單面針?biāo)幉恼鎮(zhèn)舞b別研究及等級評價體系的初步建立

凌勇根，王月秀，冷其霖，劉 洋，譚喜平，龔 云，龔力民，林麗美，張 鵬*

（1.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

單面針又名山枇杷、大葉花椒、蜆殼花椒等[1]，為我國南方重要的珍稀木本藥用植物資源[2]，主產(chǎn)于我國西南及湖南、湖北、廣東、廣西等地[3]。 其主要含有多種生物堿[4-5]、內(nèi)酯類[6]和黃酮類[7]等化學(xué)成分，具有活血散瘀、祛風(fēng)除濕、理氣止痛的功效。單面針為蕓香科植物蜆殼花椒（Zanthoxylum dissitum Hemsley）或刺殼花椒（Zanthoxylum echinocarpum Hemsley）的干燥根和莖[8]。 同屬植物兩面針為蕓香科植物兩面針[Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.]的干燥根，具有活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)通絡(luò)、解毒消腫功效，用于治療跌打損傷、胃痛、牙痛等[9]，兩者的化學(xué)成分的相似，混用現(xiàn)象較常見，市場上常見的偽品還有野生花椒等，上述混偽品嚴(yán)重影響了單面針?biāo)幉牡陌踩珣?yīng)用和質(zhì)量保障。

“辨狀論質(zhì)”作為中藥品種傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別，最早由我國著名中藥學(xué)家謝宗萬教授概括提出[10]，即通過“辨狀”，包括藥材的形狀、大小、色澤、表面特征、質(zhì)地、 斷面特征及氣味等來辨別藥材的真?zhèn)魏驮u判藥材的優(yōu)劣，即“論質(zhì)”。 也有報道以性狀特征[11]、紅外光譜[12]、分子生物學(xué)[13]和質(zhì)譜技術(shù)[14]等進(jìn)行區(qū)分，但關(guān)于系統(tǒng)地薄層色譜法和高效液相色譜法卻少有報道。 本研究采用薄層色譜法和高效液相色譜法系統(tǒng)地比較分析，旨在找到單面針與兩面針及混偽品的明顯區(qū)分點，為單面針真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制提供參考。

《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[15]作為中藥材分級的國家標(biāo)準(zhǔn)，執(zhí)行至今已有35 年，但單面針?biāo)幉囊恢蔽幢皇珍?，本研究收?0 批單面針?biāo)幉模ㄟ^對不同批藥材的性狀、雜質(zhì)、直徑、水分、灰分、二氧化硫殘留量、重金屬和有害元素殘留量、醇溶性浸出物及木蘭花堿含量進(jìn)行檢測和分析，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析單面針?biāo)幉牡燃壟c各質(zhì)控指標(biāo)之間的相關(guān)性，建立了初步的等級評價體系，為優(yōu)質(zhì)的單面針?biāo)幉馁|(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ATS 4 薄層色譜全自動點樣儀、ADC 2 薄層色譜全自動展開儀、Derivatizer 薄層色譜全自動噴霧系統(tǒng)、Visualizer 2 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG 公司）；TH-II 薄層色譜顯色加熱器 （上?？普苌萍加邢薰荆籛aters e2695 型高效液相色譜儀、Waters 2998 型PDA 檢測器（美國Waters 公司）；iCAP RQ ICP-MS 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；AB204-S 型電子天平、AB135-S 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SM100 型切割室研磨儀[弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司]；114B 型搖擺式中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；A11 型分析型研磨儀（德國IKA 公司）；DZAKW-D-6 型恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；SX2-4-10 型系列箱式電阻爐（上海力辰儀器科技有限公司）。

