益生菌在馬屬動物中的應(yīng)用及研究進展

張建強，蘇少鋒，，陶金山，吳海青，趙俊利，趙啟南，翠 芳，程 超，李雅靜，芒 來，趙一萍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測實驗站/內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動物研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.阿魯科爾沁旗動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 阿魯科爾沁旗 025550；4.集寧師范學(xué)院，內(nèi)蒙古 集寧 012000）

馬是單胃非反芻草食性動物，具有較發(fā)達的后腸（盲腸、結(jié)腸和直腸），腸道內(nèi)有極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，尤其是盲腸內(nèi)微生物菌群多樣性和豐富度最高，包含多種原生生物、古細菌、真菌、細菌等［1-6］。馬靠后腸內(nèi)的原生生物和微生物降解碳水化合物產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）為機體提供能量［7］，因此，馬后腸有“發(fā)酵罐”之稱。

許多馬胃腸道疾病的發(fā)生可能與胃腸道內(nèi)微生物群組成或功能的改變有關(guān)，馬常見疾病，如腸梗阻、腸炎等與腸道菌群密切相關(guān)［8-10］。 菌群的平衡和穩(wěn)定對維持胃腸道健康具有重要意義。 益生菌能夠提高宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率， 改善其生長性能，對維持胃腸道菌群平衡、凈化腸道微生物環(huán)境、 保證腸道健康及調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)有重要作用。隨著2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告的發(fā)布，要求自2020 年禁止飼料企業(yè)生產(chǎn)及銷售含有抗生長素類（中藥類除外）的商品飼料，因此，飼料行業(yè)的全面禁抗時代已經(jīng)來臨［11］，替抗產(chǎn)品的研發(fā)成為熱點。 益生菌具有安全性高、無殘留、無耐藥等特點， 作為一類抗生素替代品應(yīng)用于馬的飼料添加劑和馬獸藥生產(chǎn)， 對促進現(xiàn)代養(yǎng)馬業(yè)的健康、綠色、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。 筆者對益生菌及相關(guān)活性物質(zhì)的作用機理及馬用益生菌產(chǎn)品存在的問題和應(yīng)用前景進行綜述， 旨在為馬用益生菌產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 益生菌的概念

1.1 益生菌的定義和發(fā)展

益生菌（probiotics）是可以添加到飲食中改善腸道環(huán)境（特別是微生物區(qū)系平衡）的活微生物，在希臘語中意為“對生命有益”，其定義為人類或動物攝入后對宿主有正面效應(yīng)的微生物。 早在1892 年，德國學(xué)者Doderlein 就已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)乳酸的微生物對生物體有益［12］；1908 年，Elie 發(fā)現(xiàn)飲用酸奶的保加利亞人較長壽，并在其著作《Prolongation of Life》中系統(tǒng)闡述了該觀點，提出了“益生菌”這一概念［13］；1965 年，Lilly 等［14］在《Science》雜 志 中首次使用“probiotic”一詞并將其定義為由一種微生物產(chǎn)生的， 可以促進另一種微生物生長的物質(zhì)；1989 年，Roy 提出新的概念，益生菌是一種活的微生物補充劑，可以對宿主產(chǎn)生益處［15］；聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織于2002 年與世界衛(wèi)生組織共同起草了《食品益生菌評價指南》，將益生菌定義為活的微生物， 當宿主攝入足夠的量會得到某種健康益處［16-17］。 目前，益生菌已成為全球發(fā)展最快的人類膳食補充劑和動物飼料添加劑［18］。

1.2 益生菌的分類及應(yīng)用

根據(jù)菌種的不同， 益生菌可以分為芽孢桿菌類、腸球菌類、乳酸菌類、大腸桿菌類、霉菌類、酵母菌類、放線菌類，應(yīng)用最廣泛的是乳酸菌類、酵母菌類和芽孢桿菌類； 根據(jù)產(chǎn)品可分為單一菌種產(chǎn)品和混合菌種產(chǎn)品。 美國食品與藥品監(jiān)督管理局和美國飼料管理協(xié)會公布的可以直接飼喂且安全的菌種有43 種；在歐洲市場上的益生菌產(chǎn)品已有50 多種；列入我國《飼料添加劑品種目錄》的有地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、 雙歧桿菌（Bifidobacterium）、酵母等35 種微生物，適用范圍為養(yǎng)殖動物、青貯飼料等。

