抗p21Ras蛋白抗體研發(fā)及在腫瘤病理和腫瘤治療中的研究進(jìn)展

石英賢，潘鑫艷，馮 強(qiáng)，鄭慧元，楊舉倫

ras基因是1982年麻省理工學(xué)院Parada等[1]從人膀胱癌細(xì)胞中分離獲得的第一個(gè)人類癌基因。約30%的腫瘤中存在ras基因突變[2]。p21Ras蛋白是ras基因表達(dá)產(chǎn)物。ras基因突變產(chǎn)生的突變型p21Ras蛋白不易被GTP水解，使ras信號通路持續(xù)激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和惡變[3]。野生型p21Ras蛋白的過表達(dá)也可持續(xù)激活ras信號通路導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。因此，研發(fā)抗p21Ras蛋白抗體對于ras基因驅(qū)動腫瘤的診斷和治療具有重要意義。該文結(jié)合文獻(xiàn)對抗p21Ras蛋白單克隆抗體、單鏈抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、重組抗體的研發(fā)和應(yīng)用進(jìn)行簡要綜述。

1 抗p21Ras抗體的研發(fā)

1.1 抗p21Ras單克隆抗體單克隆抗體是針對抗原分子上某一特定抗原決定簇的抗體，采用雜交瘤技術(shù)制備[5]。20世紀(jì)80年代是抗p21Ras單克隆抗體研究的高峰時(shí)期。Furth等[6]以H-p21Ras為免疫原制備獲得了8株抗p21Ras單克隆抗體，這些抗體均能與磷酸化和非磷酸化的H-p21Ras蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，其中Y13-259、Y13-128、Y13-4還能與K-p21Ras蛋白結(jié)合。Hand等[7]以H-ras基因產(chǎn)物中10-17位氨基酸組成的肽段為免疫原，制備了5株抗p21Ras蛋白單克隆抗體，依次命名為RAP-1～5。1988年Yoshida等[8]將大腸桿菌表達(dá)的K-p21Ras蛋白作為免疫原制備了16株小鼠單克隆抗體，依次命名為RASK-1～16。1986年Kuzumaki等[9]使用大腸桿菌表達(dá)的H-p21Ras蛋白作為免疫原制備了4株抗p21Ras單克隆抗體，分別命名為rp-12、rp-28、rp-35、rp-38。本實(shí)驗(yàn)室于2009年成功制備了可與H-p21Ras、K-p21Ras，N-p21Ras結(jié)合的廣譜單克隆抗體KGH-R1[10]。

1.2 抗p21Ras單鏈抗體單鏈抗體由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過15～20個(gè)氨基酸的短肽連接而成[11]。單鏈抗體較好地保留單克隆抗體與抗原結(jié)合的活性，分子量只有單克隆抗體的1/6，且由于沒有單克隆抗體的Fc片段不會導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)，具有作為治療性抗體的優(yōu)勢。

抗p21Ras單鏈抗體Y238-scFv和Y259-scFv均由相應(yīng)單克隆體衍生而來，兩者與p21Ras蛋白都有較好的免疫反應(yīng)性，能結(jié)合腫瘤細(xì)胞中的p21Ras蛋白[12]。Lener等[13]利用噬菌體展示技術(shù)從兩個(gè)不同抗體片段文庫中篩選出5個(gè)不同序列的p21Ras單鏈抗體，這些單鏈抗體經(jīng)親和層析純化后與p21Ras蛋白有較好的親和力，能有效地抑制野生型或突變型ras的功能。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)獲得了抗p21Ras蛋白的單鏈抗體，命名為KGH-R1 scFv[14]。酶聯(lián)免疫吸附法、免疫組化、印跡雜交、免疫熒光、同源模建和分子對接研究顯示，KGH-R1 scFv與野生型和突變型的H-p21Ras、K-p21Ras、N-p21Ras產(chǎn)生較好的免疫結(jié)合[15]。

1.3 抗p21Ras細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞內(nèi)抗體是一種攜帶抗體基因的表達(dá)載體，進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞中將所攜帶的抗體基因表達(dá)為抗體。常用的基因表達(dá)載體有表達(dá)質(zhì)粒和腺病毒。Cochet等[12]將Y259-scFv基因插入Ad5型腺病毒載體中，獲得了細(xì)胞內(nèi)抗體Ad-Y259-scFv。2016年本實(shí)驗(yàn)室將KGH-R1 scFv的基因克隆到復(fù)制缺陷型Ad5型腺病毒載體中，獲得細(xì)胞內(nèi)抗體KGHV100(或重組腺病毒KGHV100)，可以感染具有柯薩奇受體的細(xì)胞并在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)KGH-R1 scFv[16]。