1.2 試藥

木蘭花堿對照品（批號：M-026-180524）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；氯化兩面針堿（110848-201604）購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇（批號：P1441123）、95%乙醇（批號：P1433419）、三氯甲烷（批號：P1318320）、乙醇（批號：P1437228）、乙酸乙酯（批號：P1429095）、氨水（批號：P1375833）、二氯甲烷（批號：P1454839）、二乙胺（批號：P1382819）均為分析純，購于General-Reagent 公司；甲醇（批號：P1433419）、甲酸（批號：P1441123）為色譜純，購于General-Reagent 公司。藥材均為株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)龔力民教授鑒定，單面針為蕓香科植物蜆殼花椒（Zanthoxylum dissitum Hemsley）或刺殼花椒（Zanthoxylum echinocarpum Hemsley）的莖，兩面針為蕓香科植物兩面針[Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC.]的根，野花椒為蕓香科植物野花椒（Zanthoxylum simulans Hance.）的莖，飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血[Toddalia asiatica(L.)Lam.]的莖。 詳見表1。

表1 實驗樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法

2.1.1 供試品溶液的制備 取供試品粉末（過二號篩）2 g，置具塞錐形瓶，加乙醇40 mL，密閉，超聲處理60 min，過濾，水浴蒸干，殘渣加2 mL 乙醇溶解即得，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿、氯化兩面針堿對照品適量，分別加乙醇制成1 mL 中含1 mg 和0.5 mg 的對照品溶液。

2.1.3 薄層色譜鑒定 照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0502）[16]試驗，吸取上述對照品溶液5 μL；供試品溶液5～10 μL 分別點于同一硅膠GF254 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水-二乙胺（40∶10∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，在365 nm 下檢視。 供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.4 樣品結(jié)果 采用上述色譜法對4 批蜆殼花椒（S1～S4）、3 批刺殼花椒（C1～C3）、4 批兩面針樣品（LS26～LS29）及3 批偽品[1 批飛龍掌血（W1）、2 批野花椒（W2、W3）]進(jìn)行薄層鑒別，結(jié)果樣品中斑點清晰，不同基原樣品具有良好的一致性，在Rf=0.9處，各有兩條亮紅色斑點，可以作為單面針與兩面針及偽品的鑒別點，可以達(dá)到區(qū)分偽品的目的。薄層圖譜見圖1。

圖1 薄層色譜樣品檢測

2.2 高效液相色譜法[17]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱為Waters SunFire C18（柱長25 cm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm），以甲醇為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（表2）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為268 nm。 理論塔板數(shù)按木蘭花堿計算應(yīng)不低于5000。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含木蘭花堿60 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取30 批單面針和15 批兩面針樣品，粉碎，過3 號篩，約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 樣品結(jié)果 單面針?biāo)幉臉?biāo)志性成分主要為1號峰和2 號峰（木蘭花堿），通過單面針與兩面針色譜圖對比分析，1 號峰可作為區(qū)分單面針和兩面針的特征性成分。 30 批單面針圖譜和15 批兩面針圖譜見圖2-4。

圖2 單面針色譜圖

2.3 外觀特征

2.3.1 性狀 按照《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009 年版）[8]規(guī)定對30 批單面針?biāo)幉倪M(jìn)行測定。

本品為類圓形。莖表面灰褐色或暗灰色，有縱向突起的棱紋或皮孔，乳頭狀突起的皮刺或橢圓形的皮刺疤痕。質(zhì)堅硬，難折斷，切面皮部極窄，木部黃白色或淡棕紅色，可見同心性環(huán)紋及密集的射線。髓部白色，迎光可見閃爍的小亮點。 味稍苦而有刺喉感。

2.3.2 直徑樣品測定 取30 批單面針?biāo)幉?，直徑按照《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部[16]規(guī)定進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 30 批單面針外觀特征測定結(jié)果

圖3 兩面針色譜圖

圖4 單面針及兩面針液相鑒別區(qū)分點

2.3.3 樣品結(jié)果 30 批單面針樣品直徑范圍1.1～2.8 cm，變異幅度達(dá)到1.7 cm，說明不同產(chǎn)地單面針直徑大小存在一定差異，通過感官可直接分辨大小。

2.4 內(nèi)在質(zhì)量

2.4.1 樣品測定 取30 批單面針?biāo)幉模s質(zhì)、水分、總灰分、醇溶性浸出物、重金屬及有害元素、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留、二氧化硫殘留量按照《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部[16]規(guī)定進(jìn)行測定，木蘭花堿含量按照“2.2”項進(jìn)行測定，結(jié)果見表4-6。

