桑枝調(diào)控HIF-1α/VEGF/MMPs 信號(hào)通路改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠骨破壞的研究

鄧 慶，賀 飛，胡清橋，余黃合*，黃 娟*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜組織慢性炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病[1]，其基本病理改變?yōu)槁躁P(guān)節(jié)滑膜炎癥、血管翳新生，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，引起關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，使肢體殘疾，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。

RA 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α/VEGF/MMPs 信號(hào)通路在RA 骨破壞進(jìn)程中有著重要作用[3]。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）屬于核因子，其在缺氧狀態(tài)下，表達(dá)量顯著增多，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與HIF-1β 聚合后形成的聚合物，可繼續(xù)與下游因子血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF） 的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，上調(diào)VEGF 表達(dá)[4]。 VEGF 是一種強(qiáng)有力的促血管生成因子，能促進(jìn)滑膜血管新生、血管翳形成，還能影響基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）的表達(dá)[5-6]。MMPs 在軟骨及骨骼發(fā)生損傷的過程中起關(guān)鍵作用， 它可分解軟骨和骨中的膠原、蛋白多糖及降解細(xì)胞外基質(zhì)，刺激血管翳侵襲軟骨，造成韌帶、軟骨和骨質(zhì)的損傷。此外，它還能調(diào)控滑膜細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生[7]。因此，抑制HIF-1α/VEGF/MMPs 信號(hào)通路可抑制血管新生，減輕骨損傷，進(jìn)而延緩RA 疾病進(jìn)程。

目前，在臨床上缺乏治療RA 的理想方法，中醫(yī)古籍中記載桑枝具有“祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)”的功效，現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)，桑枝具有較高的鎮(zhèn)痛和抗炎活性及降血脂、降血糖的作用，常用于治療RA[8]，同時(shí)桑枝水提物可促進(jìn)免疫器官發(fā)育，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫[9]。 本研究擬從HIF-1α/VEGF/MMPs 信號(hào)通路方面探討桑枝對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis, AIA）大鼠骨破壞的治療作用及機(jī)制，為研究RA 治療藥物提供新的思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量240～260 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，動(dòng)物合格證號(hào)為430727211101621523。 飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，濕度45%～65%，室溫25 ℃，自由飲水、攝食，適宜性喂養(yǎng)7 d 后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

桑枝飲片（批號(hào)：2101080022）、雷公藤多苷片（批號(hào)：Z43020138）均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。 桑枝飲片以4 倍量水回流提取2 次，每次1 h；桑枝水提物低劑量、高劑量分別濃縮干燥至3、9 g/mL。 雷公藤多苷片取50 mg，精密稱量，置于研缽中研磨粉碎，加至500 mL 溫水中，充分溶解，得1 mg/mL 懸濁液。

1.3 試劑

完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant, CFA，美國Chondrex 公司，批號(hào)：210309）；蘇木素染色液（批號(hào)：WH1144）、伊紅染色液（批號(hào)：WH2144）、枸櫞酸鹽緩沖液（批號(hào)：WH2007）均購自上海威奧生物科技有限公司；4%多聚甲醛溶液（北京白鯊易生物科技有限公司；批號(hào)：BL539A）；0.9%氯化鈉溶液（湖南科倫制藥有限公司，批號(hào)：2104211）；兔二步法免疫組化試劑盒（批號(hào)：PV-9000）、DAB 試劑盒（批號(hào)：ZLI-9018）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PBST 緩沖液（批號(hào)：AWI0130）、RIPA 裂解液（批號(hào)：AWB0136）均購自長沙艾碧維生物科技有限公司；HIF-1α 多克隆抗體（批號(hào)：ab72777）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）多克隆抗體（批號(hào)：ab38898）均購自英國Abcam公司；VEGF 多克隆抗體（批號(hào)：13687-1-AP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3, MMP-3）多克隆抗體（批號(hào)：66338-1-Ig）、β-actin 多克隆抗體（批號(hào)：66009-1-Ig）均購自美國Proteintech 公司。

