缺鐵調控植物開花時間機制的初步研究

梁晶晶，夏子怡，彭 鑲，秦 誠

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院植物RNA信號傳導中心，浙江 杭州 311121)

植物的生長發(fā)育需要多種礦質元素，包括大量元素和微量元素，它們以離子或鹽的形式被植物吸收利用[1].鐵作為需求量最大的微量元素，對生物體的生長發(fā)育起重要作用[2].鐵的主要化學性質之一是氧化還原特性，這一特性使鐵成為植物體中多種蛋白和酶不可缺少的成分[3]，如鐵氧還蛋白、細胞色素氧化酶復合體、過氧化物酶、豆血紅蛋白等.由于這些蛋白的活性與鐵的含量有關，因此鐵在植物體的光合作用、呼吸作用、氮素代謝、有機酸代謝等多項生理活動中都發(fā)揮著重要作用[4].

土壤中的總鐵含量較高，但主要以三價鐵的形式存在，在堿性土壤中溶解度低，限制了植物根系對鐵元素的吸收，降低了土壤中的有效鐵含量.雖然植物在長期的進化過程中逐步形成了從土壤中吸收利用鐵的有效機制，但是鐵在植株中的移動性較差，難以從成熟組織向幼嫩組織轉移，必須依賴木質部的轉運.為滿足植株對鐵元素的需求，在植物生長發(fā)育的每個階段都要保證鐵的不斷供應.因此，缺鐵成為常見的營養(yǎng)脅迫因素之一，輕則導致葉片黃化、產量降低，重則導致植株衰亡[5-6].

在自然環(huán)境中，營養(yǎng)逆境等脅迫是植物生長發(fā)育過程中常見的不利條件，為了最大程度地保存后代，許多植物可以通過響應脅迫因素來誘導開花[7].開花是植物從營養(yǎng)階段到生殖階段的重要轉折點，對植物的生存繁衍與生態(tài)適應過程起到重要作用[8].通過對模式植物擬南芥的開花調控研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中超過180個基因與開花的調控是相關的，其中調控開花的關鍵基因包括開花促進基因CONSTANS(CO)、FLOWERINGLOCUST(FT)、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)和開花抑制基因FLOWERINGLOCUSC(FLC)、SHORTVEGETATIVEPHASE(SVP)等[9-10].研究表明，這些基因通過整合各條開花途徑的信號，共同作用調控植物開花.其中FLC整合了來自自主途徑和春化途徑的信號，SVP主要聯(lián)系溫度途徑和赤霉素途徑，CO是光周期途徑的關鍵基因，這些基因調控著下游基因FT、SOC1的表達，精準調控植物開花[11-13].

雖然缺鐵影響植物生長發(fā)育的研究有很多，但涉及缺鐵與開花時間二者之間調控的研究較少，其作用機制尚不完全清楚.本研究通過對野生型擬南芥進行不同濃度的缺鐵處理后發(fā)現(xiàn)，與正常營養(yǎng)條件下生長的擬南芥相比，0.25 μM Fe3+條件下生長的擬南芥早花.通過定量PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，0.25 μM Fe3+條件下生長的擬南芥中FT基因的表達量上升，SVP基因的表達量下降.進一步研究發(fā)現(xiàn)，相應的開花突變體ft-10、svp-41在0.25 μM Fe3+條件下生長與正常營養(yǎng)條件下生長開花時間沒有明顯差異.這些研究結果表明，F(xiàn)T、SVP可能參與調控缺鐵誘導的植物早花.本研究旨在探索缺鐵對植物開花時間的影響，豐富植物開花調控的分子機制，并為指導育種實踐提供重要的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究使用的擬南芥材料為野生型(Col)和開花關鍵基因突變體(ft-10、co-9、soc1-2、flc-3、svp-41).

1.2 實驗方法

1.2.1 生長條件

將消毒后的擬南芥種子鋪在濕潤的濾紙上，置于4 ℃冰箱破休眠2—3 d.取種子點于0.5 mL離心管蓋的瓊脂糖表面，轉入營養(yǎng)液中培養(yǎng).擬南芥的生長在人工氣候室中進行，人工氣候室條件為：恒溫23 ℃，光照時間/黑暗時間為16 h / 8 h，光照強度為12 000 Lux.

本研究采用水培系統(tǒng)，營養(yǎng)液以1/2 Hoagland配方為基礎，并略加修改[14].以鐵元素含量為12.5 μM的營養(yǎng)液配方為參照，設置3個缺鐵濃度：1.25 μM、0.625 μM和0.25 μM.

1.2.2 缺鐵處理

本研究采用的缺鐵處理方法如下：破休眠后的野生型擬南芥種子點種完畢后分別培養(yǎng)于不同濃度梯度的缺鐵營養(yǎng)液中.培養(yǎng)期間每周更換一次營養(yǎng)液.

