猩紅熱患兒A 族鏈球菌emm基因分型及地域與毒力基因分布相關(guān)研究

禹定樂(lè)，梁云梅，盧清華，馬耀玲，沈敘莊，王傳清，鄭躍杰，楊永弘,

(1. 深圳市兒童醫(yī)院呼吸科，廣東 深圳 518038； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院兒科，北京 100043； 3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院急診科，湖北 武漢 430000； 4. 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 北京市兒科研究所微生物研究室，北京 100045； 5. 上海復(fù)旦大學(xué)附屬兒童醫(yī)院細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室，上海 201102)

A族鏈球菌(group AStreptococcus, GAS)又稱(chēng)為釀膿鏈球菌或化膿性鏈球菌，作為一種重要的人類(lèi)病原體，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，與多種疾病有關(guān)，如咽扁桃體炎、敗血癥、壞死性筋膜炎、蜂窩織炎、腦膜炎、鏈球菌感染后腎小球腎炎和風(fēng)濕性心臟病等多種疾病[1]。上呼吸道黏膜和皮膚上皮是GAS的主要定植區(qū)域[2]。我國(guó)乙類(lèi)法定傳染病—猩紅熱即是由GAS引起的5～15歲兒童常見(jiàn)的急性呼吸道傳染病，臨床上以發(fā)熱、咽峽炎及皮疹為典型癥狀，嚴(yán)重者可引起鏈球菌中毒休克綜合征(STSS)等侵襲性感染，甚至死亡[3-4]。近些年，猩紅熱在世界范圍內(nèi)卷土重來(lái)[5-8]，加之仍無(wú)可上市使用的疫苗，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。而猩紅熱“再現(xiàn)”的原因尚未完全明確，推測(cè)與GAS遺傳變異，產(chǎn)生新的感染性更強(qiáng)、致病力更高的GAS菌株或克隆群有關(guān)[9]。分型是微生物流行病學(xué)研究的重要方法。毒力因子在微生物致病性中起著關(guān)鍵作用[10]。超抗原是由GAS合成分泌的細(xì)胞外毒力因子蛋白，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子釋放和免疫反應(yīng)，從而引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀[11]。GAS毒力因子分布與其emm基因分型和流行的地域之間存在密切的關(guān)系[12-13]，但國(guó)內(nèi)尚未充分重視菌株流行地域?qū)AS毒力因子和emm基因型分布的影響。本研究分析北京和上海兩地區(qū)猩紅熱患兒所攜帶的emm1.0型和emm12.0型GAS菌株超抗原基因分布、emm分型及其流行地域，比較超抗原、emm分型與地域之間的關(guān)系，為指導(dǎo)GAS疾病尤其是猩紅熱的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 GAS菌株分離自2007年在北京和上海兩所兒童專(zhuān)科醫(yī)院門(mén)診就診的猩紅熱患兒咽拭子標(biāo)本，標(biāo)本采集后常溫下2 h內(nèi)送至微生物研究室。本研究納入的猩紅熱患兒均無(wú)猩紅熱相關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥及死亡情況。

1.2 菌株分離與鑒定 咽拭子標(biāo)本采集后常溫下2 h內(nèi)送至微生物研究室，微生物研究室收到咽拭子標(biāo)本后立即接種于含5%脫纖維羊血的胰酶瓊脂(TRYPTIC SOY AGAR, TSA)平皿上，于含5%CO2的恒溫孵育箱中37℃條件下孵育18～24 h。根據(jù)TSA血平皿中菌落的形態(tài)及β溶血環(huán)對(duì)標(biāo)本初篩，應(yīng)用英國(guó)OXOID公司的鏈球菌分群診斷試劑盒進(jìn)行GAS菌株鑒定。經(jīng)分離與鑒定后的GAS菌株收集到凍存管中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取 按照北京生工生物工程公司DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4emm基因分型 采用美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)(https://www2a.cdc.gov/ncidod/ biotech/strepblast.asp)的方法，對(duì)GAS分離株進(jìn)行emm分型檢測(cè)。將擴(kuò)增合格的產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行一代測(cè)序。將獲得的5’端可變區(qū)序列上傳至CDC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www2.cdc.gov/vaccines/biotech/strepblast.asp)，進(jìn)行emm基因序列同源性比較，確定emm基因分型。

