CpG-ODN 作為免疫耐受誘導劑的研究進展

李曉奇，栗 林，賈淑萍，王鳳武

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

免疫系統(tǒng)的主要作用是保護宿主免受細菌、病毒、真菌或寄生蟲等外部病原體的侵害。 免疫細胞能將病原體與自身抗原和無害的外部抗原區(qū)分開來，從而誘導對病原體的保護性免疫以及對自身抗原和無害的非自身抗原的耐受性［1］。 免疫耐受失調(diào)可能導致免疫介導性疾病，如自身免疫疾病、癌癥和各種速發(fā)型過敏性疾?。?］。過敏性疾病的特點是臨床表型和癥狀多種多樣，包括呼吸道疾病，如過敏性鼻炎和哮喘［3］。常見的全身性過敏反應包括對食物和昆蟲毒液過敏［4］以及皮膚濕疹/特應性皮炎［5］。 雖然一些過敏性疾病的臨床表現(xiàn)是輕微的，可以通過對癥藥物控制，但相當多的患者有危及生命的發(fā)作風險［6］。例如，過敏性哮喘可能會變成慢性呼吸道疾病并嚴重影響患者終生的呼吸功能。 盡管過敏表現(xiàn)和癥狀存在差異， 但過敏性疾病的分子和細胞機制是相似的，其特征是2 型輔助性T 細胞（T-helper lymphocyte type 2，Th2） 反應和漿細胞產(chǎn)生過敏原特異性免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）［7］。 過敏已成為一個主要的健康問題。 近幾年，IgE 介導的過敏性疾病發(fā)病率在發(fā)達國家和發(fā)展中國家都在增加。

1 過敏原特異性免疫療法（allergen-specific immunotherapy，ASIT）的機制

ASIT 建立免疫耐受意味著免疫反應的改變，例如通過誘導調(diào)節(jié)性T 細胞 （regulatory T cells，Tregs）和調(diào)節(jié)性B 細 胞（regulatory B cells，Bregs）加強免疫記憶。在人和小鼠中觀察到Tregs 的誘導及其在疾病消退中的重要作用。 Tregs 通過多種協(xié)同機制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用， 如分泌IL-10、IL-35和TGF-b［8］，以及通過一些細胞表面受體，如細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)蛋白4 （cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）、淋巴細胞活化基因3 （lymphocyte-activation gene-3，LAG-3）、程序性細胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）及T 細胞免疫球蛋白和ITIM 域 （T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT）［9］發(fā)揮作用。在某些情況下，Tregs 單獨作用可能不足以減少過敏性炎癥。 Tregs 已被證明與Bregs 協(xié)同作用以促進免疫耐受。 Bregs 構(gòu)成一種特定的B 細胞亞型，可產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-10 和/或IL-35［10］。 已發(fā)現(xiàn)Bregs 在接受ASIT 治療的患者體內(nèi)合成過敏原特異性IgG4［11］。 阻止特異性IgE 與過敏原結(jié)合的阻斷抗體對于調(diào)節(jié)無臨床癥狀的過敏性疾病也至關(guān)重要。 注射單劑量的2 種單克隆IgG4 抗體，通過被動免疫療法阻斷貓的主要過敏原Feld1，成功緩解了患病貓的急性過敏癥狀［12］。 小鼠中不存在IgG4，但IgG1、IgG2a 和IgG3 與小鼠ASIT 模型中的保護作用有關(guān)。 在ASIT 情況下，IgA 也被證明通過中和黏膜表面的過敏原發(fā)揮保護作用。 先天免疫系統(tǒng)主要參與ASIT 的早期。 樹突狀細胞（dentritic cells，DCs） 尤其是漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）已被證明是ASIT 期間耐受誘導的主要細胞介質(zhì)， 可導致Tregs的產(chǎn)生。 DCs 利用多種因子促進Tregs 的分化，包括可溶性因子，如IL-10、TGF-b 或吲哚胺2，3-雙加氧酶 （indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）［1］，以及細胞配體，如誘導型共刺激配體（inducible costimulator-ligand，ICOS-L） 或程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）和PD-L2［13］。

