基于多元統計分析的山銀花抗氧化與抑菌質量標志物預測

王志輝，周新茹，成惠珍，王 智，童巧珍，周日寶，3*，劉湘丹，3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湘產大宗道地藥材種質資源及規(guī)范化種植重點研究室，湖南 長沙 410208；3.湖南省普通高等學校中藥現代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208）

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera confusa DC.）、黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花[1]。 山銀花具有清熱解毒、疏散風熱的功效，含有有機酸、黃酮類和皂苷類等多種化學成分，現代藥理研究表明其具有抗氧化、抑菌、保肝和抗炎等多種生理活性[2]，其中抗氧化和抑菌是山銀花的主要現代藥理作用，用于治療癰腫瘡毒、熱毒血痢、風熱感冒等癥，是銀翹解毒片、銀花口服液、維C 銀翹片等多種中成藥的主要原料[3-6]。近年來，山銀花還廣泛應用于食品、飲料、保健品、化妝品和獸藥等方面，市場前景廣闊。灰氈毛忍冬于2010 版《中華人民共和國藥典》首次收藏在山銀花項下[7]，是湖南省山銀花藥材種植的主要品種，湖南山銀花年產量已達1.5 萬噸，占全國山銀花總產量的75%。但目前對山銀花的研究大多集中在藥效成分和藥理作用方面，缺乏針對其多靶點藥效作用的質量控制標準[8-10]，這在很大程度上制約了湖南省山銀花產業(yè)的發(fā)展。

2009 年，肖小河研究員在中國藥學會學術年會提出了中藥“大質量觀”概念，強調生物評價在中藥質量評價方面的重要性[11]。 2016 年，劉昌孝院士提出中藥質量標志物的新概念，針對中藥的生物屬性、制造過程等自身醫(yī)藥體系的特點，中藥材質量標準應以體現藥效的物質成分為基礎，從而更科學地反映藥材內在質量的差別[12]。因此，藥效評價將成為更科學、更前沿的中藥材質量評價方法[13]。

高效液相指紋圖譜克服了用單一指標評價質量的局限性，實現了較全面的化學組分分析，是目前最常用的質量控制方法之一[14-16]，本文擬建立湘產山銀花指紋圖譜和抗氧化、抑菌藥效評價體系，結合灰色關聯度法、偏最小二乘回歸分析和雙變量相關分析等多元統計方法[17-18]分析湘產山銀花發(fā)揮抗氧化和抑菌藥效的物質基礎，以期為山銀花的臨床用藥、藥材質量標準的制定提供科學依據。

1 材料

1.1 供試材料

山銀花樣品經湖南中醫(yī)藥大學周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬的干燥花蕾，共20 份。 具體樣品信息見表1。

表1 山銀花樣品信息

1.2 儀器與試劑

Agilent 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，Agilent Technologies 1260 Infinity, G1314F紫外檢測器，G1239B 自動進樣器）；色譜柱(Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6 mm×250 mm, 5-Micron)；數控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司，型號：SB25-12DT）；超純水機（山東京申分析儀器有限公司，UPA-20）；紫外分光光度計（上海棱光技術有限公司，722SP）；生化培養(yǎng)箱（青島景弘環(huán)?？萍加邢薰?，型號：JH-100A）；高速萬能粉碎機（型號：FW-100，北京科偉永興儀器有限公司）；分析天平（型號：PL203，梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風烘干箱（型號：DH-420AB，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

綠原酸（批號：18071907）、新綠原酸（批號：19081403）、木犀草苷（批號：20060301）、灰氈毛忍冬皂苷乙（批號：20072203）、川續(xù)斷皂苷乙（批號：19120601）、灰氈毛忍冬皂苷甲（批號：18120403）、咖啡酸（批號：20110501）、異綠原酸A（批號：21032304）、異綠原酸B（批號：21022308）純度均≥98%，均購自成都普非德生物技術有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003（北京索萊寶科技有限公司）；乙腈、磷酸、甲醇均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 指紋圖譜

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密吸取綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、木犀草苷、咖啡酸、灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、獐牙菜苷，分別置于10 個5 mL 量瓶中，以70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得各系列混合對照品溶液：綠原酸(1.830 mg/mL）、新綠原酸(0.012 mg/mL)、異綠原酸A (1.050 mg/mL)、異綠原酸B(0.108 mg/mL)、木犀草苷(0.049 mg/mL)、咖啡酸(0.120 mg/mL)、灰氈毛忍冬皂苷甲(0.300 mg/mL)、灰氈毛忍冬皂苷乙(0.500 mg/mL)、川續(xù)斷皂苷乙(1.900 mg/mL)、獐芽菜苷(1.060 mg/mL)。

