抗菌肽LL-37的抗菌和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

李 俊，董榮靜，李家生，張 祎，李玉葉，王睿睿

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院分子藥理教研室，云南 昆明 650500； 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚與性病科，云南 昆明 650032)

所有生物都需要對(duì)生存環(huán)境中的其他微生物產(chǎn)生持續(xù)防御，否則可能會(huì)發(fā)生感染甚至死亡。脊椎動(dòng)物機(jī)體內(nèi)強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)可將入侵的微生物清除，但是對(duì)于血液循環(huán)不能到達(dá)的部位(眼睛或皮膚表面)和沒有強(qiáng)大免疫系統(tǒng)的無脊椎動(dòng)物，這種防御功能主要依賴體表存在的抗菌小分子[1]，這些小分子即是抗菌肽。

抗菌肽，又稱宿主防御肽(host defense peptides)，原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的小分子肽。世界上第一個(gè)抗菌肽由瑞典科學(xué)家G.Boman等在1980年研究北美天蠶的免疫機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，他們將大腸埃希菌注射到北美天蠶滯育蛹后發(fā)現(xiàn)其血液淋巴細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生具有抑菌作用的多肽物質(zhì)，命名為Cecropins[2]。隨后抗菌肽的來源不斷被擴(kuò)充，至今人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2 700多種抗菌肽，來源于細(xì)菌、古細(xì)菌、原生生物、真菌、植物和動(dòng)物等[3]。宿主防御肽在結(jié)構(gòu)上具有兩親性，分子量一般在2 000～7 000 Da，主要由20～60個(gè)氨基酸殘基組成，當(dāng)處于pH值為7.4的生理環(huán)境中時(shí)，其大部分凈正電荷為+2～+9，因此，也稱作陽離子宿主防御肽[4]。

人體抗菌肽主要分為Defensins家族(α-defensins和β-defensins)、Cathelicidin家族(hCAP-18/LL-37)和組蛋白家族三大類[5]。Cathelicidins是一個(gè)哺乳動(dòng)物抗菌肽家族，主要來源于靈長(zhǎng)類、有蹄類和嚙齒動(dòng)物[6]的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及皮膚、腸道、呼吸道和眼表的上皮細(xì)胞[7]。Cathelicidins家族的抗菌肽包含一個(gè)C-端陽離子的抗菌結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域只有在整個(gè)肽的N-端“cathelin”部分被釋放后才具有活性。LL-37是在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一1種屬于Cathelicidins家族的抗菌肽，該抗菌肽是由其前體蛋白hCAP-18的C-端斷裂釋放產(chǎn)生的37個(gè)氨基酸的小分子肽[8]。

1 LL-37的表達(dá)與結(jié)構(gòu)

LL-37由CAMP基因編碼的前體蛋白hCAP-18產(chǎn)生，分為信號(hào)肽部分、Cathelin結(jié)構(gòu)域和活性肽部分。hCAP-18基因位于3號(hào)染色體，長(zhǎng)1 963 bp，由4個(gè)外顯子組成[9]，外顯子1、外顯子2和外顯子3編碼信號(hào)肽部分和Cathelin結(jié)構(gòu)域部分，外顯子4編碼活性肽部分；LL-37的N-端為信號(hào)肽部分，由30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，主要指導(dǎo)活性肽部分的釋放，中間的Cathelin結(jié)構(gòu)域部分由101個(gè)氨基酸殘基組成，而C-末端的活性肽部分由37個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，序列為L(zhǎng)LGFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES[10]。前體hCAP-18切除信號(hào)肽后，剩余部分主要以顆粒蛋白的形式儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞或上皮細(xì)胞中，活性成分LL-37的釋放還需要絲氨酸蛋白酶3將Cathelin結(jié)構(gòu)域部分切除[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，在激活的中性粒細(xì)胞胞膜上可以檢測(cè)出大量的hCAP-18富集，因此LL-37的釋放主要發(fā)生在細(xì)胞膜表層。

LL-37在不同溶液中存在形式不相同，在純水中呈現(xiàn)二級(jí)無序結(jié)構(gòu)并形成低聚物[13]，但在脂質(zhì)模型、膠束溶液和離子溶液中(如碳酸氫鹽、硫酸鹽和氯化物鹽)中為α-螺旋結(jié)構(gòu)[10]，研究[13]表明α-螺旋結(jié)構(gòu)可更有效的殺菌。雖然LL-37被認(rèn)為是人類來源的唯一Cathelicidins家族抗菌肽，但是經(jīng)過不同蛋白酶對(duì)其不同位點(diǎn)進(jìn)行水解切割會(huì)產(chǎn)生不同的小分子肽產(chǎn)物(如LL-8、SK29、LL-25和LL-15等)，這些小分子肽產(chǎn)物也具有較強(qiáng)的殺菌能力，LL-25的殺菌活性比LL-37更強(qiáng)，但是失去了LL-37的免疫調(diào)節(jié)功能[14]。