1.4 儀器

高分辨率小動(dòng)物微型CT（美國PerkinElmer-Caliper LS 公司，型號(hào)：Quantum FX Demo）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ChemiScope6100）；轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：DYCZ-40D）、恒溫箱（型號(hào)：DYY-6C）均購自北京六一生物科技有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

雄性SD 大鼠30 只，采用隨機(jī)數(shù)表法分為正常組、模型組、陽性藥組、桑枝水提物低劑量組、桑枝水提物高劑量組，每組6 只。 參照文獻(xiàn)[10]構(gòu)建AIA 大鼠模型，除正常組外，于其右后足跖底部常規(guī)皮膚消毒，取100 μL 濃度為10 g/L 的CFA 注射建立模型。注射CFA 后，大鼠右后足紅腫、局部皮膚溫度升高、活動(dòng)障礙，提示建模成功。自建模后1 d 起，正常組、模型組灌服10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液，陽性藥組灌服10 mg/kg 雷公藤多苷片懸濁液，桑枝水提物低劑量組、桑枝水提物高劑量組分別灌服3、9 g/kg桑枝水提物，每天1 次，連續(xù)30 d。

2.2 動(dòng)物體質(zhì)量及足趾腫脹度測(cè)定

造模前（第0 天）以及造模后每3 天稱量，并利用大鼠足跖容積測(cè)量裝置[11]精準(zhǔn)測(cè)量大鼠右后足足趾容積并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)計(jì)算，測(cè)量3 次取平均值，求出足趾腫脹度，足趾腫脹度=（致炎后足容積-致炎前足容積）/致炎前足容積×100%。 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]：0 分為未見紅腫；1 分為小趾關(guān)節(jié)見紅脹；2分為小趾關(guān)節(jié)和足趾均腫脹；3 分為踝關(guān)節(jié)以下足趾腫脹；4 分為包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足趾腫脹，且負(fù)重困難。

2.3 大鼠足骨放射學(xué)觀察與骨破壞評(píng)分

使用小動(dòng)物CT 觀察大鼠右后足并評(píng)價(jià)其骨質(zhì)破壞的嚴(yán)重程度。 骨破壞評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]：0 分為正常；1分為輕度改變；2 分為中度程度改變；3 分為重度改變；4 分為極重度改變。

2.4 大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查與組織學(xué)評(píng)分

大鼠處死后，取右踝關(guān)節(jié)，用10%中性甲醛固定，5%硝酸脫鈣，直至關(guān)節(jié)軟化，不同濃度乙醇梯度脫水，用石蠟包埋、切片，HE 染色，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下檢查是否有炎細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞異常增殖、關(guān)節(jié)間隙變窄和骨侵蝕等現(xiàn)象并評(píng)分、采集圖像。 組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]：0 分為正常關(guān)節(jié)，無炎性細(xì)胞浸潤，無血管翳形成，無骨破壞；1 分為炎性細(xì)胞浸潤或輕微水腫，少量血管翳形成，骨輕度破壞；2 分為炎性細(xì)胞中等浸潤，大量血管翳形成，骨中度破壞；3 分為炎性細(xì)胞嚴(yán)重浸潤，關(guān)節(jié)腔狹窄；4分為血管翳形成，骨重度破壞。

2.5 大鼠踝關(guān)節(jié)免疫組化檢查

切片置于60 ℃溫箱烤片12 h，再轉(zhuǎn)至二甲苯中20 min，進(jìn)行3 次脫蠟，不同濃度乙醇梯度脫水后，將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，進(jìn)行熱修復(fù)抗原。 加入1%高碘酸以滅活內(nèi)源性酶。滴加1∶200 的一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜，繼續(xù)滴加50～100 μL 二抗于37 ℃孵育30 min。 DAB染色，蘇木素復(fù)染，不同濃度乙醇梯度脫水后，置于二甲苯中，中性樹膠封片。 每張切片隨機(jī)觀察5 個(gè)視野并采集圖像，再輸入計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，得出陽性細(xì)胞的平均光密度，并計(jì)算均值。