1.3 益生元、合生元和后生元的發(fā)展

隨著益生菌產(chǎn)品的不斷發(fā)展， 人們又提出了益生元、合生元和后生元等概念。 1995 年，Gibson提出了益生元的概念；2004 年，Gibson 等將益生元（prebiotics）定義為一種不能被吸收消化，但能有選擇地促進宿主機體內(nèi)有益微生物的代謝和增殖，改善宿主健康的有機物質(zhì)。益生元是一種膳食補充劑，包括特定益生菌發(fā)酵的營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進益生菌的繁殖，調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡，加強物質(zhì)（脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等）代謝，多應(yīng)用于食品、飼料等領(lǐng)域。 益生元對乳酸菌（如乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌）的生長有促進作用。益生元制劑的潛在優(yōu)點是不依賴活的微生物細胞，因此，在飼料加工和儲存過程中沒有嚴格要求。

1995 年，Gibson 提出了合生元（synbiotics）的概念。合生元又稱合生素，是多種益生菌或微生物的混合產(chǎn)品，對宿主起有益作用，是由益生菌與益生元組合而成［19-20］。 合生元兼具益生菌和益生元的優(yōu)良作用，能夠同時發(fā)揮二者的雙重作用。最新研究表明，除了益生菌等活菌體，它們的裂解提取物、代謝產(chǎn)物、細胞壁組分、培養(yǎng)上清液等也都表現(xiàn)出明顯的益生作用， 且不同組分的益生作用機制各不相同［21-22］。 有學(xué)者提出了后生元（postbiotics）的概念，即生物后體，包括代謝物和細胞壁成分，由活細菌分泌或在細菌裂解后釋放，在宿主體內(nèi)顯示出有益活性［23-24］。 目前，乳酸乳球菌細菌素—乳酸鏈球菌素是所有細菌素中研究最廣泛、商業(yè)利用最廣泛的一種， 在生物保護方面的應(yīng)用已獲得歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA） 和美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）的批準［25］。

總之， 益生菌可有效改善機體內(nèi)微生態(tài)的平衡、發(fā)揮益生作用。 益生元可促進益生菌的增殖。兩者混合形成合生元， 合生元產(chǎn)生的物質(zhì) （后生元）依然具有益生性，其相關(guān)互作模式見圖1。

圖1 益生菌、益生元、合生元、后生元模式圖

2 益生菌的作用機理

2.1 抑制有害菌的定植

腸道微生物對病原體的抑制包括細菌拮抗、細菌干擾、屏障效應(yīng)、定植抗性和競爭排斥等作用［16］。益生菌進入宿主體內(nèi)，會迅速在胃腸黏膜定植， 抵制有害菌的生長和繁殖。 Weese 等［26］和Carucci 等［27］研究表明，益生菌可以調(diào)節(jié)腸道致病菌和非致病菌的菌群平衡，抑制致病菌的入侵、預(yù)防炎癥，起到生物屏障的作用。

2.2 提高免疫力

宿主的免疫力與益生菌有關(guān)， 因其可以刺激機體產(chǎn)生特異性以及非特異性免疫反應(yīng)， 同時促進自然殺傷細胞活性、激活巨噬細胞等，進而改變?nèi)硇訲 細胞平衡，提高免疫球蛋白水平，同時能夠增強上皮組織的屏障功能，促進免疫球蛋白IgA的上調(diào)和促炎因子的下調(diào)［28-29］。 臨床研究表明，乳酸菌能夠誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)并增強機體對病毒感染的抵抗力， 有作為疫苗佐劑及疫苗的開發(fā)潛力［30］。 實驗室益生菌作為抗病毒藥物已經(jīng)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖［31］和家禽生產(chǎn)［32］，因此，益生菌及補充劑在預(yù)防和治療動物腸道疾病中起到至關(guān)重要的作用，也越來越多地應(yīng)用于人醫(yī)和獸醫(yī)［33］。

2.3 改善腸道菌群結(jié)構(gòu)

