骨折愈合期血液中硒蛋白P的表達(dá)及意義研究

高發(fā)鵬 付波 于洪濤 田銳 楊佳霖 黃志

骨折是目前常見(jiàn)的骨科疾病之一，同時(shí)也是目前已知愈合時(shí)間較長(zhǎng)的疾病之一[1]。但就目前已知的和臨床常用的促進(jìn)骨折愈合的藥物存在著諸多問(wèn)題[2]。目前約有2.5%～4.0%的患者出現(xiàn)骨折不愈合情況[3]。對(duì)于這種情況目前臨床常見(jiàn)的處理方式是進(jìn)行二次手術(shù)，或者是使用促進(jìn)骨折愈合的藥物，但療效仍存在諸多不穩(wěn)定的情況[4]。所以就目前的情況臨床上急需一種可以促進(jìn)骨折愈合，同時(shí)可以降低骨折不愈合發(fā)生的藥物。而硒蛋白P（selenoprotein P，SepP）作為目前已知的較為特殊的一種蛋白質(zhì)，在抗炎、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤方面具有很重要的作用。但是由于其實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方式不同，導(dǎo)致其在人體中含量測(cè)度存在差異[5]。有研究表明其通過(guò)氧化應(yīng)激的方式可以促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合，為本研究提供思路[6]。所以研究依據(jù)此為思考點(diǎn)，探究硒蛋白P與骨折愈合的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所選取的時(shí)間段為2019年5月—2021年10月，研究以10周齡，7只雄性大鼠體重300～400 g [SYXK（黑）2016-014] 的SD大鼠（sprague dawley，SD）大鼠外周血作為實(shí)驗(yàn)樣本，通過(guò)蛋白免疫印跡（westorn blot，WB）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR）的試驗(yàn)方法分別對(duì)大鼠愈合階段逐步分析硒蛋白P與骨折愈合的關(guān)系。動(dòng)物飼養(yǎng)按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》第8版進(jìn)行飼養(yǎng)，14只SD大鼠10周齡，7只雄性大鼠體質(zhì)量300～400 g，平均（354.41±2.45）g，7只雌性大鼠180～270 g，平均（254.41±1.98）g，處死大鼠，分離血清和組織以供進(jìn)一步分析。

1.2 方法

RT-PCR收集各組分大鼠的血液樣本。分別提取大鼠的用Trizol試劑提取血液核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）樣本。在無(wú)周圍組織的情況下制備骨骼，并在液氮下使用Mikro二膜機(jī)（B.Braun，Melsungen，德國(guó)）在teflon膠囊中用鋼球研磨成粉末。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TRIzol?試劑（德國(guó)Erlangen PEQLAB）從脛骨和股骨粉末中提取總RNA。RNA樣本于-80℃下保存。反轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫(kù)于-20℃下保存，將cDNA通過(guò)PCR反應(yīng)檢驗(yàn)基因表達(dá)情況，引物詳見(jiàn)表1。

表1

1.3 Western Blot檢測(cè)蛋白變化

將樣本取1 μL蛋白樣本與4× Loading buffer，100℃煮樣5 min，晾干后于-20℃分裝凍存。取10 μL蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。分離膠采用10%，濃縮膠采用5%。初始電壓80 V，45 min，調(diào)整電壓至120 V，45 min，停止電泳。拆除電泳裝置，除去濃縮膠部分，切留含目的蛋白的分離膠部分。將濾紙等物品浸泡于轉(zhuǎn)膜液中，將PVDF膜剪去右上角，于甲醛溶液中浸泡激活1 min后放入轉(zhuǎn)膜液備用。合并裝置并按照正負(fù)極正確安裝裝置，連接電源100 V電轉(zhuǎn)100 min。在4℃條件下與一抗（1：1 000）孵育。室溫條件下將PVDF膜與二抗（1：5 000）孵育1 h。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò)單向方差分析和費(fèi)羅尼校正（bonferroni correction，Bonferroni校正）多重比較試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估 。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硒蛋白P受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8重組蛋白（recombinant low density lipoprotein receptor related protein 8，Lrp8）在缺硒骨中的誘導(dǎo)情況