2.6 Western blot 檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白的表達(dá)

分離取出大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)滑膜，用預(yù)冷的PBS 洗滌1 次后，加入RIPA 裂解液，以4 ℃，離心半徑7 cm，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，制備10%分離膠、4.8%濃縮膠，取待測(cè)蛋白樣本20 μL進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min 后，加入兔抗大鼠HIF-1α 一抗（1∶500）、兔抗大鼠VEGF 一抗（1∶500）、小鼠抗大鼠MMP-3 一抗（1∶5000）、兔抗大鼠MMP-9 一抗（1∶1000）和小鼠抗大鼠β-actin 一抗（1∶5000）孵育90 min，使用PBST 洗3 次，分別加入山羊抗小鼠二抗（1∶5000）和山羊抗兔二抗（1∶6000）孵育90 min，結(jié)束后使用PBST 洗3 次，使用ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，塑封膜將膜包裹雜交膜，放入凝膠成像系統(tǒng)中成像。 將曝光后的底片用Quantity One專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 24.0 和GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用“±s”表示，滿足正態(tài)性和方差齊性后，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠體質(zhì)量變化的影響

從第6 天起，模型組體質(zhì)量均顯著低于正常組（P＜0.05，P＜0.01）。 從第21 天起，陽性藥組、桑枝水提物低劑量組體質(zhì)量均顯著高于模型組（P＜0.01）。從第18 天起，桑枝水提物高劑量組體質(zhì)量均顯著高于模型組（P＜0.01）。 第30 天，桑枝水提物高劑量組體質(zhì)量顯著低于桑枝水提物低劑量組（P＜0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，n=6，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，n=6，g）

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與桑枝水提物低劑量組比較，＆P＜0.05。

組別正常組模型組陽性藥組桑枝水提物低劑量組桑枝水提物高劑量組第0 天242.20±2.86 248.70±7.84 245.20±7.08 238.30±3.50 246.80±7.36第3 天264.80±6.34 257.50±6.83 248.80±11.70 248.30±13.65 254.80±6.01第6 天289.50±6.90 270.70±7.47▲261.50±14.72 258.00±7.62 269.70±5.96第9 天314.30±8.78 283.00±7.35▲▲270.20±20.96 274.20±9.07 283.70±8.87第12 天348.50±7.50 288.80±9.24▲▲290.20±23.61 291.50±5.99 298.70±10.98第15 天370.50±9.23 287.80±13.70▲▲296.80±17.70 298.80±9.37 305.70±11.04第18 天390.20±110.89 289.20±117.06▲▲304.20±118.78 306.50±14.23 310.70±111.40**第21 天415.50±13.26 293.00±16.98▲▲319.20±14.66**323.30±4.23**317.80±11.70**第24 天426.30±10.41 299.70±17.35▲▲333.20±9.50**337.20±5.81**325.20±11.89**第27 天443.20±11.69 310.20±13.32▲▲353.20±6.31**354.20±5.42**337.30±16.03**第30 天455.50±10.71 322.80±12.25▲▲367.80±5.98**370.80±7.08**351.00±13.30**＆

3.2 桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠足趾腫脹度的影響

從第3 天起，模型組足趾腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著高于正常組（P＜0.01）。 從第6 天起， 陽性藥組、桑枝水提物低劑量組足趾腫脹度均顯著低于模型組（P＜0.01）。 第6 天、第15～30 天，桑枝水提物高劑量組足趾腫脹度均顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。從第6 天起， 桑枝水提物高劑量組足趾腫脹度均顯著高于陽性藥組（P＜0.01）。 第6～9 天、第15～30 天，桑枝水提物高劑量組足趾腫脹度顯著高于桑枝水提物低劑量組（P＜0.01）。 第12～30 天的陽性藥組、第15～30 天的桑枝水提物低劑量組、第21～27 天的桑枝水提物高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著低于模型組（P＜0.01）。第12～24 天，桑枝水提物高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著高于陽性藥組（P＜0.01）。第15～24 天，桑枝水提物高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著高于桑枝水提物低劑量組（P＜0.01）。 詳見表2-3。

