循環(huán)腫瘤細胞簇與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進展

夏成茂，姬菩忠，楊瑞婷，郭益辰，劉 斌，楊艷麗

腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥相關死亡的主要原因，據(jù)統(tǒng)計每年發(fā)生轉(zhuǎn)移的實體瘤患者病死率>90%[1]。其轉(zhuǎn)移途徑主要包括：原發(fā)灶腫瘤細胞的血液內(nèi)滲、循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTC)在血液中的存活以及遠處外滲、CTC在轉(zhuǎn)移部位的沉積[2]。CTC作為一種異質(zhì)性腫瘤細胞群，在血管中主要以游離或成簇的形式存在。研究發(fā)現(xiàn)，與游離CTC相比，CTC簇具有特殊的表型、基因表達模式和更強的轉(zhuǎn)移能力，其轉(zhuǎn)移能力為游離CTC的23～50倍[3]。由于分離檢測技術水平的限制，對CTC的研究尤其是CTC簇的研究尚不清楚。該文就CTC簇的物理特性、起源、轉(zhuǎn)移機制及臨床價值進行綜述，為腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床治療提供理論參考。

1 CTC簇的物理特性及起源

CTC簇被稱為循環(huán)腫瘤微栓子、循環(huán)微轉(zhuǎn)移或循環(huán)腫瘤聚集物，最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤患者的外周血中[4]，主要由2個或2個以上的腫瘤細胞聚集而成，主要包括兩種類型：單純由癌細胞聚合形成的同質(zhì)CTC簇和與基質(zhì)或免疫細胞等相互作用而形成的異質(zhì)CTC簇[5]。

1.1 CTC簇的物理特性CTC簇通常認為由一定數(shù)量的腫瘤細胞聚合而成，其中可帶有部分非腫瘤細胞成分，如間充質(zhì)細胞、上皮細胞、周細胞、免疫細胞、血小板和癌癥相關成纖維細胞等[6-7]。因此，相比游離CTC，其更有可能滯留在肺和遠端器官的小毛細血管中，從而導致血管壁破裂形成遠處轉(zhuǎn)移[8-9]。也有研究發(fā)現(xiàn)，CTC簇與游離CTC相比，血液移動速度明顯降低，通過與E-selectin相互作用，更易發(fā)生邊緣化、旋轉(zhuǎn)和附著在血管壁內(nèi)皮細胞上[10]。目前，除了已知的球團狀CTC簇外，還觀察到其它與遷移相關的CTC簇外觀表型，其中最主要的是線性和三角形CTC簇[11]，這些特殊簇狀結(jié)構(gòu)為CTC細胞提供更利于存活的腫瘤微環(huán)境——低氧微環(huán)境[12]。在CTC簇如何進行血行轉(zhuǎn)移的研究基礎上，Au等[13]利用微流控裝置和斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)≤20個細胞的CTC簇具有高度可塑性，如在穿越毛細血管前，CTC簇內(nèi)的細胞可迅速重組成單鏈狀，大大降低流體動力阻力，穿越后這些細胞又能重新恢復簇狀形態(tài)，證明CTC簇可在生理條件下造成遠處器官轉(zhuǎn)移，且其侵襲能力遠高于游離CTC。