1.2.3 開花表型

統(tǒng)計擬南芥開第一朵花時的蓮座葉數(shù)量.

1.2.4 基因表達量分析

野生型擬南芥幼苗培養(yǎng)至第9天時，剪取各處理條件下5株生長狀況一致的幼苗放入1.5 mL離心管中，液氮中冷卻后保存至-80℃冰箱.利用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取葉片總RNA，隨后根據(jù)FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix的反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄合成cDNA第一條鏈.選取開花關鍵基因FT、CO、SOC1、FLC、SVP和內參基因Tubulin的特異性引物，利用Ultra SYBR Mixture(中國北京康為)進行CFX96實時聚合酶鏈反應，設置3個生物學重復.以Tubulin的表達量為參照，分析各基因的相對表達量.

1.2.5 開花關鍵基因突變體的表型觀察

將野生型擬南芥(Col)和開花關鍵基因突變體(ft-10、co-9、soc1-2、flc-3、svp-41)的種子破休眠后點種，均分為兩份，分別轉入正常營養(yǎng)條件和缺鐵營養(yǎng)條件中生長，觀察開花表型.

1.2.6 統(tǒng)計分析

各數(shù)據(jù)的處理與作圖采用Microsoft Excel軟件.數(shù)據(jù)差異檢測采用Microsoft Excel中的t-test檢測.P<0.05時表示差異顯著.

2 結果與分析

2.1 不同缺鐵條件下野生型擬南芥的開花表型觀察

將野生型擬南芥分別培養(yǎng)于正常營養(yǎng)條件(CK，12.5 μM Fe3+)和不同濃度梯度的缺鐵營養(yǎng)條件(1.25 μM Fe3+、0.625 μM Fe3+和0.25 μM Fe3+)下，結果如圖1所示.在正常營養(yǎng)條件下，野生型擬南芥開花時的蓮座葉為11片左右.3種濃度的缺鐵處理中，1.25 μM Fe3+、0.625 μM Fe3+條件下的擬南芥開花表型與正常營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的擬南芥相比沒有明顯差異，而0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下的擬南芥開花提前，開花時的蓮座葉為8片左右(圖1).

CK表示12.5 μM Fe3+營養(yǎng)條件,-Fe表示3種不同濃度的缺鐵營養(yǎng)條件,Bar=2 cm,誤差線表示標準偏差.(A)開花表型(B)蓮座葉數(shù)目 星號表示在0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下和正常營養(yǎng)條件下擬南芥開花時的蓮座葉數(shù)目差異顯著 (t-test,p<0.05).圖1 不同濃度缺鐵處理的野生型擬南芥開花表型分析Fig.1 Flowering phenotype of wild-type under different concentrations of iron solution

2.2 缺鐵條件下野生型擬南芥開花相關基因的表達檢測

植物在營養(yǎng)逆境條件下調節(jié)開花時間以完成生命周期并繁衍后代，而這些調控方式最終都由基因完成.因此，我們在3種缺鐵濃度中選擇開花表型有明顯差異的濃度(0.25 μM Fe3+)進行下一步研究.以正常營養(yǎng)條件下的野生型擬南芥各基因表達量為參照，分析0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下擬南芥開花關鍵基因的表達變化.

我們首先檢測在0.25 μM Fe3+條件下缺鐵響應關鍵基因的表達.結果顯示，F(xiàn)RO2和IRT1基因表達上升(圖2 A-B)，進一步說明0.25 μM Fe3+條件是缺鐵條件.隨后我們檢測擬南芥開花關鍵基因的表達變化，結果顯示，缺鐵影響野生型擬南芥相關開花關鍵基因的表達(圖2).與正常營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的野生型擬南芥相比，在0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下，野生型擬南芥中FT基因表達量上升，而SVP基因表達量明顯下降，CO、SOC1與FLC基因表達量無明顯差異.

CK表示12.5 μM Fe3+營養(yǎng)條件，-Fe表示0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件，誤差線表示標準偏差，星號表示顯著差異(t-test,p<0.05)，ns表示無顯著差異，3組生物學重復結果一致.圖2 缺鐵營養(yǎng)條件下野生型擬南芥開花關鍵基因表達分析Fig.2 Expression analysis of key flowering genes under iron deficient condition

2.3 缺鐵條件下開花關鍵基因突變體的表型觀察

前期研究結果表明，0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下野生型擬南芥開花時間提前，并且開花關鍵基因FT、SVP表達發(fā)生明顯變化.為進一步驗證缺鐵是否通過影響FT、SVP基因的表達從而誘導擬南芥早花，我們分別在正常營養(yǎng)條件和缺鐵營養(yǎng)條件下，觀察開花關鍵基因突變體ft-10、co-9、soc1-2、flc-3、svp-41的開花表型.