腸道菌群是指寄居在宿主腸道內(nèi)由多種微生物構(gòu)成的生物群落， 它們與宿主共生， 可誘導(dǎo)攝食、調(diào)控機體代謝［34］。腸道菌群參與宿主體內(nèi)多種營養(yǎng)物質(zhì)（糖、脂、蛋白質(zhì)等）的代謝，還參與免疫調(diào)控以及炎性反應(yīng)［35］。 有益菌在體內(nèi)可直接影響消化系統(tǒng)健康。益生菌被宿主攝入后，可顯著增加腸道菌群的多樣性和豐富度。 益生菌在胃腸道內(nèi)大量繁殖，并迅速在宿主腸道內(nèi)形成優(yōu)勢菌群，進而改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，保證宿主的腸道健康［36］。

2.4 修復(fù)腸道黏膜

腸道不僅是動物消化吸收的場所，也是重要的免疫器官。腸道黏膜面積十分龐大，這種結(jié)構(gòu)與其功能組成了腸道巨大的黏膜免疫系統(tǒng)。 腸道中有大量的微生物菌群， 使外源病毒和細菌很難突破這道防線，從而阻止細菌對生物體產(chǎn)生危害［37-39］。

益生菌可以定植在腸道內(nèi)，平衡腸道菌群，刺激腸黏膜免疫組織，改善宿主腸道微生態(tài)環(huán)境，增強腸道屏障功能。研究表明，不同種類的益生菌對胃腸黏膜的結(jié)構(gòu)改變能力不同［40］。 雙歧桿菌能通過細胞的磷酸壁與腸黏膜上皮細胞特異性結(jié)合占據(jù)腸黏膜表面，形成與腸上皮細胞連接的細菌生物膜，阻止各種致病菌、條件致病菌的定植和入侵［36，41］。

2.5 產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)

益生菌除了能夠增強動物腸道功能、 提高抗氧化能力和免疫力，還可作為營養(yǎng)性飼料補充劑。益生菌可直接補充動物體營養(yǎng)， 也可通過調(diào)節(jié)腸道的微生物菌群和促進消化酶的活性提高營養(yǎng)物質(zhì)在機體內(nèi)的消化吸收率。有研究表明，在動物日糧中添加酵母菌顯著提高了粗蛋白質(zhì)、 脂肪等物質(zhì)的消化率， 可見益生菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有明顯的促進作用［42-44］。

3 益生菌對馬的作用

3.1 提高馬的耐力

隨著現(xiàn)代馬業(yè)的發(fā)展，賽馬和馬術(shù)運動在全世界受到歡迎，而與馬相關(guān)的運動對馬的耐力有較高的要求。運動性能的好壞是衡量純血馬優(yōu)劣的主要標準，除了選擇育種能優(yōu)化馬的性能特征［45］，還能通過補充益生菌提高馬的耐力和比賽性能［46-48］。在運動馬的日糧中添加釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等益生菌可增強抗疲勞能力，提升耐力［49］。 適度運動后補充益生菌的馬心率比未補充的低15%～20%， 且補充益生菌的馬有氧運動耗氧量增加［50］。 Rezende 等［51］在研究酵母菌對訓(xùn)練馬營養(yǎng)物質(zhì)消化率和代謝性能的影響時發(fā)現(xiàn)，接受活酵母菌的馬營養(yǎng)物質(zhì)消化率得到提高，且經(jīng)訓(xùn)練表現(xiàn)出更高的疲勞耐受力， 攝氧量也明顯增加。

3.2 調(diào)節(jié)腸道菌群平衡

馬腸道的微生態(tài)環(huán)境保持在一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，容易受到壓力、藥物和環(huán)境的影響。飲食、疾病、 應(yīng)激和環(huán)境等因素很容易破壞馬胃腸道中的微生物菌群結(jié)構(gòu)， 導(dǎo)致腸道健康失衡和疾病的發(fā)生，進而影響馬的健康。 有研究表明，純血馬與蒙古馬的腸道微生物多樣性不同， 同一馬種的不同腸道區(qū)段的菌群多樣性也不同， 可見品種和腸道部位也是影響馬腸道菌群的因素［52-53］。目前，益生菌在馬胃腸道恢復(fù)正常菌群及重建腸道穩(wěn)定和平衡等方面發(fā)揮重要作用，但益生菌影響馬胃腸道菌群環(huán)境的研究非常有限［54］。 健康馬腸道中的放線菌（Actinobacteria）和螺旋菌（Spirochetes）相對豐度顯著高于有腸炎的馬，而患結(jié)腸炎馬的梭形菌（Fusobacteria）相對豐度較高，梭狀芽孢桿菌（Clostridium）在健康馬腸道中更多［55］。