2 CpG-寡脫氧核苷酸 （CpG-oligodeoxynucleotide，CpG-ODN）及其種類

為區(qū)分病原體結(jié)構(gòu)和自身抗原， 免疫系統(tǒng)具備能夠識別危險的特定系統(tǒng)信號或病原體相關(guān)分子 模 式 （pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。 PAMPs 包含多種病原體結(jié)構(gòu)，例如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、鞭毛蛋白、聚糖結(jié)構(gòu)、遺傳物質(zhì)（DNA 和RNA）等。免疫細胞可以通過模式識別受體 （pattern recognition receptor，PRR）特異性識別PAMPs。 與脊椎動物DNA 不同，細菌遺傳物質(zhì)富含未甲基化胞嘧啶—鳥嘌呤二核苷酸（CpG）， 這些未甲基化的細菌CG 基序的PAMPs被Toll 樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）識別。含有未甲基化CpG 的短合成寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN） 序列模擬細菌DNA特征，用于激動TLR9，避免細菌污染物引起的任何其他TLRs 共激活。

到目前為止， 至少已鑒定4 種CpG-ODN，它們對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響，因此，了解其免疫調(diào)節(jié)特性至關(guān)重要。 A 類CpG-ODN 具有磷酸二酯/硫代磷酸酯骨架，包含1 個間接回文序列的單個CpG 基序，以及位于3′末端的多聚G 串。 B 類CpG-ODN 在硫代磷酸酯骨架內(nèi)包含多個CG 雙峰，后者能抵抗核酸酶消化，與A 類CpG-ODN 的磷酸二酯骨架相比，壽命延長了6 倍。 C 類CpGODN 是最近被報道的一種新CpG-ODN，是上述2種CpG-ODN 類型的組合。 與B 類CpG-ODN 一樣，C 類CpG-ODN 完全建立在硫代磷酸酯核苷酸上， 但它的回文CpG 基序與A 類相似［14］。 P 類CpG-ODN 是最近研發(fā)的，與其他CpG-ODN 類型不同， 它包含2 個有助于形成更高階結(jié)構(gòu)的回文序列。

3 TLR9 下游信號及其對CpG-ODN 濃度的依賴

TLR9 與CpG-ODN 的結(jié)合點位于細胞胞內(nèi)體， 需要CpG-ODN 的內(nèi)化和胞內(nèi)體的攝取刺激TLR9 并觸發(fā)其信號級聯(lián)。TLR9 一旦被CpG-ODN結(jié)合激活， 它的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域， 即Toll/IL-1 受體（Toll/IL-1 receptor，TIR） 結(jié)構(gòu)域就會受到刺激并進一步傳遞信號。 TIR 結(jié)構(gòu)域與TLR 銜接蛋白髓樣分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）相互作用是經(jīng)典的結(jié)合模式。隨后，IL-1R相關(guān)激酶1（interleukin 1 receptor-associated kinase 1，IRAK1）、IL-1R 相關(guān)激酶2 （IRAK2）、IL-1R 相關(guān)激酶4（IRAK4）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）被磷酸化［1］，并依次募集幾種絲裂原活化蛋 白 激 酶 （mitogen -activated protein kinases，MAPKs）和其他激酶，例如IκB 激酶（IκB kinase，IKK）。 這些激酶促進了各種轉(zhuǎn)錄因子向細胞核的易位，例如激活B 細胞核因子kappa-輕鏈增強子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1） 或干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulator factor 7，IRF7）［15］。 這些轉(zhuǎn)錄因子激活促炎基因的轉(zhuǎn)錄，如TNF、IL-1B、IL-1A 基因和1 型IFN 基 因 （IFNA 和IFNB）。 pDCs 響 應TLR9 激活產(chǎn)生1 型IFN 已被證明依賴于MyD88-IRF7 信號耦聯(lián)。 CpG-ODN 誘導的基因表達特征動力學是復雜的。 研究表明， 在體內(nèi)注射CpG-ODN 后僅30 min，一組基因就被上調(diào)，在給藥后約3 h 達到表達峰值； 在給藥后第5 天觀察到第2 個延遲峰值， 證明CpG-ODN 可以產(chǎn)生短期、中期和長期影響。 進一步研究表明，包含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭誘導IFN-b （TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-b，TRIF） 被 證 明 在TLR3 和TLR4 激活時發(fā)出信號［16］。