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較（±s，n=6）

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較（±s，n=6）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，##P＜0.01；與桑枝水提物低劑量組比較，＆＆P＜0.01。

組別正常組模型組陽性藥組桑枝水提物低劑量組桑枝水提物高劑量組第0 天0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00第3 天0.02±0.01 1.38±0.07▲▲1.45±0.04 1.42±0.06 1.46±0.06第6 天0.05±0.01 1.88±0.08▲▲1.51±0.05**1.47±0.10**1.78±0.08*##＆＆第9 天0.07±0.01 1.50±0.06▲▲1.34±0.04**1.38±0.11**1.50±0.07##＆＆第12 天0.09±0.01 1.61±0.05▲▲1.40±0.09**1.44±0.11**1.53±0.05##第15 天0.11±0.01 1.76±0.03▲▲1.45±0.09**1.45±0.09**1.61±0.05**##＆＆第18 天0.13±0.02 1.88±0.04▲▲1.37±0.09**1.38±0.07**1.67±0.06**##＆＆第21 天0.15±0.02 2.07±0.05▲▲1.30±0.07**1.32±0.06**1.59±0.06**##＆＆第24 天0.16±0.01 2.01±0.04▲▲1.23±0.09**1.24±0.07**1.42±0.05**##＆＆第27 天0.18±0.01 1.86±0.06▲▲1.14±0.08**1.14±0.07**1.35±0.08**##＆＆第30 天0.20±0.02 1.66±0.06▲▲1.05±0.05**1.00±0.08**1.30±0.07**##＆＆

3.3 桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠足關(guān)節(jié)骨破壞的影響

模型組關(guān)節(jié)腫脹明顯、關(guān)節(jié)僵硬強(qiáng)直、功能障礙、活動(dòng)明顯受限，各足趾關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)處明顯有骨質(zhì)侵襲、骨破壞嚴(yán)重、關(guān)節(jié)間隙狹窄明顯、關(guān)節(jié)變形、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。 桑枝水提物低劑量組和高劑量組骨質(zhì)侵襲、關(guān)節(jié)間隙狹窄均有所改善。模型組骨破壞評(píng)分顯著高于正常組（P＜0.01）。陽性藥組、桑枝水提物低劑量組、桑枝水提物高劑量組骨破壞評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量骨破壞評(píng)分均顯著高于陽性藥組、 桑枝水提物低劑量（P＜0.05）。 詳見圖1-2。

圖1 各組大鼠足骨CT 圖片

表3 各組大鼠足趾關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（±s，n=6）

表3 各組大鼠足趾關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（±s，n=6）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與陽性藥組比較，##P＜0.01；與桑枝水提物低劑量組比較，＆＆P＜0.01。

組別正常組模型組陽性藥組桑枝水提物低劑量組桑枝水提物高劑量組第0 天0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00第3 天0.00±0.00 3.33±0.82▲▲3.33±0.52 3.33±0.52 3.33±0.52第6 天0.00±0.00 4.00±0.00▲▲3.67±0.52 3.67±0.52 3.67±0.52第9 天0.00±0.00 3.67±0.52▲▲3.17±0.75 3.17±0.75 3.33±0.52第12 天0.00±0.00 3.17±0.41▲▲2.17±0.41**2.50±0.55 3.17±0.41##第15 天0.00±0.00 3.67±0.52▲▲2.50±0.55**2.17±0.41**3.50±0.55##＆＆第18 天0.00±0.00 3.83±0.41▲▲2.00±0.63**1.83±0.41**3.50±0.55##＆＆第21 天0.00±0.00 3.83±0.41▲▲1.67±0.52**1.83±0.41**2.83±0.41**##＆＆第24 天0.00±0.00 3.33±0.52▲▲1.17±0.41**1.50±0.55**2.50±0.55**##＆＆第27 天0.00±0.00 2.67±0.52▲▲1.17±0.41**1.33±0.52**1.83±0.41**第30 天0.00±0.00 2.33±0.52▲▲1.17±0.41**1.33±0.52**1.83±0.41