1.2 CTC簇的起源腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的異質(zhì)性是影響患者預后和治療反應的重要因素，主要原因是CTC的起源、轉(zhuǎn)化細胞的分化狀態(tài)、癌細胞的可塑性以及微環(huán)境相互作用[14]。CTC簇是源于主動從腫瘤部分分離并集體遷移入血管的黏聚細胞群，還是來自于原發(fā)腫瘤被動脫落進入受損血管系統(tǒng)，少見文獻報道。Aceto等[2]在研究小鼠乳腺癌模型時發(fā)現(xiàn)，通過在小鼠左、右兩側(cè)乳房脂肪墊里分別注射不同熒光標記的腫瘤細胞，5周后小鼠肺部出現(xiàn)獨立且有差異標記的腫瘤，抽取外周血并采集肺部轉(zhuǎn)移灶，發(fā)現(xiàn)外周血中只有4%的CTC簇為多色，其余均為單色。推斷這種多色的CTC簇可能來源于游離CTC罕見的血管內(nèi)聚集；同時在肺轉(zhuǎn)移灶中觀察到92%的單色腫瘤和8%的多色腫瘤，進一步驗證絕大多數(shù)CTC簇起源于原發(fā)灶，而非游離CTC的血管內(nèi)聚集。同時Maddipati等[15]也在類似的模型中支持上述研究結(jié)果。針對罕見游離CTC的血管內(nèi)聚集形成CTC簇，Hong等[16]通過設計體外血流模擬平臺，證實在物理作用下游離CTC的血管內(nèi)聚集/增殖發(fā)生率較低，而位于炎癥部位或被小血管攔截時，可少量聚集和增殖。

有研究證明，CTC簇進入血管的方式包括兩種：(1)通過滲漏的血管進入血液循環(huán)[17]；(2)在循環(huán)血細胞(如腫瘤浸潤巨噬細胞、中性粒細胞等)的引導下進入血液循環(huán)[18-21]。目前關于這方面的分子機制研究仍較少，可作為未來研究的新方向。

2 CTC簇促進血行轉(zhuǎn)移的分子機制

CTC簇離開原發(fā)腫瘤和腫瘤微環(huán)境，在血液循環(huán)中將面臨氧化應激、血流剪切力、免疫攻擊等挑戰(zhàn)[22]。其在血液循環(huán)中存活并發(fā)生血行轉(zhuǎn)移分子機制的探索將有利于指導臨床的腫瘤個性化治療。

2.1 CTC簇表達細胞間黏附蛋白細胞間黏附蛋白高表達是CTC在血液中以簇狀形式存在的決定因素，包括參與緊密連接和橋粒的蛋白，這些蛋白的高表達增加了其轉(zhuǎn)移潛能[23]。有研究表明，CTC簇中JUP基因編碼的橋粒組成蛋白的表達量為游離CTC的219倍。此外，盤狀球蛋白(plakoglobin)在細胞間黏附結(jié)構(gòu)中起到和α-連環(huán)蛋白連接的作用，維持CTC簇的穩(wěn)定和細胞極性，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌小鼠模型中，利用shRNA下調(diào)plakoglobin導致CTC簇急劇減少；此外，Chen等[24]研究結(jié)果亦表明，敲除DSG3后會破壞其與plakoglobin的結(jié)合，可抑制CTC簇的遷移和侵襲。總之，促進CTC簇形成及轉(zhuǎn)移的細胞間黏附蛋白仍有許多，包括受PDGF和TGF-β1調(diào)節(jié)的Fibronectin等都可能成為治療腫瘤轉(zhuǎn)移的靶標。

2.2 CTC簇的干細胞特性及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)癌癥干細胞(cancer stem-like cells, CSC)又稱為腫瘤起始細胞，具有自我更新、分化和轉(zhuǎn)移擴散的能力。CD44作為干細胞標志物，參與多種腫瘤干細胞信號的維持[25]。部分研究認為CTC簇內(nèi)的CSC具有干細胞特性，可引起CTC簇過表達CD44，且在乳腺癌源性異種移植模型和患者分離的CTC簇中均發(fā)現(xiàn)干細胞相關基因表達上調(diào)，這些基因編碼干細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG和SOX2[26]。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要機制之一[27]。研究表明，游離CTC與CTC簇的EMT均會導致其轉(zhuǎn)移和遷徙能力增強，CTC簇內(nèi)的EMT狀態(tài)比游離CTC更加明顯，如在非小細胞肺癌患者的CTC簇中發(fā)現(xiàn)EpCAM和CK的異質(zhì)表達[28]。從大多數(shù)轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者血液中分離出來的CTC簇具有上皮和間充質(zhì)雙表型，表明CTC簇的EMT發(fā)生是一動態(tài)過程[29]。同時，在胰腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)EMT發(fā)生相關因子ZEB1和SNAIL的表達是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的必須條件，SLUG表達可以使得原本非轉(zhuǎn)移細胞獲得轉(zhuǎn)移能力，證實EMT過程對腫瘤轉(zhuǎn)移的重要性[30]。然而，部分研究表明在游離CTC和CTC簇之間未發(fā)現(xiàn)EMT的差異表達，認為EMT對于獲得高遷移能力的游離CTC是必需的，但對于CTC簇而言并不重要[22]。因此，EMT在CTC簇形成和轉(zhuǎn)移中的作用仍有待后續(xù)進一步分析。