1.4 抗p21Ras重組抗體重組抗體也稱為基因工程抗體，是通過DNA重組技術(shù)將抗體基因序列進(jìn)行改造和重組，構(gòu)建于表達(dá)質(zhì)粒上，再通過蛋白外源表達(dá)技術(shù)將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得。本實(shí)驗(yàn)室將上述KGH-R1 scFv基因與腫瘤穿膜肽基因連接，克隆到表達(dá)質(zhì)粒上，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，獲得三種抗p21Ras重組抗體，分別名為RGD-KGH-R1 scFv、ACPP-KGH-R1 scFv、BR2-KGH-R1 scFv。其中RGD-KGH-R1 scFv可穿入表面有整合素的腫瘤細(xì)胞[17]，ACPP-KGH-R1 scFv可穿入表面有基質(zhì)金屬蛋白酶2的腫瘤細(xì)胞[18]，BR2-KGH-R1 scFv可穿入表面有神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤細(xì)胞[19]。2017年Shin等采[20]用同樣方法將RGD10細(xì)胞穿膜肽與抗p21Ras單克隆抗體基因RT11-i連接，在大腸桿菌中獲得重組抗體，該抗體可通過結(jié)合整合素avb3或avb5進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)仍具有與p21Ras-GTP結(jié)合的特異性。

2 抗p21Ras抗體的應(yīng)用

2.1 在腫瘤病理中的應(yīng)用抗p21Ras抗體主要用于研究ras基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。Hand等[7]使用RAP-1～5單克隆抗體作為一抗，應(yīng)用免疫組化在人類結(jié)腸癌和乳腺癌組織中檢測到p21Ras蛋白，而在纖維腺瘤和纖維囊性疾病、正常乳腺和結(jié)腸上皮組織中未檢測到p21Ras蛋白。Yoshida等[8]應(yīng)用RASK-3單克隆抗體、通過免疫組化檢測101例胃癌、53例非癌胃組織中p21Ras的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于高分化胃癌、腸化生和不典型增生胃組織中。Kuzumaki等[9]利用rp-12單克隆抗體、通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)：p21Ras蛋白在人黑色素瘤中高表達(dá)，在普通痣中無表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用KGH-R1單克隆抗體分析p21Ras在結(jié)直腸良惡性病變[21]、乳腺良惡性病變[22]、胃黏膜良惡性病變[23]、甲狀腺良惡性病變[24]、肺良惡性病變[25]及肝臟良惡性病變中的表達(dá)[26]，結(jié)果顯示p21Ras在癌組織中高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，提示ras基因在這些腫瘤的發(fā)生中起重要作用。上述抗體不僅可用于評價(jià)良、惡性病變組織中p21Ras表達(dá)的差異，還為研究ras基因在細(xì)胞生長調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)化中的作用提供重要的工具。目前商品化的抗p21Ras抗體有K-p21Ras多克隆抗體RAB(邁新公司)、單克隆抗體c-4(Santa Cruz公司)、重組抗體EP1125Y(Abcam公司)等。

2.2 在腫瘤治療中的應(yīng)用目前，治療性抗p21Ras抗體仍處于研發(fā)階段，尚無靶向p21Ras的抗體藥物上市。細(xì)胞內(nèi)抗體KGHV100是基于復(fù)制缺陷型腺病毒構(gòu)建，能夠攜帶抗體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，但不能持續(xù)表達(dá)。為此，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了攜帶KGH-R1 scFv基因的腫瘤特異性增殖腺病毒KGHV300[27]和KGHV500[28-29]。KGHV300可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制增殖，而在正常細(xì)胞中不復(fù)制，延長了基因表達(dá)時(shí)限，提高了治療效果。KGHV500可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并持續(xù)表達(dá)KGH-R1 scFv基因，研究顯示它能在體內(nèi)、外抑制結(jié)直腸癌[30]、胃癌[31]、非小細(xì)胞肺癌[32]、腦膠質(zhì)瘤[33]、肝癌[34]的增殖和生長。用CIK細(xì)胞作為二級載體，可以通過血液途徑將KGHV500運(yùn)送到腫瘤部位，為體內(nèi)臟器腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療提供了可能性。連接細(xì)胞穿膜肽抗p21Ras的重組抗體RGD-KGH-R1 scFv、ACPP-KGH-R1 scFv、BR2-KGH-R1 scFv，在肺癌、結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤的研究中顯示了較好的抗腫瘤活性[17-19]。

3 結(jié)語

ras基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[35]。目前，針對p21Ras蛋白的小分子化合物抑制劑AMG 510已經(jīng)上市，MRTX 849已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，抗體藥物仍處于研發(fā)階段[36-38]?？筽21Ras單克隆抗體能夠用于檢測正常組織和腫瘤組織中p21Ras的表達(dá)以輔助病理診斷。腺病毒攜帶抗p21Ras抗體基因進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗p21Ras抗體。然而，腺病毒的制備及保存較為困難，且不利于規(guī)模化生產(chǎn)。與細(xì)胞穿膜肽融合表達(dá)的重組抗體有望成為治療ras基因驅(qū)動腫瘤的抗體藥物，其開發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)將給ras相關(guān)腫瘤患者帶來福音。