表4 30 批單面針?biāo)?、總灰分、浸出物、含量測定結(jié)果

2.4.2 樣品結(jié)果 雜質(zhì)的含量為1%～3%。水分的含量為7.2%～9.2%，均不超過《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009 年版）中單面針?biāo)忠?guī)定的限量14.0%。 總灰分的含量為2.3%～3.9%，均不超過《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009 年版）中單面針總灰分規(guī)定的限量5.0%。醇溶性浸出物的含量為3.9%～7.0%，平均值5.4%，均符合《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009 年版）中單面針浸出物規(guī)定的限量3.0%。重金屬及有害元素中鉛的含量為0.5～3.2 mg/kg、鎘的含量為0.1～0.6 mg/kg、砷的含量為0.04～0.2 mg/kg、汞的含量均未超過0.01 mg/kg、銅的含量為2.2～8.3 mg/kg。 均在中國《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[18]規(guī)定限度內(nèi)，處于安全水平?？偭?、總滴滴涕、五氯硝基苯均未檢出，故本品未規(guī)定有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的限度。 二氧化硫殘留量均未超過150 mg/kg，均不超過《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部[16]中二氧化硫殘留量規(guī)定的限量150 mg/kg。

單面針中的木蘭花堿具有明顯的抗炎、抗菌等藥理作用[19]，通過對不同產(chǎn)地單面針進(jìn)行木蘭花堿含量測定，結(jié)果表明單面針木蘭花堿含量為0.05%～0.19%，說明不同產(chǎn)地的單面針樣品中木蘭花堿含量存在差異。

表5 30 批單面針重金屬及有害元素測定結(jié)果(mg/kg)

2.5 單面針?biāo)幉牡燃壴u價體系的初步研究

2.5.1 實驗材料 樣品信息見表2，批號為S1～S30，共計30 批。

2.5.2 等級劃分指標(biāo)的確定 采用軟件SPSS 19.0對30 批單面針樣品外在特征和內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計分析，見表7-9。

由表7 各指標(biāo)的描述統(tǒng)計可知，單面針外觀特征指標(biāo)雜質(zhì)與直徑的變異系數(shù)分別為44.4%、22.2%。單面針內(nèi)在指標(biāo)成分木蘭花堿含量、總灰分、浸出物的變異系數(shù)分別為40.00%、17.9%、16.7%。 由表8各指標(biāo)的相關(guān)性分析可知，直徑、木蘭花堿含量、浸出物、總灰分在0.01 水平上呈顯著的正相關(guān)。 由表9 對各指標(biāo)的主成分分析可知， 主成分一的特征值為2.019，貢獻(xiàn)率為33.651%；主成分二的特征值為1.659，貢獻(xiàn)率為27.642%；主成分三的特征值為1.090，貢獻(xiàn)率為18.160%，累積貢獻(xiàn)率為79.453%，特征向量的大小代表各性狀指標(biāo)對主成分貢獻(xiàn)的大小，綜合考慮特征值和貢獻(xiàn)率的大小，結(jié)合實際情況和可操作性，故選用直徑、浸出物、木蘭花堿含量作為藥材等級劃分指標(biāo)。

表6 30 批單面針有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量、二氧化硫殘留量測定結(jié)果(mg/kg)

表7 單面針各測定指標(biāo)的描述統(tǒng)計

表8 單面針各指標(biāo)間相關(guān)性分析

表9 主成分分析

2.5.3 分級 將每批單面針樣品的直徑、浸出物、含量作為聚類指標(biāo)，運(yùn)用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件對30 批單面針樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。

由圖5 可以看出，將30 批單面針樣品分為3類：樣品S4 聚為一類，為一等品；樣品S11、S12、S13、S14、S15、S16、S20、S22、S23 聚為一類，為二等品；其他20 批樣品聚為一類，為統(tǒng)貨樣品，詳見表10。 初步建立了單面針?biāo)幉馁|(zhì)量等級評價體系：1 批一等：醇溶性浸出物不少于6.8%，直徑不小于2.8 cm，木蘭花堿含量不少于0.19%；9 批二等：醇溶性浸出物5.8%～7.0%，直徑1.3～2.2 cm，木蘭花堿含量0.05%～0.17%；20 批三等：醇溶性浸出物3.9%～5.8%，直徑大小不等，木蘭花堿含量0.06%～0.16%。

