胰腺導(dǎo)管腺癌中PDIA6和PD-L1的表達及其臨床病理學(xué)意義

金汝佳，王 豐，李晨飛，馬怡暉

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是全球病死率較高的惡性腫瘤，其起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為晚期。預(yù)計到2030年，PDAC將超過乳腺癌和結(jié)直腸癌，成為僅次于肺癌的第二大癌癥死亡原因[1]。PDIA6又稱P5或ERP5，是蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)家族的一員，其結(jié)構(gòu)與PDI家族其它成員相似，含有硫氧還蛋白樣結(jié)構(gòu)域[2]。作者利用生物信息學(xué)方法通過GEPIA數(shù)據(jù)庫進行PDIA6單基因分析發(fā)現(xiàn)，PDIA6在胰腺癌中的表達高于癌旁正常組織，并與胰腺癌預(yù)后不良有關(guān)，提示PDIA6可作為促癌基因參與腫瘤的惡性進展。目前，關(guān)于PDAC中PDIA6的研究報道較少。PD-L1又稱B7-H1，是B7家族中的 Ⅰ 型跨膜糖蛋白，通過與PD-1受體結(jié)合，在維持免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。有研究表明，PD-L1在胃癌[4]、三陰型乳腺癌[5]和食管癌[6]中過表達與不良臨床預(yù)后相關(guān)。然而，PD-L1表達與PDAC臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系尚存在爭議。本文采用免疫組化SP法檢測PDIA6和PD-L1在PDAC中的表達，探討兩者表達與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的相關(guān)性，以期為PDAC發(fā)生、發(fā)展的分子病理機制研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年1月～2019年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的PDAC標(biāo)本79例，患者均有完整的臨床病理資料，術(shù)前均未進行放、化療。

1.2 臨床病理學(xué)特征收集患者臨床病理資料包括性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期，鏡下觀察腫瘤分化程度、腫瘤出芽、間質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。參照結(jié)直腸癌國際腫瘤出芽共識會議(the International Tumor Budding Consensus Conference, TBCC)的建議評估腫瘤出芽[7]，在20倍物鏡下評估熱點區(qū)腫瘤出芽數(shù)目，將出芽數(shù)目<10個定義為低級別組，≥10個定義為高級別組[8]。癌巢周圍間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞散在和少量分布分別定義為低度和中度TIL，高度TIL定義為癌巢周圍間質(zhì)內(nèi)存在大量淋巴細胞或淋巴細胞浸潤至癌巢內(nèi)。將患者分為間質(zhì)TIL陰性組(無～低度TIL)和間質(zhì)TIL陽性組(中～高度TIL)[9]。按照第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)PDAC分期標(biāo)準(zhǔn)進行病理TNM分期。

1.3 免疫組化檢測及結(jié)果判讀采用免疫組化SP法進行染色，具體操作步驟嚴(yán)格參考試劑盒說明書進行，所有切片均由兩位高年資的病理醫(yī)師在雙盲條件下進行判讀?？贵wPDIA6(A7055，稀釋比1∶100)與PD-L1(A1645，稀釋比1∶100)均購自Abclonal公司。PDIA6主要表達于腫瘤細胞質(zhì)，陽性定義為棕黃色或棕褐色顆粒。PD-L1主要表達于腫瘤細胞膜或胞質(zhì)，也可表達于間質(zhì)免疫細胞。結(jié)果采用半定量法進行評分[10]：(1)按細胞著色程度進行評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比評分：陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：>3分為陽性，≤3分為陰性。

1.4 隨訪采用電話形式進行隨訪，起始時間為患者確診之日，截至?xí)r間為2020年12月30日，記錄患者的總生存期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，PDIA6和PD-L1表達與各臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗。Kaplan-Meier法進行生存分析，Cox比例風(fēng)險模型進行多因素分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征79例PDAC中男性47例，女性32例，男女比為1.5∶1；年齡30～75歲，平均57.9歲，中位年齡59歲。腫瘤位于胰頭50例，胰體尾29例。腫瘤最大徑0.8～10 cm，平均4.1 cm。31例可見脈管內(nèi)癌栓，69例可見神經(jīng)侵犯。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為39.2%。中～高度TIL者32例(圖1)，無～低度TIL者47例(圖2)。腫瘤出芽分級：高級別41例(圖3)，低級別38例(圖4)。臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期59例，Ⅲ+Ⅳ期20例。