2.1.2 供試品溶液的制備 取灰氈毛忍冬粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密封，稱定重量，靜置12 h，超聲處理30 min (20 ℃，頻率40 kHz)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 色譜條件 以乙腈為流動相A，0.4%磷酸水為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，10% A； 15～17 min，10%～12% A；17～20 min，12%～15.4% A；20～22 min，15.4%～21.4% A；22～34 min，21.4%～21.8% A; 34～40 min，21.8%～30% A；40～60 min，30% A）；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為25 ℃；檢測波長為210 nm。

2.1.4 精密度試驗 同一供試品連續(xù)進樣6 次，按“2.1.3”項色譜條件測定。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.3”項色譜條件，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h 測定。

2.1.6 重復性試驗 取同一供試品制備6 份供試品溶液，按“2.1.3”項色譜條件測定。

2.1.7 指紋圖譜分析 按照“2.1.2” 項下方法制備20 批灰氈毛忍冬供試品溶液，按照“2.1.3”項下色譜條件對樣品依次進行檢測，記錄指紋圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）建立20 批灰氈毛忍冬特征圖譜，并進行相似度分析。

2.2 體外藥效實驗

2.2.1 抑菌活性試驗 將金黃色葡萄球菌菌液20 μL注入平板培養(yǎng)基中，混合均勻，傾注平板20 mL，水平靜置凝固后備用，抑菌用供試溶液同“2.1.2”項制備方法，用已滅菌的鋼管在實驗平板上打孔，往孔中注入50 μL 供試品溶液，以青霉素為陽性對照組，70%甲醇為空白對照組，每組重復3次，4 ℃預擴散2 h，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)好的平板，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，抑菌效果以抑菌圈直徑大小表示。2.2.2 抗氧化活性測定 精密移取1 mL 供試品溶液與4 mL DPPH 溶液于試管中，搖勻，避光處理30 min，于517 nm 波長處測定吸光度值Ai。 同法測得供試品溶液與60%乙醇吸光度值Aj、60%乙醇與4 mL DPPH 溶液吸光度值A0。 計算清除率[1－(Ai－Aj)/A0]。分別測得各樣品的抗氧化活性，以DPPH 清除率表示。

2.3 數據處理與統計學分析

2.3.1 譜效關系分析 采用SPSS 23.0 在線分析軟件對20 批灰氈毛忍冬的18 個指紋圖譜共有峰的相對峰面積數據和抑菌率藥效指標值進行灰色關聯分析，研究兩者之間的相關性。 通過計算子序列（灰氈毛忍冬各化學成分）與母序列（抗氧化率和抑菌圈直徑）之間的關聯度來確定灰氈毛忍冬提取物各成分對DPPH 清除率和金黃色葡萄球菌的抑制作用影響程度；以共有峰面積為自變量（X），DPPH 清除率、抑菌圈直徑為因變量（Y），采用偏最小二乘法回歸分析對二者進行譜效關系分析。

2.3.2 相關性分析 采用SPSS 23.0 軟件中雙變量相關分析處理方法，計算20 批灰氈毛忍冬提取物的18 個指紋圖譜共有峰的相對峰面積和抑菌率藥效指標值的Pearson 相關系數。

2.4 含量測定

分別取“2.1.1”項下10 個不同對照品溶液，加甲醇稀釋制得6 個不同質量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標、質量濃度（μg/mL）為橫坐標建立線性回歸方程。

3 結果與分析

3.1 方法學考察

同一供試品連續(xù)進樣6 次，各峰面積RSD 在0.009 5%～0.228 7%之間，說明儀器精密度良好，同一供試品分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣，測定各峰面積RSD 在0.004 0%～0.194 6%之間，表明供試品在24 h 之內穩(wěn)定，同一供試品重復制備6份，測定各峰面積RSD 在0.003 8%～0.136 5%之間，表明本方法重復性良好。

3.2 HPLC 指紋圖譜的建立

采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）建立20 批山銀花指紋圖譜，結果見圖1。 選取時間寬度為0.1 min，以平均數生成對照圖譜，經過多點校正后自動匹配，確定18 個特征峰作為評價的變量指標（X）。 并用混合對照品（圖2）對特征峰進行指認，確定1、3、7、8、10、11、12、16、17、18 號峰分別為新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙。