表10 單面針?biāo)幉牡燃壴u價指標(biāo)

圖5 30 批單面針樣品各指標(biāo)聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 薄層色譜法

生物堿類化合物是單面針的主要活性成分之一，主要包含木蘭花堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿等，通常是評價該藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[20-21]。 以白屈菜紅堿[22]為對照進(jìn)行薄層鑒別時，單面針特征斑點不明顯，而兩面針和偽品斑點特別明顯[9]，故未選擇白屈菜紅堿作為定性指標(biāo)。 選擇了木蘭花堿和氯化兩面針堿為對照，進(jìn)行了供試品溶液的制備方法、薄層色譜鑒別展開條件的考察及方法學(xué)驗證，薄層色譜鑒別可以很好分離和區(qū)分單面針、兩面針及偽品，提取方法簡單、快捷，斑點清晰，所用試劑易獲取，便于操作。

3.2 高效液相色譜法

單面針與兩面針均來源于蕓香科，化學(xué)成分比較相似，采用高效液相色譜法對不同產(chǎn)地單面針和兩面針進(jìn)行對比分析，篩選出主要的差異成分為1 號峰，后續(xù)需對1 號峰進(jìn)行提取分離、結(jié)構(gòu)確證、藥理藥效研究，以確證1 號峰作為單面針特征性成分加以控制，以保障單面針基原準(zhǔn)確，區(qū)分真?zhèn)纹贰?/p>

3.3 其他檢測項

按照《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009 年版）、《中華人民共和國藥典》（2020 年版）等方法對不同產(chǎn)地單面針?biāo)幉碾s質(zhì)、直徑、水分、總灰分、醇溶性浸出物、重金屬及有害元素、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量、二氧化硫殘留量、木蘭花堿的含量等進(jìn)行了全面的質(zhì)量檢測，均符合現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥典要求，可為單面針質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供數(shù)據(jù)支撐。

3.4 等級評價

通過對單面針?biāo)幉耐庥^特征和內(nèi)在質(zhì)量的全面分析，從描述性統(tǒng)計、相關(guān)性分析、主成分分析等確定了等級劃分指標(biāo)。采用聚類分析對30 批單面針?biāo)幉慕⒘顺醪降娜壍燃壴u價體系，結(jié)果顯示，直徑越大，內(nèi)在質(zhì)量越優(yōu)。一等品1 批，產(chǎn)地為湖南懷化；二等品共9 批，產(chǎn)地分別為湖南吉首5 批以及湖北、廣西、廣東、貴州各1 批；三等品共20 批，各個產(chǎn)地均有分布。 不同省份不同批樣品質(zhì)量波動較大，同一省份不同批藥材也有一定的差異，但相對來講，湖南省樣品相對優(yōu)質(zhì)且批間穩(wěn)定。由于收集到的30批單面針?biāo)幉纳L年份不明確，故后續(xù)需對不同生長年份單面針質(zhì)量進(jìn)行更多的相關(guān)性和影響趨勢研究。

4 結(jié)論

本研究確證了薄層色譜法和高效液相色譜法能夠有效地鑒別和區(qū)分單面針?biāo)幉呐c兩面針?biāo)幉募俺Ｒ娀靷纹?，方法專屬性?qiáng)、靈敏度高、簡便實用，薄層色譜法與高效液相色譜法能夠相互驗證、互為補(bǔ)充，提供了有效的質(zhì)控手段，為規(guī)范中藥材市場奠定了基礎(chǔ)。 將傳統(tǒng)的外觀特征結(jié)合內(nèi)在有效成分含量，初步建立了單面針3 個規(guī)格藥材的評價體系，實踐中容易掌握，為評價單面針?biāo)幉馁|(zhì)量提供了數(shù)據(jù)支持，對藥材的采收與產(chǎn)地加工具有一定的指導(dǎo)和實踐意義，可以促進(jìn)單面針商品藥材的市場價格秩序化、合理化，以滿足不同的臨床應(yīng)用需求。