最近的研究證明， 除了經(jīng)典的MyD88 通路，TLR9 還可以通過TRIF 發(fā)出信號， 當高濃度的CpG-ODN 作用于pDCs 時，TLR9 會通過TRIF 發(fā)出信號， 而使用較低濃度的CpG-ODN 時，TLR9會接合經(jīng)典的MyD88 接頭。 TLR9 下游信號傳導的差異暗示了差異基因表達特征。 一方面，MyD88轉(zhuǎn)導通路同時觸發(fā)了經(jīng)典NF-κB 和非經(jīng)典NFκB 通路， 導致促炎細胞因子的表達， 如TNF-a、IL-1b、IL-12、IL-6 和IL-23。另一方面，TRIF 下游信號僅激活非經(jīng)典NF-κB 通路和IRF3，導致抗炎介質(zhì)如TGF-b 和IDO 的表達。 這項研究提出了一個新的觀點， 即TLR9 可以根據(jù)配體濃度被不同程度激活。 TLRs 在人外周血單個核細胞上的分布是可變的。 雖然TLR9 在一些人類免疫細胞如中性粒細胞和單核細胞中不表達，但它在pDCs 和B細胞中高表達， 在NK 細胞和T 細胞中的表達水平較低。 在小鼠中，TLR9 表現(xiàn)出與人類相似的表達和激活模式，僅有細微的差別。 例如，由于缺乏TLR9 表達， 來自人外周血的單核細胞不會被CpG-ODN 激活。 然而， 小鼠單核細胞表達TLR9并通過參與NF-κB 通路和隨后產(chǎn)生細胞因子（如TNF-a）響應CpG-ODN 刺激。 在與過敏性氣道疾病相關(guān)的器官中， 人和小鼠肺泡巨噬細胞表達TLR9。 然而， 只有人而不是小鼠的肺DCs 顯示TLR9 表達。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，CpG-ODN 可能會誘導一些在小鼠和人類之間略有不同的免疫反應［17］。此外，激動TLR9 的最佳CpG-ODN 序列因物種而異。然而，TLR9 激活產(chǎn)生的影響在物種之間基本保持不變，因為上游、下游轉(zhuǎn)導元件是非常保守的。 盡管如此， 在動物模型中應用基于CpG-ODN 的治療時應考慮種間差異。

4 CpG-ODN 對免疫細胞的影響

CpG-ODN 影響許多類型的免疫細胞，尤其是抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APCs），如DCs 和巨噬細胞。 DCs 前體表達各種TLRs， 包括TLR9， 從而使它們能夠被CpG-ODN 激活。 由于pDCs 表達高水平的TLR9， 已經(jīng)成為研究CpGODN 的模式細胞。CpG-ODN 促進pDCs 向淋巴結(jié)的遷移并刺激其產(chǎn)生細胞因子， 例如IL-6、TNFa、IFN-1 和粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）。 此外，CpG-ODN 誘導pDCs 表達幾種共刺激表面分子，如CD40、CD54、CD80、CD86［18］。未甲基化的CG 基序也被證明可以促進pDCs 的抗炎表型。 經(jīng)CpG-ODN 處理的pDCs 可以誘導CD8+Tregs 表達免疫抑制分子， 如LAG3 和CTLA4。 類似， 用CpG-ODN 刺激的pDCs 可以啟動未成熟T 細胞分化為CD4+CD25+Treg，產(chǎn)生IL-10和TGF-b。 朗格漢斯細胞表達TLR9 并在小鼠皮內(nèi)注射CpG-ODN 后遷移。 脾DCs 亞群能夠在體內(nèi)注射CpG-ODN 后產(chǎn)生有效的IDO 信號， 從而獲得類似Tregs 的免疫抑制能力。 用C 類CpGODN 刺激的pDCs 可以直接使人B 細胞以不依賴T 細胞的方式分化為漿細胞并產(chǎn)生抗體。B 細胞也受CpG-ODN 的影響。 CpG-ODN 是一種強有力的B 細胞有絲分裂原，誘導它們產(chǎn)生IL-6 和IgM，并在Ig 產(chǎn)生過程中促進它們的激活和分化。 同樣，用CpG-ODN 刺激B 細胞會改變后者的Ig 譜并產(chǎn)生不同抗體， 這種效果依賴TRL9 和MyD88 信號傳導。 NK 細胞可以通過直接或間接信號在CpGODN 刺激下發(fā)生反應。 研究表明，NK 細胞不能直接響應CpG-ODN，而是通過被CpG-ODN 激活的pDCs 產(chǎn)生的可溶性因子間接觸發(fā)。 其他研究同樣支持以下觀點，即CpG-ODN 可以直接誘導NK 細胞產(chǎn)生IFN-g 并提高其活性。 由于T 細胞表達的TLR9 水平非常低，推斷CpG-ODN 不會直接刺激T 細胞。 與NK 細胞類似，T 細胞是通過被CpGODN 激活的pDCs 傳輸?shù)男盘枀⑴c反應。 盡管CpG-ODN 對T 細胞沒有直接影響，但有一些研究指出，CpG-ODN 可以在沒有任何中間體的情況下刺激T 細胞，但以獨立于TLR9 和MyD88 的方式。有研究表明，純化的人T 細胞和NK 細胞在CpGODN 的直接刺激下產(chǎn)生IFN-g。 此外， 有研究表明，MyD88 對于CD4+T 細胞直接接受CpG-ODN刺激是必不可少的。