1.5 種毒力基因檢測(cè) 通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增11種超抗原(speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、speM、ssa和smeZ)，以及2種既往被誤認(rèn)為超抗原，目前常常和超抗原一起被研究的毒力因子蛋白—鏈球菌半胱氨酸蛋白酶(streptococcalcysteine proteinase,speB)和有絲分裂因子(mitogenic factor,speF)基因。PCR反應(yīng)混合物體系(25 μL)包含20 mmol DNA模板1 μL，10 mmol上、下游引物各1 μL(由廣州生工生物技術(shù)有限公司合成)，12.5 μL的Taq PCR Mix和9.5 μL雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性1 min，退火30 s(溫度為每個(gè)引物相應(yīng)的退火溫度)，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。毒力因子基因的引物序列參照文獻(xiàn)報(bào)道[14]。取PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物5 μL，并在含有GoldView核酸染色劑(購(gòu)自廣州生工生物技術(shù)有限公司)的1.5%瓊脂糖凝膠上，0.5×TAE緩沖液中，120 V條件下進(jìn)行電泳分離30 min，然后進(jìn)行可視化和圖像采集。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney U test統(tǒng)計(jì)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)114株GAS菌株進(jìn)行emm分型，其中emm1.0型 60株，emm12.0型54株；52株分離自北京(emm1.0型31株，emm12.0型21株)，62株分離自上海(emm1.0型29株，emm12.0型33株)。GAS菌株speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、ssa和smeZ超抗原基因攜帶率分別為52.6%、76.3%、80.7%、43.9%、55.3%、57.0%、75.4%、97.4%、93.0%，speB和speF超抗原基因攜帶率均為98.2%，未檢出speL、speM超抗原基因。見(jiàn)表1。

表1 北京和上海地區(qū)不同emm型GAS菌株超抗原基因攜帶情況[株(%)]

2.2 北京、上海地區(qū)不同emm型GAS菌株超抗原基因攜帶情況 北京地區(qū)：emm1.0型、emm12.0型GAS菌株4種(speA、speH、speI和speJ)超抗原基因攜帶率各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其他毒力基因比較均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；上海地區(qū)：emm1.0型、emm12.0型GAS菌株5種(speA、speH、speI、speJ和speK)超抗原基因攜帶率各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其他毒力基因比較，均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 北京、上海地區(qū)不同emm型GAS菌株超抗原基因攜帶情況比較

2.3emm1.0、emm12.0型GAS菌株不同地區(qū)超抗原基因攜帶情況 北京與上海來(lái)源的emm1.0型GAS菌株speC、speH、speJ和speK超抗原基因攜帶率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；北京與上海來(lái)源的emm12.0型GAS菌株speC、speH、speI、speJ和speK超抗原基因攜帶率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 emm1.0、emm12.0型GAS菌株不同地區(qū)超抗原基因攜帶情況比較

3 討論

GAS可引起多種臨床表現(xiàn)，從輕度局部感染到危及生命的侵襲性感染，對(duì)公共衛(wèi)生產(chǎn)生重大影響。GAS感染是兒童患病和死亡的主要原因[15]。2011年在中國(guó)香港暴發(fā)的猩紅熱事件中，多例患兒出現(xiàn)STSS、敗血癥、咽后壁膿腫等并發(fā)癥，且有2例并發(fā)STSS患兒死亡[3]。兒童猩紅熱為GAS所致疾病中最常見(jiàn)的病種之一，具有傳染性，易引起暴發(fā)流行，且接觸過(guò)猩紅熱患者的家庭成員患侵襲性GAS感染的風(fēng)險(xiǎn)增加[4]。在過(guò)去的十余年中，猩紅熱在亞洲、歐洲多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)嚴(yán)峻的“再現(xiàn)”現(xiàn)象[5-7]，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。中國(guó)GAS的整體流行趨勢(shì)和歐美國(guó)家一致，2008—2017年中國(guó)6 ～ 22歲群體患猩紅熱病例數(shù)翻了一番[16]，但在分析中國(guó)研究數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)考慮地域因素，中國(guó)幅員遼闊，擁有34個(gè)省級(jí)行政區(qū)，猩紅熱發(fā)病率的區(qū)域性數(shù)據(jù)與整體數(shù)據(jù)之間會(huì)略有差異，如2011—2015年上海地區(qū)猩紅熱年發(fā)病率為7.5～19.4/10萬(wàn)人口[17]，遠(yuǎn)高于2011—2016年全國(guó)平均水平(4.1/10萬(wàn))[18]。猩紅熱是細(xì)菌感染性疾病研究的熱點(diǎn)課題，關(guān)注、研究和防控兒童感染GAS導(dǎo)致的猩紅熱成為降低兒童感染性疾病發(fā)生、發(fā)展及降低兒童死亡率的重點(diǎn)。