3.3 預(yù)防和治療馬腹瀉

馬駒在剛出生時，由于腸道菌群單一、免疫系統(tǒng)和器官發(fā)育不完善經(jīng)常發(fā)生腹瀉。 馬駒的消化道疾病主要是由病原菌感染引起的， 沙門菌（Salmonella）和大腸桿菌（Escherichia coli）是導(dǎo)致馬腹瀉和敗血癥的主要原因［56］，添加益生菌可顯著降低馬駒的腹瀉率。研究表明，給患腸炎的馬飼喂酵母菌可減少持續(xù)腹瀉的時間。 在懷孕母馬的飲食中補充益生菌可影響馬駒出生后胃腸道中的微生物多樣性并減少腹瀉［57］。

3.4 提高馬的生產(chǎn)性能

益生菌不僅可以維持馬胃腸道內(nèi)微生物平衡，還能改善飲食消化、生長性能并且促進生長。有研究表明，在馬的日糧中，添加益生菌（活酵母）可以促進對干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、半纖維素、酸性洗滌纖維和磷的消化和吸收，加快馬的生長［51］。

4 馬用益生菌添加劑

4.1 酵母添加劑

在馬飼糧中添加活酵母菌可顯著提高馬飼料消化率及生產(chǎn)性能，增加采食量、減少腸道致病菌數(shù)量，同時減少馬業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的負面影響［58-60］。研究表明， 給馬飼喂釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） 可以增強對纖維素和半纖維素的降解消化能力， 可有效抑制消化系統(tǒng)中有害厭氧菌的生長， 且釀酒酵母在盲腸中的濃度高于結(jié)腸［61］。Desrochers等［62］研究表明，添加布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）可顯著縮短患小腸炎和結(jié)腸炎的馬持續(xù)腹瀉的時間。

4.2 芽孢桿菌添加劑

枯草芽孢桿菌PB6 對馬紅球菌（Rhodococcus equi）、馬鏈球菌（Streptococcus equi）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、艱難梭菌（Clostridium difficile）4 種馬源細菌病原體有顯著的抑制作用［63］。 表達Cry5B 蛋白的滅活蘇云金芽孢桿菌可使感染寄生蟲的馬駒糞便中蛔蟲卵的數(shù)量減少，具有潛在的益生特性［64］。 國內(nèi)團隊首次從蒙古馬盲腸道中分離篩選到解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），并對其酶學(xué)特性、產(chǎn)酶特性進行深入研究， 為馬源益生菌的深度開發(fā)和纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗依據(jù)［6］。 目前，雖然芽孢桿菌（Bacillus spp）不會在馬的腸道中定植，但可以在這種環(huán)境中生存， 通過馬小腸的時間很快（1～3 h），但通過后腸的時間可長達2 d，為孢子萌發(fā)和抗菌分子產(chǎn)生提供了足夠的時間，因此，芽孢桿菌的益生功能需要更多的體內(nèi)療效試驗證實。

4.3 乳酸菌添加劑

研究表明，在馬的日糧中添加馬乳桿菌（Lactobacillus equi）、 脆裂乳桿菌 （Lactobacillus fragilis）、約翰遜乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）、羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri）和唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius），在促進馬生長和抵抗腹瀉方面發(fā)揮重要作用［65］。目前，商品化的馬用益生菌通常由乳酸桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）及腸球菌（Enterococcus）等組成［66］。 卷曲乳桿菌 （Lactobacillus frizzled）、 約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）、 羅 伊 乳 桿 菌（Lactobacillus reuteri）和唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）等廣泛應(yīng)用于馬產(chǎn)業(yè)， 可以促進宿主生長和抵抗腸道疾?。?7］。在國外，馬用乳酸工程菌添加劑方面的研究較少；在國內(nèi)，蘇少鋒［6］通過分子生物學(xué)方法成功構(gòu)建乳酸菌食品級雙篩選標記的分泌型表達系統(tǒng)E.faecalis 19855/NN1-1（pMG36e-Emr+p32+usp45+melA+NisI）（見圖2），并實現(xiàn)了馬源解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）中經(jīng)密碼子優(yōu)化的纖維素酶基因在該系統(tǒng)中的分泌表達，為馬用食品級工程菌的研制、開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為新型功能性微生物發(fā)酵劑開發(fā)提供了依據(jù)［68-69］。乳酸菌表達外源基因的轉(zhuǎn)化效率不理想及所用載體缺少高表達調(diào)控元件嚴重阻礙了該領(lǐng)域的發(fā)展。 目前， 多數(shù)研究集中在乳酸菌表達載體的構(gòu)建，其應(yīng)用方面研究很少［70］。隨著微生物生物技術(shù)及交叉學(xué)科的不斷發(fā)展， 開發(fā)功能性重組微生物和合成微生物將成為熱點， 并能廣泛應(yīng)用到養(yǎng)馬業(yè)中。