圖1 間質(zhì)TIL，中～高度浸潤 圖2 間質(zhì)TIL，無～低度浸潤 圖3 腫瘤出芽，高級別 圖4 腫瘤出芽，低級別 圖5 A.PDIA6在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈陽性，SP法；B.PDIA6在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈陰性，SP法；C.PD-L1在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈陽性，SP法；D.PD-L1在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈陰性，SP法

2.2 PDAC及癌旁正常組織中PDIA6和PD-L1的表達PDIA6主要表達于腫瘤細胞胞質(zhì)，呈均勻一致的棕黃色或棕褐色顆粒(圖5A、B)。PD-L1主要表達于腫瘤細胞膜或胞質(zhì)，也可表達于間質(zhì)免疫細胞，呈淡黃色至棕褐色(圖5C、D)。PDAC中PDIA6陽性45例(57.0%)，癌旁正常胰腺導(dǎo)管中19例陽性(24.1%)；PDAC癌組織中PD-L1陽性6例(7.6%)，而在癌旁正常胰腺導(dǎo)管中均陰性。PDIA6和PD-L1在PDAC癌組織中的表達均高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌組織和癌旁正常組織中PDIA6和PD-L1的表達

2.3 PDIA6和PD-L1表達與PDAC臨床病理特征的關(guān)系PDIA6表達與PDAC腫瘤出芽有關(guān)(P=0.035)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、間質(zhì)TIL、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。PD-L1表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、腫瘤出芽、間質(zhì)TIL、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 PDIA6和PD-L1表達與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 PDIA6和PD-L1表達與PDAC患者預(yù)后的相關(guān)性Kaplan-Meier生存分析顯示，PDIA6(P=0.009，圖6)和PD-L1(P=0.040，圖7)陽性患者的總生存期較陰性患者短。此外，腫瘤出芽(P=0.016)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)以及神經(jīng)侵犯(P=0.012)均與患者較短的總生存期有關(guān)。Cox多因素生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PDIA6表達、PD-L1表達、腫瘤出芽和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響PDAC患者總生存期的獨立危險因素(表3)。

圖6 PDIA6表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者總生存期的關(guān)系

表3 Cox多因素回歸分析胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后的影響因素

圖7 PD-L1表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者總生存期的關(guān)系

3 討論

PDAC屬于高度侵襲性的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，預(yù)后差，5年生存率不足10%[11]。PDAC的治療以手術(shù)和放、化療為主，但整體療效欠佳，仍需尋找有效的治療方法。深入研究PDAC惡性進展的分子機制，尋求新的有效治療靶點，對于提高PDAC的預(yù)后具有重要的臨床意義。

PDIA6是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的成員之一，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，作為氧化還原酶催化二硫鍵形成，并作為分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)折疊并抑制未折疊底物的聚集。最新研究結(jié)果顯示，PDIA6在乳腺浸潤性癌組織中的表達高于正常乳腺組織，可作為侵襲性標(biāo)志物[12]。Bai等[13]使用TCGA數(shù)據(jù)庫、Western blot法和免疫組化法檢測非小細胞肺癌中PDIA6的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，癌組織中PDIA6表達上調(diào)，且PDIA6高表達與不良預(yù)后相關(guān)。在胃癌組織和胃癌細胞系中PDIA6表達升高，且下調(diào)PDIA6表達在體內(nèi)外均可抑制胃癌細胞增殖[14]。另外，Gao等[15]報道PDIA6過表達可增加子宮頸癌細胞系的增殖能力并加速細胞周期進程。本組免疫組化結(jié)果顯示，PDIA6在PDAC中表達明顯高于癌旁正常組織，表明PDIA6在PDAC組織中的表達高于正常胰腺導(dǎo)管組織，首次提示PDIA6可能參與PDAC的發(fā)生、發(fā)展。