2 LL-37的組織/細(xì)胞來源

LL-37最初發(fā)現(xiàn)于人的白細(xì)胞和睪丸中[15]，隨后在其他細(xì)胞、組織和體液中也相繼被發(fā)現(xiàn)，見表1。LL-37主要以前體hCAP-18顆粒蛋白的形式儲(chǔ)存在溶酶體相關(guān)細(xì)胞器中[16]，以便能夠在機(jī)體受損時(shí)快速運(yùn)轉(zhuǎn)到病灶處。LL-37主要由宿主細(xì)胞受病原激活而產(chǎn)生，也會(huì)受其他信號(hào)通路的調(diào)控激活。研究[17]發(fā)現(xiàn)在A型鏈球菌侵襲皮膚時(shí)，真皮中的肥大細(xì)胞通過脫顆粒釋放LL-37來抑制A型鏈球菌的感染；而肺炎鏈球菌在人角膜細(xì)胞中可通過激活轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)進(jìn)而增加LL-37的表達(dá)以抵抗肺炎鏈球菌在角膜的定植[18]。

表1 LL-37表達(dá)分布匯總

3 LL-37的抗微生物活性及微生物的抗性研究

最初LL-37的生物學(xué)研究重點(diǎn)是其抗菌活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)菌和真菌等病原微生物均具有廣譜的抗菌活性，并且對(duì)不同的微生物物種有不同的殺菌活性。

3.1 LL-37的抗細(xì)菌活性 LL-37對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有很好的抗菌活性：對(duì)革蘭陰性菌中的大腸埃希菌等[39-41]有較好殺菌作用；對(duì)革蘭陽性菌中的金黃色葡萄球菌[40]和肺炎鏈球菌[17]等亦有抗菌活性，但對(duì)糞腸球菌[39]無作用。LL-37對(duì)細(xì)菌的抗菌活性與細(xì)菌的細(xì)胞壁成分密切相關(guān)，革蘭陰性菌細(xì)胞壁含有大量的脂多糖(LPS)，革蘭陽性菌細(xì)胞壁外則包被大量的脂磷壁酸，兩者均帶負(fù)電荷，而屬于陽離子宿主防御肽的LL-37帶正電荷，極易與細(xì)菌細(xì)胞壁上帶負(fù)電的脂磷壁酸或LPS相結(jié)合，細(xì)胞壁被破壞導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外流和細(xì)胞壁解體，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[8]。

隨著抗菌藥物的大量使用，細(xì)菌通過自身進(jìn)化來抵抗藥物的殺滅作用，對(duì)絕大部分的抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性。由于與抗菌藥物的抗菌機(jī)制不同，LL-37除對(duì)敏感菌株有活性，對(duì)部分抗菌藥物耐藥菌株也具有較強(qiáng)的活性，研究[42-43]發(fā)現(xiàn)LL-37對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和多重耐藥銅綠假單胞菌有很強(qiáng)的抗菌活性；LL-37單獨(dú)使用對(duì)敏感菌株和正常菌株均有較好的抗菌活性，且在聯(lián)合一些藥物使用后殺菌活性更強(qiáng)，研究[44]表明LL-37聯(lián)合反式小分子抑制劑KKL-40可以更容易殺滅金黃色葡萄球菌，聯(lián)合阿奇霉素對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等均具有有效殺滅作用[45]。生物膜的形成是細(xì)菌重要的耐藥機(jī)制，細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白等將自身包繞在其中而形成大量細(xì)菌聚集膜樣物。生物膜一旦形成，對(duì)外來抗菌藥物及機(jī)體自身免疫力有著天然的抵抗能力，抗菌藥物只能殺滅生物膜表面附著細(xì)菌或者游離細(xì)菌，而難以清除生物膜包裹中的細(xì)菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，生物膜中存活的細(xì)菌又釋放出來，引起再次感染。LL-37不僅可以殺滅游離的細(xì)菌，對(duì)已形成生物膜的細(xì)菌也具有殺菌作用，能通過有效地結(jié)合LPS與脂磷壁酸來達(dá)到對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制和抗生物膜特性[46]，Koppen等[47]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌中的dltABCD操縱子和mprF基因?qū)L-37具有抗性，單獨(dú)使用時(shí)需要較高濃度，但是聯(lián)合替考拉寧時(shí)只需較低劑量便可達(dá)到破壞金黃色葡萄球菌生物膜的作用。