圖2 纖維素酶基因食品級雙篩選標記表達載體的構(gòu)建[6]

4.4 益生元添加劑

低聚果糖（fructo-oligose）和菊粉（synanthrin）是優(yōu)質(zhì)的馬用益生元產(chǎn)品，可以調(diào)節(jié)馬后腸發(fā)酵。益生元選擇性地刺激后腸某些微生物生長的活性成分，具有保持健康的作用［67］。低聚果糖和菊粉等在馬后腸道中被微生物發(fā)酵降解， 可促進盲腸和結(jié)腸中乳酸菌的生長， 減少腸道微生物群失衡的風險［71］，在前消化道不被消化，才能在壓力環(huán)境下維持后腸健康。

4.5 其他添加劑

馬的飼料中添加沙柳醇（楊柳提取物），能在一定程度上改變馬腸道微生物的豐富度，并增加腸道微生物群多樣性［72］。 糞便微生物移植（fecal microbial transplantation，F(xiàn)MT）是指將糞便懸浮液從健康供體轉(zhuǎn)移到受體腸道，接受健康體有益微生物治療疾病的方法，這種方法已應(yīng)用于獸醫(yī)領(lǐng)域。 FMT 應(yīng)用于馬的研究報道極少，但這種治療形式可能對患有急性結(jié)腸炎或慢性腹瀉的馬有效［73-74］。 最新的研究表明，接受FMT 治療的馬糞便微生物多樣性更高，且與供體的微生物組成更相似［75］。

5 馬用益生菌存在的問題及應(yīng)用前景

有數(shù)據(jù)顯示，當前全球益生菌補充劑行業(yè)規(guī)模達3 000 億元人民幣，2019 年全球動物用益生菌市場規(guī)模達到了150 億元人民幣， 預(yù)計2026年將突破200 億元人民幣。2019 年我國益生菌市場規(guī)模達到20 億元人民幣，預(yù)計2026 年將達到35 億元人民幣。 我國動物益生菌產(chǎn)品在2019 年和2020 年銷量突飛猛進， 預(yù)估未來市場份額會增加， 說明今后的畜牧生產(chǎn)中益生菌會大有作為，馬用益生菌企業(yè)應(yīng)當順勢而上，為畜牧生產(chǎn)創(chuàng) 收［76-77］。

隨著人們安全意識的提高， 動物健康化養(yǎng)殖和福利化養(yǎng)殖程度不斷提高， 獸藥和飼料添加劑安全成為畜牧工作的重中之重。當前，全球的益生菌行業(yè)發(fā)展迅速， 但缺少標準， 產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，存在以次充好的現(xiàn)象［78-79］。 市場上的動物益生菌制品，鮮有馬用益生菌制劑，多數(shù)為豬、牛、羊等使用的益生菌添加劑制品［80-83］。 在益生菌研究中，選擇正確的菌株、 各種菌株優(yōu)化組合及添加濃度等因素共同影響益生效果， 需要進一步研究。 目前， 馬用益生菌產(chǎn)生益生效果的最少微生物量尚未達成共識［84］，后續(xù)可開發(fā)馬用益生菌，并廣泛應(yīng)用于馬產(chǎn)業(yè)。

6 小結(jié)

抗生素替代產(chǎn)品的廣泛需求使益生菌產(chǎn)品成為新寵，其研究熱度和投入逐年增加。 目前，馬用益生菌在馬的耐力提升和營養(yǎng)補充方面已經(jīng)明確益生功效，因此，可以應(yīng)用于賽馬和其他馬。 馬用益生菌具有預(yù)防和治療腹瀉的功效， 可為安全有效的獸藥研發(fā)提供更多選擇。 馬用益生菌能促進現(xiàn)代馬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為畜牧生產(chǎn)創(chuàng)收。馬不同腸道部位微生物菌群的作用及影響還不明確，需要對馬用益生菌進行更深入的研究。