SepP及其受體Lrp8在骨骼中表達(dá)。分離、勻漿、SDSPAGE分級(jí)和Western Blot分析具有所示基因型的大鼠股骨。由于硒蛋白轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較多，所有硒代謝和硒蛋白生物合成的必要因素也在骨骼中表達(dá)。在已建立的SepP受體中，可檢測(cè)到Lrp8，缺失Lrp2；Lrp8在SepP/大鼠中強(qiáng)烈上調(diào)。對(duì)于第三個(gè)受試Lrp家族成員，即Lrp1，也遵守了類似的規(guī)定。Lrp1是否也有助于SepP的攝取目前還存在爭(zhēng)議。由于已建立SepP和Lrp8以形成組織特異性Seuptake的中央轉(zhuǎn)運(yùn)體-受體對(duì)36，其蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)Western Blot分析進(jìn)行評(píng)估。SepP在SepP+/+和SepP+/大鼠的股骨中可檢測(cè)到，其條帶遷移速度約為47、45和42 kDa。正如預(yù)期的那樣，SepP的表達(dá)在SepP/大鼠中無(wú)法檢測(cè)到（圖3A）。Lrp8在所有3種SepP基因型的骨骼中檢測(cè)到，其異構(gòu)體在4 130和4 180 kDa遷移（圖3B）。Lrp8在骨骼中的表達(dá)強(qiáng)度幾乎與作為陽(yáng)性對(duì)照組織的睪丸中的表達(dá)強(qiáng)度相似。因此，16塊骨骼為SepP介導(dǎo)的接受器提供了良好的裝備。在組織化學(xué)分析中，SepP可以檢測(cè)到，尤其是在礦化骨中，而軟骨是陰性的（圖3C和D）。具體見(jiàn)圖1所示。

圖1 SepP受體Lrp8在缺硒骨中的誘導(dǎo)情況

2.2 骨骼血液中硒蛋白P（SepP）硒的運(yùn)輸情況

SepP作為骨骼硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，（1）-/-組大鼠硒相對(duì)濃度的百分比為（7.33±2.66）%，-/-tg大鼠硒相對(duì)濃度的百分比為（14.59±3.41）%，血清硒在SepP中僅輕微增加-/-tg與SepP的比較-/-大鼠P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（2）-/-大鼠股骨硒相對(duì)濃度的百分比為（44.55±4.23）%，-/-tg大鼠股骨硒相對(duì)濃度的百分比為（74.81±7.48）%，-/-大鼠脛骨硒相對(duì)濃度的百分比為（60.81±5.21）%，-/-tg大鼠脛骨硒相對(duì)濃度的百分比為（75.45±7.32）%。-/-大鼠股骨組與-/-tg大鼠股骨組對(duì)比P＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。-/-大鼠脛骨組與-/-tg大鼠脛骨組對(duì)比P＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SepP中股骨（陰影條）和脛骨（開(kāi)放條）中的硒濃度顯著增加-/-tg大鼠與SepP大鼠的比較-/- 大鼠在肝細(xì)胞中表達(dá)SepP。并通過(guò)單向方差分析和Bonferroni校正多重比較試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估；（3）在正常情況下，膳食硒被肝細(xì)胞吸收，有效地插入SepP并運(yùn)輸?shù)絻?yōu)先供應(yīng)的靶組織，包括骨骼。嚴(yán)重的硒缺乏或慢性肝病導(dǎo)致SepP缺乏和骨骼中的硒缺乏，導(dǎo)致某些硒蛋白的表達(dá)減少，以及作為骨骼SepP受體的Lrp8代償性上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)將SepP添加到骨健康的重要肝源性因素列表中，并作為肝性骨營(yíng)養(yǎng)不良的潛在補(bǔ)充靶點(diǎn)。具體見(jiàn)圖2所示。