3.2 細(xì)菌對(duì)LL-37的抗性 雖然LL-37可以有效對(duì)抗耐藥細(xì)菌，但也有研究發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌已進(jìn)化獲得一些抵抗LL-37作用的機(jī)制。研究[48]發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌進(jìn)化獲得一個(gè)由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BceAB)和一個(gè)由四基因操縱子編碼的雙組分系統(tǒng)(BceRS)組成的四組分系統(tǒng)(BceABRS)，該系統(tǒng)可使變形鏈球菌對(duì)LL-37產(chǎn)生抗性；當(dāng)LL-37作用豬鏈球菌后會(huì)上調(diào)該菌中的半胱氨酸蛋白酶(APDS)的表達(dá)，該酶可以快速水解LL-37，減輕其對(duì)豬鏈球菌的殺菌活性并鈍化宿主固有免疫，進(jìn)而減弱對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化性，并抑制中性粒細(xì)胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps, NETs)的形成，使該菌免于被NETs殺滅[49]；出血性大腸埃希菌會(huì)激活協(xié)同響應(yīng)丁酸鹽和LL-37的毒力基因，使OmpT蛋白酶表達(dá)上升，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)菌外膜囊泡對(duì)抗LL-37[50]；銅綠假單胞菌中的Mla系統(tǒng)可以維持外膜完整性，其中的vacJ基因可以改變宿主對(duì)銅綠假單胞菌敏感性以抵抗LL-37的抗菌作用[51]；在慢性銅綠假單胞菌感染疾病中，銅綠假單胞菌會(huì)變異成皺紋小菌落變異株，促進(jìn)吞噬逃逸和增強(qiáng)對(duì)LL-37的耐受性[52]，還會(huì)變異成黏液變異株，產(chǎn)生過量的胞外多糖海藻酸鹽抵抗LL-37的殺傷[53]。

3.3 LL-37的抗真菌活性 LL-37除對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)真菌也有抑菌殺菌作用。LL-37抗真菌的研究以白念珠菌為主，體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LL-37可以在低鹽20% mDixon培養(yǎng)基(pH5.5)中殺滅白念珠菌[54]，對(duì)其形成生物膜有一定抑制作用[46]。原代人口腔黏膜細(xì)胞在IL-17a誘導(dǎo)下會(huì)分泌LL-37來抵抗白念珠菌感染[55]；共生厭氧細(xì)菌(特別是梭狀芽孢桿菌Ⅵ簇、ⅪⅤa簇和擬桿菌)通過激活HIF-1α誘導(dǎo)LL-37的表達(dá)，進(jìn)而抑制白念珠菌在腸道的定植[56]。

真菌為真核生物，且真菌的細(xì)胞壁和細(xì)菌的細(xì)胞壁在結(jié)構(gòu)、組分和厚度上有很大的不同，因此LL-37與真菌的作用方式和細(xì)菌有很大不同。真菌細(xì)胞壁主要由兩性碳水化合物和少量蛋白或者糖蛋白構(gòu)成，使真菌細(xì)胞壁帶負(fù)電荷量比細(xì)菌細(xì)胞壁的少；且真菌細(xì)胞壁含有大量的幾丁質(zhì)和葡聚糖，厚度可達(dá)100～200 nm，而細(xì)菌的細(xì)胞壁僅8 nm左右。因此，LL-37不易結(jié)合在真菌的細(xì)胞壁上，也不可能直接在上面“打孔”。Ordonez等[53]發(fā)現(xiàn)在低濃度的LL-37環(huán)境中，LL-37會(huì)使白念珠菌的胞壁通透性增加，使其內(nèi)部液泡擴(kuò)張以達(dá)到殺滅白念珠菌的效果；研究[57-59]發(fā)現(xiàn)LL-37會(huì)使白念珠菌的胞壁完整性發(fā)生變化，還影響白念珠菌的轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)及應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)，具體機(jī)制有：(1)LL-37可以通過與白念珠菌細(xì)胞壁主要成分甘露聚糖的優(yōu)先結(jié)合和部分與甘露聚糖層的甲殼素或葡聚糖的結(jié)合來介導(dǎo)白念珠菌對(duì)細(xì)胞的黏附和聚集；(2)LL-37還會(huì)降低白念珠菌細(xì)胞壁成分β-1，3葡聚糖外切酶Xog1p的活性，從而中斷細(xì)胞壁的重塑來抑制白念珠菌的生長(zhǎng)。