近年，文獻報道CTC簇中約60%的CSC表達上皮和間充質(zhì)基因，表明具有上皮/間充質(zhì)雜交表型的CSC在CTC簇的侵襲和遷移過程中發(fā)揮關鍵作用[31]。目前，關于CTC簇內(nèi)CSC與EMT表型之間的關系及其內(nèi)在機制研究仍較匱乏。

2.3 CTC簇的異質(zhì)性CTC簇內(nèi)除了含有腫瘤細胞外，還有許多非腫瘤成分也可促進CTC簇的生存和轉(zhuǎn)移[30,32-34]，如間質(zhì)細胞(成纖維細胞、內(nèi)皮細胞或腫瘤浸潤髓系細胞)的存在增加CTC簇內(nèi)腫瘤細胞的活力，并促進轉(zhuǎn)移的形成[35]。當CTC和內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后，在內(nèi)皮細胞存在的情況下，腫瘤細胞更能有效地促進血管生成，導致轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量增加和體積增大[36]。CTC簇中的血小板除了通過旁分泌信號和直接接觸保護腫瘤細胞免受血液剪切力的損傷和免疫攻擊外[37]，還通過TGF-β/Smad和NF-κB途徑誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[38]。CTC還能與免疫細胞結(jié)合，形成免疫細胞-CTC簇逃避免疫監(jiān)視，促進自身的生存和遷移。如，有文獻報道中性粒細胞表面的Mac-1或β2-整合素可與CTC上表達的細胞間黏附分子結(jié)合，幫助CTC簇跨越內(nèi)皮屏障，引發(fā)種植；與此同時，中性粒細胞還可以通過產(chǎn)生“中性粒細胞胞外陷阱”來捕獲CTC，增加CTC的遷移和增殖[39]。有研究表明，腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)和腫瘤細胞的相互作用不僅對原發(fā)腫瘤部位的進展很重要，而且對CTC的增殖和分化也很重要，CTC可以與巨噬細胞融合，形成混合細胞(即異質(zhì)CTC簇)，共享腫瘤細胞和巨噬細胞的標記，從而不受免疫系統(tǒng)監(jiān)測，具有更強的入侵潛力[18]。除上述研究外，在CTC簇中還發(fā)現(xiàn)CK+樹突狀細胞，但關于此細胞對于CTC簇存在的意義目前尚不清楚?？傊?，CTC簇復雜的組成結(jié)構(gòu)具有明顯的異質(zhì)性，未來可將研究重點放在這些細胞的相互作用上，將有助于開發(fā)新的生物學標志物，以及新的潛在治療靶點。

2.4 CTC簇介導的免疫逃逸CTC簇介導的免疫逃逸是其易形成轉(zhuǎn)移的主要原因之一，如下調(diào)MHCⅠ和(或)MHCⅠ相關蛋白表達，從而阻止NK細胞的細胞毒性和細胞溶解能力。其表面表達的PD-L1，可抑制T細胞的免疫應答效能，除PD-1/PD-L1外，還包括CTLA-4和相關B7家族成員的表達。有研究通過比較結(jié)直腸癌患者原發(fā)腫瘤和CTC的基因表達譜發(fā)現(xiàn)，CD47是CTC中唯一上調(diào)的基因，表明外周血CTC表達CD47具有生存優(yōu)勢，CTC簇通過上調(diào)CD47表達，可使其逃避巨噬細胞和樹突狀細胞的吞噬作用。同時CTC簇表面FASL的表達，可激活T細胞表面的FAS受體，誘導T細胞凋亡[39]。此外，CTC簇還能有效的適應外在環(huán)境，從而逃避免疫追殺，如CTC簇能在缺氧環(huán)境中存活，而免疫細胞在缺氧的環(huán)境下卻無法正常執(zhí)行其功能，通過缺氧-誘導免疫逃逸。離開原發(fā)部位腫瘤微環(huán)境的腫瘤細胞團更容易受到免疫介導的消滅作用，但有部分CTC簇能在血液循環(huán)中幸存并形成遠處轉(zhuǎn)移，探究這些少部分CTC簇的免疫逃逸機制，不僅有助于臨床治療，而且還可能提供耐藥性發(fā)展的重要信息，對癌癥免疫治療時代具有轉(zhuǎn)化意義。