圖2 各組大鼠足骨骨破壞評(píng)分比較（±s，n=6）

3.4 桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變的影響

模型組大量炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜重度增生，突入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，廣泛的血管翳形成，骨質(zhì)侵襲嚴(yán)重。 陽性藥組與桑枝水提物低劑量組關(guān)節(jié)腔內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤，少量滑膜增生；桑枝水提物高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤中等量，滑膜中度增生，突入關(guān)節(jié)腔，關(guān)節(jié)間隙變窄。 模型組組織學(xué)評(píng)分顯著高于正常組（P＜0.01）。陽性藥組、桑枝水提物低劑量組、桑枝水提物高劑量組組織學(xué)評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量組組織學(xué)評(píng)分顯著高于陽性藥組、桑枝水提物低劑量組（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見圖3-4。

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織HE 染色結(jié)果

圖4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)分比較（±s，n=6）

3.5 免疫組化觀察桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白的影響

HIF-1α 定位于滑膜細(xì)胞胞漿和胞核，VEGF、MMP-3、MMP-9 均定位于滑膜細(xì)胞胞漿。 正常組滑膜組織中可見極少量和少量棕黃色顆粒。 模型組可見大量細(xì)密的棕黃色顆粒物集聚。 陽性藥組、桑枝水提物低劑量組棕黃色顆粒均顯著減少，桑枝水提物高劑量組棕黃色顆粒小幅度減少。 模型組HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組（P＜0.01）。陽性藥組、桑枝水提物低劑量組HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型組（P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量組MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量組HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著高于陽性藥組（P＜0.05，P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量組HIF-1α、VEGF、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著高于桑枝水提物低劑量組（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見圖5。

圖5 桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜HIF-1α(A)、VEGF (B)、MMP-3(C)、MMP-9(D)蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，±s，n=6）

3.6 Western blot 檢測(cè)桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白的影響

模型組HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組（P＜0.01）。陽性藥組、桑枝水提物低劑量組HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型組（P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量組VEGF、MMP-3 蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量組HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著高于陽性藥組（P＜0.01）。 桑枝水提物高劑量組VEGF、MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著高于桑枝水提物低劑量組（P＜0.01）。 詳見圖6。

圖6 桑枝水提物對(duì)AIA 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HIF-1α、VEGF、MMP-3、MMP-9蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）

4 討論

目前，RA 的治療以藥物治療為主，包括以緩解癥狀為主的非甾體類抗炎藥、以甲氨蝶呤為首的改善病情的抗風(fēng)濕藥、生物制劑、糖皮質(zhì)激素等，RA是慢性免疫性疾病，上述藥物長期使用都會(huì)導(dǎo)致明顯的不良反應(yīng)[15]，尋找安全有效的治療藥物是當(dāng)前亟待解決的問題。桑枝屬于“舒筋活絡(luò)類”中藥，研究發(fā)現(xiàn)，桑枝作為配伍藥對(duì)或配伍藥組，在臨床上治療RA 出現(xiàn)的頻率在177 味中藥中排列第2，說明桑枝在RA 的治療上起著重要作用[16]。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑枝乙醇提取物具有顯著的抗炎效果，能抑制誘生型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶-2、炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β 和白細(xì)胞介素-6 等的產(chǎn)生[17]，為其抗RA 作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 基于對(duì)各RA動(dòng)物模型的比較[18]，佐劑誘導(dǎo)型AIA 模型發(fā)病等各方面表現(xiàn)與人RA 類似，且建模成功率高，故本研究選擇建立此模型對(duì)桑枝治療RA 的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