3.4 真菌對(duì)LL-37的抗性 如前所述，部分細(xì)菌種類已經(jīng)針對(duì)LL-37產(chǎn)生了多種抗性機(jī)制，真菌也同樣進(jìn)化獲得一些獨(dú)有的自我保護(hù)機(jī)制。當(dāng)LL-37與白念珠菌相互作用時(shí)，白念珠菌會(huì)脫落自身質(zhì)膜上感受性蛋白Msb2的糖基化蛋白片段，使其與LL-37結(jié)合從而保護(hù)白念珠菌不受LL-37的影響[60-61]；白念珠菌還可以有效的利用天冬氨酸蛋白酶剪切LL-37以破壞其抗菌和免疫調(diào)節(jié)特性[14]。

4 LL-37的免疫調(diào)節(jié)功能

研究[62]發(fā)現(xiàn)LL-37除擁有直接抗菌作用以外，還具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能。在2型糖尿病創(chuàng)面愈合不良患者中，使用大環(huán)內(nèi)酯類的克拉霉素可以上調(diào)LL-37在NETs的表達(dá)，增強(qiáng)患者抗菌能力以促進(jìn)傷口愈合，改善疾病預(yù)后；LL-37是角質(zhì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子來增強(qiáng)其抗真菌作用[63]。研究[64]還發(fā)現(xiàn)LL-37既可以發(fā)揮炎癥誘導(dǎo)劑的作用，也可作為抗炎介質(zhì)發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用：Choi等[65]發(fā)現(xiàn)，LL-37可以促進(jìn)抗炎因子IL-IRA的產(chǎn)生，并通過誘導(dǎo)MKP-1的磷酸化來抑制IL-32誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；而Beaumont等[66]則發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌肺炎中，外源性LL-37在沒有直接殺菌活性的情況下，可以引起促炎反應(yīng)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞將銅綠假單胞菌從肺中清除。LL-37在非特異性和特異性免疫反應(yīng)中均扮演重要角色，具有趨化不同免疫細(xì)胞的作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)LL-37可以趨化中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T細(xì)胞[8]； LL-37除了可以趨化細(xì)胞外，還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化成具有促炎特征的M1型細(xì)胞[67]；樹突狀細(xì)胞在體外經(jīng)LL-37誘導(dǎo)后，可以顯著上調(diào)吞噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)Th1應(yīng)答并釋放相關(guān)炎癥因子[68]。

5 展望

抗菌藥物耐藥性是一個(gè)全球性的挑戰(zhàn)，自從1940年青霉素被發(fā)現(xiàn)后，耐藥性的產(chǎn)生也隨之而來。據(jù)統(tǒng)計(jì)，耐藥菌感染在全球造成至少70萬人死亡。隨著抗菌藥物和糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，臨床耐藥率也明顯上升，且耐藥株突變迅速。耐藥性的產(chǎn)生降低了藥物的有效性，增加感染性疾病的發(fā)病率和患者病死率，對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅[69]。人們不斷尋找新的抗菌藥物和結(jié)構(gòu)修飾藥物來對(duì)抗耐藥性，但是新的抗菌藥物研發(fā)進(jìn)程愈發(fā)困難[70]，因此，健康可持續(xù)發(fā)展的新型抗菌藥物是全球應(yīng)對(duì)抗菌藥物耐藥的關(guān)鍵?？咕氖侨梭w天然免疫的重要組成部分，現(xiàn)在已從不同的人體組織中分析鑒定出100多個(gè)這樣的抗菌肽，人類Cathecilindin家族LL-37研究最為深入，且LL-37和其衍生物抗微生物活性較好，這些小分子肽具有良好的溶解度、藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度，主要通過“膜破壞”機(jī)制來殺傷細(xì)胞，具有毒性低、與細(xì)胞作用時(shí)間短、不通過受體發(fā)揮作用的特點(diǎn)，大大減少了被微生物識(shí)別的情況，進(jìn)而不容易產(chǎn)生耐受性，可以開發(fā)成新型的抗菌藥物在醫(yī)藥行業(yè)具有很好的應(yīng)用前景[71]。但是依舊存在一些問題：①藥效動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)及潛在免疫毒性問題；②分子量小，分離純化困難且容易降解；③天然資源有限，化學(xué)和基因工程合成則成本高、生產(chǎn)效率低；④與傳統(tǒng)抗菌藥物相比較，有部分抗菌肽衍生物活性還不夠理想。但是值得注意的是現(xiàn)在對(duì)其進(jìn)行修飾使其性質(zhì)更佳的報(bào)道也愈來愈多，在醫(yī)藥行業(yè)具有很大的潛力。