圖1 20 批山銀花指紋圖譜

圖2 混合對照品HPLC 圖譜

3.3 體外藥效結果

70%甲醇的抑菌圈為直徑0 mm，青霉素的抑菌圈為直徑12.67 mm，灰氈毛忍冬抑菌圈直徑在7.39～11.40 mm 之間， 說明灰氈毛忍冬具有抑菌作用，DPPH 清除率在65.11%～78.1%之間。 詳見表2。

表2 灰氈毛忍冬抗氧化、抑菌效果(±s，n=3)

表2 灰氈毛忍冬抗氧化、抑菌效果(±s，n=3)

樣品編號1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 DPPH 清除率/%67.77±0.02 68.88±0.01 66.81±0.10 67.30±0.03 76.17±0.01 68.88±0.05 69.84±0.12 66.82±0.11 70.54±0.10 73.80±0.13 65.11±0.01 67.58±0.02 65.60±0.03 74.25±0.02 67.73±0.14 76.84±0.05 67.28±0.11 78.52±0.06 71.62±0.09 78.10±0.03抑菌圈直徑/mm 8.58±0.00 8.39±0.02 7.55±0.01 9.19±0.02 9.12±0.03 10.03±0.24 9.54±0.00 7.39±0.02 8.56±0.14 7.88±0.00 8.32±0.00 9.00±0.00 11.40±0.01 10.51±0.00 9.70±0.20 8.24±0.00 10.59±0.18 10.50±0.14 9.84±0.34 9.10±0.00

3.4 山銀花抗氧化、抑菌“譜-效”關系分析

3.4.1 灰色關聯度分析 使用關聯度值針對20 個評價對象進行排序；關聯度值介于0～1 之間，該值越大代表其與“參考值”（母序列）之間的相關性越強。從表3 可知：針對本次18 個色譜峰評價項，抗氧化藥效關聯度中有兩個色譜峰關聯度大于0.5，其中3 號峰的綜合評價最高（關聯度為0.980），其次是12號峰（關聯度為0.699）。抑菌譜效關聯度有兩個色譜峰關聯度大于0.5，其中3 號峰的綜合評價最高（關聯度為0.764），其次是12 號峰（關聯度為0.615）。由此推測綠原酸與異綠原酸A 是抗氧化活性和抑菌的主要活性成分。

表3 體外藥效與色譜圖譜的關聯度

3.4.2 PLS 回歸分析 以共有峰面積為自變量（X），DPPH 清除率、抑菌圈直徑為因變量（Y），采用偏最小二乘法回歸分析對二者進行譜效關系分析， 得出自變量X 關于因變量Y 的回方程。

DPPH清除率（Y）=-2.196×X1+1.013×X2+5.571×X3-0.208×X4-0.262×X5+0.028×X6+0.306×X7+0.118×X8+0.879×X9-2.115×X10+0.566×X11-5.709×X12+0.995×X13+0.776×X14-0.101×X15+0.859×X16-0.205×X17-0.293×X18，由圖2 可知，共有峰2、3、6、7、8、9、11、13、14、16 的回歸系數為正數，表明以上成分與抗氧化效果呈正相關。 其中2 號和3 號峰回歸系數大于1，說明其與抗氧化效率顯著相關。

抑菌圈（Y）=-3.907×X1+8.980×X2+23.283×X3-10.041×X4+2.602×X5+0.670×X6+1.510×X7-0.629×X8+2.123×X9-7.516×X10+0.879×X11-38.807×X12+22.171×X13-0.980×X14+0.609×X15-0.386×X16-1.486×X17+1.939×X18，可知，共有峰2、3、5、6、7、9、11、13、15、18 回歸系數為正數， 表明以上成分與抑菌效果呈正相關。其中，2、3、5、7、9、13、18 號峰回歸系數大于1，說明其與抑菌效果顯著相關。

3.4.3 色譜峰與藥效雙變量相關分析 由表4 可知，3 號峰與抗氧化率呈顯著相關（P＜0.05），4、11 和12 號峰與抑菌效果呈顯著相關（P＜0.05），其中12號峰呈正相關，4、11 號峰呈負相關。