RA 被稱為“不死不治之癌”，其發(fā)病過程中成纖維樣滑膜細(xì)胞侵略性的生長特性類似于腫瘤樣增生[19]。 這種生長方式會(huì)消耗大量的能量并且需要大量的氧氣供應(yīng)，以滿足細(xì)胞新陳代謝的需要。若關(guān)節(jié)腔內(nèi)的氧氣被消耗，形成慢性缺氧環(huán)境，HIF-1α 表達(dá)量增多，它會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，干擾HIF-1α 的表達(dá)，能顯著降低VEGF 蛋白表達(dá)水平[20-21]。 目前，已知VEGF 是HIF 信號(hào)通路誘導(dǎo)的主要血管生成因子，可促進(jìn)血管新生，參與血管翳形成，加重關(guān)節(jié)骨破壞，且VEGF 在一定程度上能反映RA 的疾病活動(dòng)度[22-23]。 MMPs 可通過分解內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞游走、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)血管新生，也能參與血管翳形成，還可直接降解骨和軟骨，導(dǎo)致RA 骨破壞。 其中MMP-3 是導(dǎo)致骨破壞最重要的蛋白水解酶，可通過其表達(dá)情況預(yù)測(cè)骨破壞的嚴(yán)重程度，對(duì)RA 的治療和預(yù)后具有指示作用[24]。研究表明，在RA 患者的關(guān)節(jié)液中，MMP-9的表達(dá)水平與VEGF 的表達(dá)水平密切相關(guān)，且VEGF能激活VEGF 受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2），磷酸化熱休克蛋白90（heat shock proteins 90, Hsp90）亞型Y300，后者再與內(nèi)皮型一氧化氮合酶結(jié)合，使血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮增多，進(jìn)而促進(jìn)MMPs 表達(dá)[25-26]，加重骨破壞。這表明VEGF 能對(duì)MMPs 的表達(dá)起到調(diào)控作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑枝-桂枝藥對(duì)可能通過抑制HIF-1 信號(hào)通路表達(dá)來治療RA，并且MMPs為此藥對(duì)的靶點(diǎn)基因[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，桑枝水提物增加了AIA 大鼠體質(zhì)量，減輕了骨破壞，并改善了四肢活動(dòng)能力以提升關(guān)節(jié)炎大鼠生活質(zhì)量。此外，低劑量的桑枝水提物還能顯著抑制大鼠足趾炎癥反應(yīng)及新生血管形成。免疫組化和Western blot 顯示給予桑枝水提物治療后大鼠滑膜組織中HIF-1α 表達(dá)量明顯降低，對(duì)下游靶基因VEGF 的激活效應(yīng)減弱，使VEGF 表達(dá)量降低，抑制血管新生；VEGF 通過激活VEGFR2， 磷酸化Hsp90 亞型Y300，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮，促進(jìn)MMPs 表達(dá)。 因此，降低VEGF 的表達(dá)能引起MMP-3、MMP-9 表達(dá)抑制，從而減輕關(guān)節(jié)炎大鼠的骨破壞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桑枝水提物高劑量組藥效弱于桑枝水提物低劑量組，這可能是因?yàn)樯Ｖλ嵛锔邉┝拷M藥物濃度偏大，含糖類物質(zhì)較多，較黏稠，影響動(dòng)物進(jìn)食及基礎(chǔ)代謝從而減弱了藥效，因此，桑枝水提物低劑量組的治療效果優(yōu)于桑枝水提物高劑量組。

綜上所述，桑枝水提物能有效減輕AIA大鼠骨破壞，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α/VEGF/MMPs 信號(hào)通路的表達(dá)相關(guān)。