GAS作為具有全球重要性的人類(lèi)特異性細(xì)菌病原體，具有多種分型方法，可以分泌多種毒力因子。emm基因分型是目前全世界公認(rèn)的GAS分型的現(xiàn)代分子方法，是基于對(duì)指示M血清型的emm基因進(jìn)行的序列分析。不同年代及地區(qū)流行的GAS有不同的emm型別。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，1993—1994年中國(guó)大陸流行的GAS型別依次為M3.1、M1、M4和M12，2005—2006年M12和M1成為最流行型別[19]。本研究數(shù)據(jù)顯示，雖然emm1型和emm12型是2007年北京和上海兩地區(qū)導(dǎo)致兒童猩紅熱的主要GAS菌株克隆群，但北京地區(qū)以emm1型位居首位，上海地區(qū)則是emm12型。在2011年猩紅熱暴發(fā)期間，北京地區(qū)流行的首位GAS菌株emm型別卻為emm12型(76.4%)[20]。且自2012年開(kāi)始，北京地區(qū)emm1型GAS菌株數(shù)量開(kāi)始上升，并于2013—2014年超過(guò)emm12型，再次成為北京地區(qū)首位GAS菌株流行克隆群，直至2018年[21]。自2011年開(kāi)始，上海地區(qū)導(dǎo)致15歲以下兒童發(fā)生猩紅熱的emm1型GAS分離株數(shù)量呈上升趨勢(shì)，在2014年達(dá)到頂峰，于2015年趨于下降，但最終沒(méi)能超越emm12型成為上海首位流行克隆群[17]。2011—2018年國(guó)家疾病預(yù)防控制中心整體數(shù)據(jù)顯示，emm12型是我國(guó)猩紅熱流行的主要型別[22-23]。上述數(shù)據(jù)證實(shí)，GAS流行emm型別具有時(shí)間和地域的差異性，北京地區(qū)GAS菌株的emm型別波動(dòng)性高于上海地區(qū)。

鏈球菌毒力因子在GAS感染的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。目前常見(jiàn)的鏈球菌毒力因子包括11種高效促細(xì)胞分裂原(speA、C、G、H、I、J、K、L、M、smeZ和ssa)和兩種蛋白質(zhì)(speB[24]和speF[25])。超抗原基因的分布在不同emm基因分型之間存在很大差異[12, 26]。本研究結(jié)果顯示，在emm1.0型和emm12.0型GAS菌株之間，無(wú)論是北京地區(qū)，還是上海地區(qū)，speA、speH、speI和speJ的攜帶率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。本研究中北京地區(qū)GAS菌株的分析結(jié)果與2012—2013年[27]及2015—2017年[28]北京地區(qū)GAS菌株超抗原的攜帶特點(diǎn)一致，但上海地區(qū)GAS菌株的分析結(jié)果與同期北京地區(qū)GAS菌株超抗原的攜帶特點(diǎn)存在差別，也不同于2012—2016年天津地區(qū)GAS菌株超抗原的攜帶特點(diǎn)[29]，GAS菌株獲取年代、地域也可能影響其超抗原基因的分布。

GAS超抗原基因的分布不僅與其克隆流行的地域密切相關(guān)，還與疾病種類(lèi)密切相關(guān)[30]。本次猩紅熱單病種(為排除疾病病種因素對(duì)結(jié)論的影響)兩地區(qū)研究結(jié)果表明，北京與上海GAS菌株之間，emm1.0型菌株中speC、speH、speJ和speK攜帶率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在emm12.0型GAS菌株中，此種差異發(fā)生在speC、speH、speI、speJ和speK基因中。在emm1.0與emm12.0型GAS菌株之間，北京地區(qū)GAS菌株speA、speH、speI和speJ攜帶率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而上海地區(qū)GAS菌株speA、speH、speI、speJ和speK攜帶率比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明不同地理位置GAS毒力基因分布存在差異。

本文不足之處在于，既往研究表明時(shí)間遷移可影響GAS毒力因子的分布。本研究未對(duì)兩地區(qū)GAS菌株進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，未能體現(xiàn)時(shí)間對(duì)毒力特征的影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同地域及emm基因型GAS菌株毒力因子基因分布狀態(tài)存在差異，此結(jié)論對(duì)猩紅熱的防控及疫苗的研制有一定的理論指導(dǎo)意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

致謝：感謝上海復(fù)旦大學(xué)附屬兒童醫(yī)院王藝教授對(duì)本研究所作出的貢獻(xiàn)。