圖2 骨骼血液中硒蛋白P（SepP）硒的運(yùn)輸情況

3 討論

必需微量元素硒（Se）在人類健康中起著重要作用。低硒狀態(tài)與癌癥等高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類研究中均有報(bào)道[7]。死亡率已被證明與危重病和腎癌的血硒濃度呈負(fù)相關(guān)，這突出了硒作為一種基本元素的突出重要性微量營(yíng)養(yǎng)素[8-10]。然而，由于硒取決于膳食硒，因此全世界人口的硒狀況差異很大，而膳食硒又受到農(nóng)業(yè)食品生產(chǎn)所用土壤的決定性控制。全球膳食硒攝入量范圍為每天7～220 μg硒，歐洲大部分地區(qū)，亞洲和非洲必須被視為自然資源硒供應(yīng)不足的地區(qū)[11-13]。此外，飲食偏好、個(gè)人基因型和一般健康狀況是硒代謝和狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)因素。攝入減少后，血清、肝臟、腎臟和其他組織中的硒濃度下降。值得注意的是，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌器官在很大程度上對(duì)有限的硒供應(yīng)具有抵抗力。即使在嚴(yán)重缺硒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校@些器官仍保持其特有的硒狀態(tài)。在組織水平和不同的硒蛋白方面都觀察到了這種硒狀態(tài)的等級(jí)依賴性，確保即使在嚴(yán)重缺硒的情況下，最基本的硒依賴過(guò)程仍能在特權(quán)組織中維持[14-17]。本研究提出骨折愈合期血液中硒蛋白P的表達(dá)及意義的實(shí)驗(yàn)分析，以此來(lái)進(jìn)一步明確硒蛋白P與骨折愈合期血液之間的表達(dá)及意義，為臨床疾病的治療提供一些參考。

研究顯示，骨折愈合期血液中，SepP受體Lrp8在缺硒骨中被誘導(dǎo)，由于硒蛋白轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較多，所有硒代謝和硒蛋白生物合成的必要因素也在骨骼中表達(dá)。在已建立的SepP受體中，Lrp8可檢測(cè)到，Lrp2缺失；Lrp8在SepP中強(qiáng)烈上調(diào)-/- 大鼠。對(duì)于第三個(gè)受試Lrp家族成員，即Lrp1，也觀察到類似的規(guī)定。Lrp1是否也有助于SepP的攝取目前仍存在爭(zhēng)議。由于已建立SepP和Lrp8以形成組織特異性硒攝取的中央轉(zhuǎn)運(yùn)體-受體對(duì)，通過(guò)Western Blot分析評(píng)估其蛋白質(zhì)表達(dá)（圖1）。SepP可在SepP+/+和SepP的股骨中檢測(cè)到+/- 在大約47、45和42 kDa遷移帶的大鼠。正如預(yù)期的那樣，SepP在SepP中的表達(dá)是不可檢測(cè)的-/- 大鼠（圖1A）。Lrp8在所有三種SepP基因型的骨骼中都檢測(cè)到，其異構(gòu)體在＞130和＞180 kDa遷移（圖1B）。Lrp8在骨骼中的表達(dá)強(qiáng)度幾乎與作為陽(yáng)性對(duì)照組織的睪丸中的表達(dá)強(qiáng)度相似。因此，骨骼為SepP介導(dǎo)的硒攝取做好了充分準(zhǔn)備。接下來(lái)測(cè)試了骨骼血液中是否能夠通過(guò)使用循環(huán)SepP有效地增加其硒狀態(tài)，即SepP是否將硒從肝臟血液運(yùn)輸?shù)焦趋?。為此，SepP-/-對(duì)僅在肝細(xì)胞中表達(dá)人SepP轉(zhuǎn)基因的大鼠進(jìn)行分析。血清中的硒濃度僅受到轉(zhuǎn)基因的輕微影響（圖2A）。相比之下，SepP的股骨和脛骨中的硒濃度-/-與SepP相比，轉(zhuǎn)基因可有效提高tg-/- 大鼠（圖2B）。值得注意的是，SepP中的骨硒濃度-/-tg大鼠幾乎達(dá)到雜合子SepP水平+/- 大鼠，盡管轉(zhuǎn)基因?qū)ρ逦呢暙I(xiàn)很小。這一發(fā)現(xiàn)表明，通過(guò)肝源性SepP可以有效地將硒轉(zhuǎn)運(yùn)到骨骼中（圖2C）。