表4 山銀花特征峰與藥效相關性及偏最小二乘法回歸系數

3.5 山銀花抗氧化、抑菌“量-效”關系分析

3.5.1 山銀花主要化學成分的含量測定 在指紋圖譜的色譜條件下，測定20 批山銀花中10 種化學成分的含量，線性關系及方法學考察結果見表5。 由表5可知各標準曲線線性關系良好，方法穩(wěn)定可靠。 由表6 可知，山銀花中綠原酸含量為0.863%～7.142%，不同樣品中綠原酸含量差異較大，木犀草苷含量為0.031%～0.092%，灰氈毛忍冬皂苷甲含量為0.007%～0.103%，新綠原酸含量為1.162%～13.516%，咖啡酸含量為0.007%～0.161%，川續(xù)斷皂苷乙含量為0.830%～6.791%，灰氈毛忍冬皂苷乙含量為0.350%～10.750%，異綠原酸A 含量為0.562%～4.963%，異綠原酸B 含量為0.054%～0.201%。

表5 綠原酸等成分線性關系與方法學考察

表6 20 批山銀花樣品中綠原酸等成分的含量（%）

3.5.2 山銀花各成分含量與抗氧化、抑菌藥效相關性分析 由表7 可知，綠原酸與抗氧化藥效呈顯著正相關，川續(xù)斷皂苷乙和異綠原酸A 與抑菌藥效呈顯著正相關。

表7 綠原酸等成分含量與藥效的相關性分析（Pearson 相關系數）

4 討論

4.1 指紋圖譜的建立

2020 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定灰氈毛忍冬（山銀花）的質控成分為綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙，其中綠原酸檢測波長為330 nm，皂苷使用蒸發(fā)光檢測器。本文通過優(yōu)化洗脫條件，最終確定在紫外檢測器下選擇210 nm 波長，建立比較全面的可同時反應有機酸、黃酮、皂苷等化學成分的指紋圖譜。 本次由于山銀花采收時間的原因，收集的樣品數量相對較少，后續(xù)實驗將增加樣品數量，細化不同產地、不同加工方法和不同來源等樣品信息，不斷完善山銀花特征圖譜，以期為山銀花全面的質量評價提供理論依據和數據支撐。

4.2 數據分析方法的選擇

本文通過灰色關聯分析、偏最小二乘回歸分析和雙變量相關分析進行“譜-效”關聯分析[19-20]，3 種方法結果一致，初步篩選出與藥效相關的基礎物質?；疑P聯度分析法作為對模糊系統分析的有效手段，是構建譜-效關系的常用方法之一。 偏最小二乘回歸是一種多元統計回歸建模方法，主要研究的是多自變量對多因變量的回歸建模，能在樣本數較少情況下建立精度較高的回歸模型。 雙變量相關分析是研究隨機變量之間密切程度的一種數據統計分析方法，Pearson 相關系數絕對值越大，兩變量之間的相關性越強，通過將指紋圖譜共有峰的相對峰面積與抗氧化和抑菌藥效指標進行相關性分析，從而得出各色譜峰成分與藥效指標的相關系數，從而為研究兩者之間的線性相關密切程度提供依據。

4.3 質量標志物的預測

“譜-效”關系的研究在于揭示中藥的藥效物質基礎，通過對照品指認了部分共有峰成分，并選擇合理的數據分析方法來評價灰氈毛忍冬的化學成分與藥效之間的相互關系，采用灰色關聯度法和最小偏二乘法回歸分析建立了灰氈毛忍冬抗氧化和抑菌的“譜-效”關系。 采用相關性分析計算共有峰和藥效的相關系數，根據關聯度法分析得出綠原酸、異綠原酸A 與抗氧化和抑菌均有很強的相關性，由偏最小二乘法回歸系數可知2 號峰和綠原酸與抗氧化效果相關性強，綠原酸、咖啡酸、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、2 號峰、5 號峰、9 號峰和1 號峰成分與抑菌效果相關性強，由雙變量相關性分析可知綠原酸與抗氧化效果顯著相關，4 號峰成分、異綠原酸B 和異綠原酸A 與抑菌效果顯著相關。 為進一步確定成分-藥效的相關性，通過測定樣品中綠原酸等10 種成分的含量，與藥效進行“量-效”相關性分析，發(fā)現綠原酸與抗氧化藥效顯著相關，川續(xù)斷皂苷乙和異綠原酸A 與抑菌藥效顯著相關。 故本研究預測抗氧化藥效的質量標志物為綠原酸和異綠原酸等有機酸類，抑菌藥效的質量標志物為皂苷和有機酸類，但還需進一步體內藥效分析驗證。 另外，山銀花還具有抗病毒和抗腫瘤等藥理作用，后續(xù)研究可采用GC-MS、UV 等分析方法建立多元化指紋圖譜，進一步挖掘灰氈毛忍冬藥效物質，完善“譜-效”關系，從源頭提升灰氈毛忍冬產品質量。