

Zhang等[5]研究表明，NAT10過(guò)表達(dá)可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞活動(dòng)度，促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系密切，且NAT10的易位表達(dá)模式也與結(jié)直腸癌分化程度及預(yù)后相關(guān)。低分化、預(yù)后差的結(jié)直腸腺癌中，NAT10更傾向于細(xì)胞膜表達(dá)；而中+高分化、預(yù)后相對(duì)較好的結(jié)直腸腺癌傾向細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核表達(dá)及聯(lián)合表達(dá)。這種易位表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性在透明性腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞性肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤中曾得到證實(shí)[11]。但也有研究表明[12]，結(jié)直腸癌組織中NAT10表達(dá)水平較正常組織明顯降低，且在結(jié)直腸腺癌、胃腺癌、胰腺腺癌中，NAT10水平與E-cadherin水平呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)與Zhang等[5]的研究結(jié)論一致，認(rèn)為NAT10過(guò)表達(dá)可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞活動(dòng)度，但本實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)細(xì)胞膜的表達(dá)模式，可能與病例數(shù)較少和組織差異有關(guān)。

在生理狀態(tài)下，正常組織中上皮細(xì)胞間具有強(qiáng)大的黏附能力，使其緊密相連，難以發(fā)生轉(zhuǎn)移。而當(dāng)上皮細(xì)胞喪失了原來(lái)特性，轉(zhuǎn)化為疏松排列的具有間質(zhì)細(xì)胞特性的細(xì)胞時(shí)，EMT就此產(chǎn)生，其是腫瘤突破基膜，發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要步驟。有研究表明[13-14]，EMT在多種惡性腫瘤如結(jié)直腸癌、乳腺癌、子宮頸癌、肝細(xì)胞性肝癌、骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、舌鱗狀細(xì)胞癌中均有發(fā)生。在宏觀方面，EMT表現(xiàn)為細(xì)胞形狀的改變，由原先排列緊湊的圓形或立方形上皮細(xì)胞變?yōu)榕帕惺杷傻乃笮渭?xì)胞，并伴有遷移游走能力增強(qiáng)。微觀表現(xiàn)為上皮表型標(biāo)志物如：E-cadherin、膜性β-catenin的表達(dá)減少，同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物如vimentin、N-cadherin、MMPs等表達(dá)增加。其中β-catenin核異位可負(fù)性調(diào)控膜相關(guān)性E-cadherin/β-catenin復(fù)合物，使腫瘤細(xì)胞間的黏附能力下降，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。本實(shí)驗(yàn)中，與正常腸黏膜組織相比，結(jié)直腸腺癌組織中E-cadherin表達(dá)降低，vimentin及β-catenin表達(dá)增加且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在肝細(xì)胞性肝癌中，有研究發(fā)現(xiàn)[4]通過(guò)轉(zhuǎn)染NAT10-siRNA或Remodelin處理抑制NAT10活性后，腫瘤細(xì)胞成瘤能力減低，同時(shí)E-cadherin表達(dá)升高，而vimentin表達(dá)下降，表明下調(diào)NAT10表達(dá)可抑制EMT的發(fā)生發(fā)展。此外，在乳腺癌[15]中也可得到類似結(jié)論：即用Remodelin抑制劑處理NAT10后，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)升高，而vimentin表達(dá)降低。Zhang等[5]研究表明，在結(jié)直腸癌中存在胞質(zhì)、胞核、胞膜的NAT10染色與β-catenin的細(xì)胞核易位表達(dá)呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)雖然未出現(xiàn)NAT10的膜性表達(dá)，但NAT10易位表達(dá)與β-catenin異位表達(dá)間存在顯著正相關(guān)；NAT10表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度、浸潤(rùn)深度、pTNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明了結(jié)直腸癌中NAT10與EMT間存在顯著相關(guān)性，與既往研究相符。

綜上，NAT10在結(jié)直腸腺癌中存在顯著的易位改變，并與EMT間存在正相關(guān)。NAT10通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，但其中涉及的分子、通路由于相關(guān)研究較少，尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步探索。目前已存在的NAT10小分子抑制劑Remodelin對(duì)NAT10的活性具有明顯的抑制作用，已在體外肝細(xì)胞性肝癌及乳腺癌細(xì)胞株中被證實(shí)，且已應(yīng)用于臨床基礎(chǔ)研究中，有望向臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。結(jié)直腸腺癌的治療手段雖然比較廣泛，但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是預(yù)后不良的關(guān)鍵性因素和主要死因。因此，深入探究NAT10在結(jié)直腸癌中侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制在未來(lái)結(jié)直腸癌的臨床治療中具有重要意義。