硒主要以硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）的形式發(fā)揮作用，Sec是第21種蛋白質(zhì)生成氨基酸。Sec依賴性硒蛋白分別由一組25個(gè)人類和24個(gè)大鼠基因編碼。10硒蛋白的生物合成需要在硒蛋白轉(zhuǎn)錄本的開(kāi)放閱讀框內(nèi)重新編碼UGA終止密碼子。Sec與生長(zhǎng)中硒蛋白的共翻譯摻入取決于一組Sec特異性反式和順式作用因子的相互作用，包括Sec負(fù)載的tRNA[Ser]Sec，硒蛋白轉(zhuǎn)錄本中的Sec插入序列（selenocysteine insertion sequenceelement，SECIS）元 件，該元件由限速RNA結(jié)合因子SECIS結(jié)合蛋白-2（SECIS binding protein 2，SBP2）識(shí)別11此外，已經(jīng)描述了參與細(xì)胞內(nèi)硒代謝的兩種硒結(jié)合蛋白，即56 kDa硒結(jié)合蛋白-1（recombinant selenium binding protein 1，SELENBP-1）和14 kDa脂肪酸結(jié)合蛋白-1（human liver fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP-1）。在細(xì)胞內(nèi)，硒被釋放并還原為硒化物，然后被依賴于硒的磷酸硒合成酶-2（abstract selenophosphate synthetase 2，SEPHS2）磷酸化。同時(shí)，磷酸化的絲氨酸t(yī)RNA激酶（pro-teinserine / threoninekinase，PSTK）使絲氨酸負(fù)載的tRNA[Ser]Sec磷酸化。這兩種富含能量的底物結(jié)合到Sec負(fù)載的tRNA[Ser]Sec是由P-Ser-tRNA:SectRNA催化的。Sec特異延伸因子EFsec和核仁蛋白（NCL）最終與其他翻譯因子一起促成Sec的共翻譯插入。

在哺乳動(dòng)物硒蛋白中，硒蛋白P是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼣y帶每個(gè)蛋白質(zhì)的多個(gè)Sec殘基，并構(gòu)成血液中硒的大部分。硒蛋白P決定性地有助于大腦和睪丸的分級(jí)硒供應(yīng)。脂蛋白受體相關(guān)蛋白（lipoprotein receptor associated protein，LRP）的兩個(gè)受體已確定該家族為硒蛋白P受體，即Lrp2和Lrp8。血清硒和硒蛋白P濃度在廣泛的營(yíng)養(yǎng)硒攝入范圍內(nèi)相關(guān)。一旦硒供應(yīng)充足，硒蛋白P生物合成即達(dá)到飽和，從而獨(dú)立于進(jìn)一步的硒攝入。觀察到硒蛋白P最大表達(dá)的閾值用于確定硒的最佳營(yíng)養(yǎng)攝入范圍。在具有改良硒蛋白P表達(dá)的大鼠模型中分析了硒蛋白P的生理作用。純合子硒蛋白P敲除（硒蛋白P-/-）大鼠表現(xiàn)出具有組織特異性硒缺乏、生長(zhǎng)率降低、共濟(jì)失調(diào)和男性特異性不育的硒依賴表型。Lrp8基因敲除大鼠復(fù)制了神經(jīng)表型，突出了大腦硒穩(wěn)態(tài)對(duì)硒蛋白P和Lrp8的相互依賴性。硒對(duì)骨骼的核心重要性正日益被認(rèn)識(shí)。在低膳食硒攝入下，嚙齒類動(dòng)物的骨骼表型以發(fā)育不良的皮質(zhì)和小梁礦化為特征。在人類中，硒缺乏與大骨節(jié)病相關(guān)，一種地方性退行性骨關(guān)節(jié)炎，可通過(guò)補(bǔ)充硒預(yù)防?；加蠸BP2遺傳缺陷的受試者表現(xiàn)出硒蛋白表達(dá)減少，血液中甲狀腺激素模式紊亂，骨發(fā)育持續(xù)顯著延遲，身材相對(duì)矮小。最近，筆者報(bào)告血清硒蛋白P濃度與骨轉(zhuǎn)換和骨密度的標(biāo)志物相關(guān)。在研究中，評(píng)估了硒蛋白P對(duì)骨硒代謝的重要性。

研究結(jié)果表明，骨動(dòng)態(tài)表達(dá)硒蛋白P受體Lrp8，并依賴肝源性硒蛋白P有效攝取硒，因此代表了優(yōu)先供應(yīng)的靶器官在組織特異性硒供應(yīng)層次中居高不下，類似于大腦和經(jīng)典內(nèi)分泌器官?，F(xiàn)有研究分析來(lái)看，這種代謝特權(quán)是完全有道理的，因?yàn)楣趋琅c大腦和內(nèi)分泌器官對(duì)生長(zhǎng)和生存同樣重要。到目前為止，這種對(duì)低細(xì)胞內(nèi)硒水平的代謝反應(yīng)是骨骼所特有的。SepP攝取和細(xì)胞內(nèi)硒代謝的這種動(dòng)態(tài)適應(yīng)是否代表了硒缺乏時(shí)SepP靶組織的更一般機(jī)制，有助于腦和內(nèi)分泌器官等重要組織的分級(jí)供應(yīng)，并在硒缺乏時(shí)保護(hù)重要的硒依賴過(guò)程，還有待觀察。