在預(yù)后方面，PDIA6高表達非小細胞肺癌患者的總生存期顯著低于PDIA6低表達者，多變量分析表明PDIA6是非小細胞肺癌患者總生存期的獨立預(yù)測因子[13]。在乳腺浸潤性癌中，PDIA6表達與腫瘤的惡性進展相關(guān)，提示其與不良預(yù)后有關(guān)[12]。本實驗對PDIA6表達與PDAC患者總生存期進行分析顯示，PDIA6陽性組患者的預(yù)后明顯低于PDIA6陰性組，即PDIA6過表達提示患者預(yù)后不良。該結(jié)果與既往研究報道的PDIA6與多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)較一致，也首次提示PDIA6在評判PDAC患者預(yù)后中的臨床意義。

本組79例PDAC中PD-L1的表達明顯高于癌旁正常組織，但并未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達與臨床病理特征有相關(guān)性。進一步分析PD-L1與PDAC患者總生存期的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，PD-L1陽性組患者的預(yù)后差于PD-L1陰性組，提示PD-L1表達可作為影響PDAC預(yù)后的危險因素，該結(jié)果與多數(shù)研究報道的PDAC癌組織PD-L1表達與不良預(yù)后有關(guān)較一致[16]。文獻報道，PD-L1在PDAC中的陽性率為19.0%～62.5%[17]。Liang等[18]分析373例PDAC中PD-L1的表達發(fā)現(xiàn)，按照腫瘤細胞陽性比例以25%為分界值，12例PD-L1陽性，陽性率為3.2%；以10%和5%為分界值，PD-L1陽性例數(shù)分別為22例和33例，陽性率分別為5.9%和8.8%。Tessier-Cloutier等[19]利用半定量法，結(jié)合染色強度和腫瘤細胞染色百分比，采用3個分界值(≥1%、>5%和>10%)對252例PDAC患者進行PD-L1免疫表型評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有31、17、12例為陽性，陽性率分別為12%、7%和5%。結(jié)合上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-L1檢測陽性率存在較大差異，分析原因可能有：(1)不同研究中使用的抗體型號不同；(2)在不同研究中采用PD-L1陽性臨界值不同；(3)各個研究采用的PD-L1判讀標(biāo)準(zhǔn)不同；(4)PD-L1在PDAC中的表達可能存在異質(zhì)性。因此，關(guān)于PD-L1在PDAC中的臨床應(yīng)用尚需要更多的實驗探索。

Wnt/β-catenin信號通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。Ram等[20]對226例PDAC和65例正常胰腺組織的基因芯片分析表明，Wnt/β-catenin信號通路在PDAC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。胃癌組織中PDIA6上調(diào)可促進癌細胞Wnt3a和β-catenin的蛋白表達，提示PDIA6參與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路[21]。PDIA6還可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路，其過表達能夠抑制β-catenin磷酸化，進而泛素化降解β-catenin，最終導(dǎo)致HeLa細胞增殖。另一方面，Wnt誘導(dǎo)的β-catenin活化可以促進c-Myc的表達，從而激發(fā)PD-L1轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致PD-L1表達上調(diào)，因此PD-L1表達增加可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[22]。Sharma等[23]報道在小鼠模型中缺乏β-catenin的腫瘤細胞對免疫檢查點抑制劑治療有效，而β-catenin陽性的腫瘤細胞則無效。提示PDIA6和PD-L1之間可能存在某些關(guān)聯(lián)，兩者在PDAC中的作用機制及相關(guān)性有待進一步分析。

綜上，PDAC中PDIA6和PD-L1表達均顯著高于癌旁正常組織，PDIA6和PD-L1表達是影響PDAC患者預(yù)后的危險因素，PDIA6和PD-L1可作為PDAC患者預(yù)后不良的預(yù)測指標(biāo)。