結果顯示，在0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下，co-9、soc1-2、flc-3突變體的開花時間與正常營養(yǎng)條件下相比提前(圖3D—F，圖4D—F)，這些突變體的表型變化與野生型的表型變化一致(圖3A，圖4A).而ft-10、svp-41突變體的開花時間與正常營養(yǎng)條件下相比無明顯變化(圖3B—C，圖4B—C).

CK表示12.5 μM Fe3+營養(yǎng)條件，-Fe表示0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件，Bar=2 cm.圖3 缺鐵營養(yǎng)條件下擬南芥開花基因突變體開花表型Fig.3 Flowering phenotype of flowering-related mutants under iron deficient condition

Col(A)、ft-10(B)、svp-41(C)、co-9(D)、soc1-2(E)、flc-3(F)開花時的蓮座葉數(shù)量.CK表示12.5 μM Fe3+營養(yǎng)條件，-Fe表示0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件，誤差線表示標準偏差，星號表示顯著差異(t-test,p<0.05)，ns表示無顯著差異.圖4 缺鐵營養(yǎng)條件下擬南芥開花基因突變體開花時間Fig.4 Flowering time of flowering-related mutants under iron deficient condition

3 討論

高等植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉變的過程被稱為成花轉變，這一過程受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響[15].目前已知涉及植物開花的關鍵基因包括FT、CO、SOC1、FLC、SVP等，這些開花基因通過光周期、春化、赤霉素、溫度、自主和年齡等遺傳途徑精準調控開花時間[8].各條開花調控途徑既相互獨立又彼此聯(lián)系，其中存在一些開花整合因子，它們匯集多條遺傳途徑，協(xié)同調控開花[13].

鐵作為植物生長發(fā)育過程中不可或缺的微量元素，參與葉綠素合成、呼吸作用、生物固氮等過程[16].由于鐵在土壤中主要以氧化物或氫氧化物的形式存在，植物難以直接利用，因此植物可吸收并利用的鐵含量往往不足，這使得缺鐵成為繼缺氮和缺磷后阻礙植物開花育種的又一大營養(yǎng)逆境因素[17].研究表明，在營養(yǎng)逆境處理下，為成功完成繁衍后代的使命，植物會提早開花，提前結束生命周期，出現(xiàn)“逆境誘導的開花”現(xiàn)象[18].本研究中，與12.5 μM Fe3+條件下培養(yǎng)的擬南芥相比，0.25 μM Fe3+條件下培養(yǎng)的野生型擬南芥蓮座葉數(shù)目減少，開花提前(圖1)，由此可見一定程度的缺鐵會誘導擬南芥提早開花.

檢測野生型擬南芥開花關鍵基因的表達量發(fā)現(xiàn)，在0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下，開花促進基因FT表達量上升(圖2)，開花抑制基因SVP表達量下降(圖2).FT是成花誘導途徑中的開花促進基因，在莖尖通過FT蛋白與FLOWERING LOCUS D(FD)蛋白的相互作用，調控花分生組織特征基因APETALA1(AP1)的轉錄激活，從而促進花的發(fā)育[19].SVP作為開花抑制因子，受光周期途徑和溫度途徑等調控，調節(jié)開花時間.研究表明，SVP編碼的蛋白可以與FT的啟動子CArG片段相結合以阻礙FT表達[20].缺鐵處理后，SVP表達受到抑制，使得下游靶基因FT表達水平上升，促進植物開花.

缺鐵處理后，野生型擬南芥中FT和SVP基因的表達量出現(xiàn)明顯變化，而FLC、CO、SOC1的表達無顯著差異.隨后在缺鐵條件下觀察開花關鍵基因突變體后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T、SVP基因突變后，其相應突變體植株ft-10、svp-41在0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下均無早花現(xiàn)象，這與0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下野生型擬南芥開花提前的表型不同，這表明FT和SVP可能參與0.25 μM Fe3+誘導野生型擬南芥早花這一過程.因此在0.25 μM Fe3+營養(yǎng)條件下，突變體ft-10和svp-41無法感知并響應缺鐵誘導產生的信號，植株就不發(fā)生早花應答.而FLC、CO、SOC1相關突變體flc-3、co-9和soc1-2在缺鐵處理后提早開花，與野生型開花表型相同，說明FLC、CO、SOC1可能不參與缺鐵誘導植物早花.上述結果與開花基因表達變化結果一致，進一步證明了缺鐵可能是通過調控FT和SVP基因表達，從而誘導植物早花.

本研究表明，一定程度的缺鐵誘導植物早花，可能是通過調控FT和SVP基因的表達實現(xiàn)的.這為揭示缺鐵調控植物開花時間的機制提供新的研究方向，為后期進一步研究植物開花時間的機制奠定了基礎.