3 CTC簇的臨床價值

CTC簇作為腫瘤轉(zhuǎn)移因素之一，在診斷、評估治療、復發(fā)和轉(zhuǎn)移進展方面具有潛在的研究價值。Aceto等[2]在多個時間點抽取79例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者(單雌激素受體陽性，單HER-2陽性，或三陰型乳腺癌)的血液樣本，分離出患者血液中的CTC簇，結(jié)果顯示在晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，CTC簇的持續(xù)存在與不良預后相關。為進一步證明CTC簇與較長病程患者不良預后之間的相關性，作者同樣用類似的方法測量了64例前列腺癌患者CTC簇與無進展生存期的關系，結(jié)果同樣顯示CTC簇與癌癥進展存在潛在相關性。

近期，Koh等[40]通過對乳腺癌游離CTC和CTC簇的全基因組DNA甲基化和RNA表達進行分析，以了解CTC簇的生物學特征，結(jié)果顯示CTC簇高表達增殖及干細胞相關基因，其低甲基化區(qū)域與乳腺癌的不良預后相關。并對2 486種FDA批準的藥物進行評估后發(fā)現(xiàn)Na+/K+-ATP酶抑制劑(如洋地黃毒苷)和微管蛋白結(jié)合劑(rigosertib、podofilox、秋水仙堿、硫酸長春新堿)能使CTC簇分離成游離CTC，并顯著降低平均CTC簇的直徑。此外，CTC簇還能在胰腺癌、肺癌和卵巢癌等[41-42]癌癥患者的血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，且該類型細胞的存在與患者的不良預后和無進展生存期相關。

4 總結(jié)與展望

在腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移過程中，CTC簇特殊的物理特性導致其遠處轉(zhuǎn)移的能力較游離CTC顯著提高，具有更強的生存能力和轉(zhuǎn)移潛能；CTC簇比游離CTC具有更高細胞間黏附蛋白及干細胞特性，同時更易發(fā)生EMT，以及參與免疫逃逸。

因此，對CTC簇促進腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制研究將有助于我們更新對腫瘤轉(zhuǎn)移的理解。但仍有問題亟待解決：(1)CTC簇的分離及檢測，目前的分離系統(tǒng)主要是針對游離CTC的分離篩選，而如何將特異性的CTC簇進行分離，并保持其原始狀態(tài)仍是有待解決的難題。(2)對于CTC簇的產(chǎn)生、循環(huán)及遠處種植的生物學行為細節(jié)仍需進一步探索。(3)CTC簇分為同質(zhì)性和異質(zhì)性，兩者之間是否具有不同的形成機制和轉(zhuǎn)移優(yōu)勢。(4)CTC簇的臨床治療意義有待進一步證實，針對CTC簇的治療可能使部分隱藏于團簇狀結(jié)構(gòu)中心的腫瘤細胞無法與抗癌藥物接觸，從而影響藥物的治療反應；同時CTC簇內(nèi)可能還包含了多種具有不同耐藥性的腫瘤細胞，使得普通化療藥物無法產(chǎn)生預期效果。后續(xù)隨著這些問題的解決將會為CTC簇的研究開辟新領域，并能進一步肯定其在臨床實踐中的價值。