總之， 每種CpG-ODN 對各種免疫細胞都有廣泛的影響。 在將CpG-ODN 作為ASIT 佐劑的研究中，B 類CpG-ODN 因其在pDCs 中誘導免疫耐受性表型的突出能力而備受關(guān)注。

5 CpG-ODN 作為ASIT 免疫耐受誘導劑的作用機制

5.1 CpG-ODN 通過DCs 誘導過敏原特異性免疫調(diào)節(jié)

DCs，尤其是pDCs，在CpG-ODN 刺激下產(chǎn)生IL-10、TGF-b 和IDO， 這使得它們成為非常有效的Tregs 誘導劑。先天免疫對于誘導適應性免疫系統(tǒng)的耐受反應至關(guān)重要，因此，調(diào)節(jié)APCs（如pDCs）和早期激活的適應性免疫細胞（如B 細胞）是改善ASIT 療效的手段。研究表明，CpG-ODN 對免疫系統(tǒng)具有雙重影響， 低濃度CpG-ODN 誘導炎癥，高濃度CpG-ODN 誘導免疫調(diào)節(jié)和耐受，即相同的TLR 配體可以根據(jù)其濃度/劑量對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生兩種影響。 當CpG-ODN 被用作疫苗接種的佐劑時，很低劑量就能引起細胞毒性或炎癥反應。當CpG-ODN 在動物模型中被證明可以成功誘導免疫耐受和治療過敏時，使用的劑量很高。有學者研究表明，pDCs 是關(guān)鍵的免疫細胞，原因是pDCs在免疫系統(tǒng)中的經(jīng)典作用是通過病毒遺傳物質(zhì)激活TLR 危險信號而產(chǎn)生1 型IFN 促進對病毒侵襲的防御。 pDCs 已被證明通過幾種可溶性因子和膜信號蛋白促進免疫耐受。 幾項研究表明， 通過CpG-ODN 刺激pDCs 會導致免疫耐受性的誘導，這可能是由成熟的病毒感染觸發(fā)的1 型IFN 反應與通過高劑量CpG-ODN 單獨激活TLR9 導致的。為了區(qū)分來自不同刺激源的pDCs 衍生的1 型IFN 效應，進一步研究結(jié)果顯示，人pDCs 的NLRP1 和NLRP3 表達量極低，表明它們激活炎癥小體的能力較弱［19］，因此，它們幾乎不能誘發(fā)炎癥反應，而是被編輯為誘發(fā)免疫耐受。 CD5+CD81+pDCs亞群在CpG-ODN 刺激下不產(chǎn)生1 型IFN，但會誘導強烈的Tregs 分化。 經(jīng)典樹突狀細胞（conventional DCs，cDCs）也已被證明可以通過人和小鼠的Tregs 誘導促進免疫耐受。 2 型經(jīng)典樹突狀細胞（cDCs2a）顯示出更高的TLR9 表達水平，并可在CpG-ODN 刺 激 下 誘 導Tregs 分 化。 DCs 已 被 用于通過免疫耐受誘導將免疫疾病逆轉(zhuǎn)為免疫穩(wěn)態(tài)［20-21］。 與過敏類似， 炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）缺乏適當?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)。 研究表明，CpG-ODN 通過誘導DCs 免疫耐受改善IBD癥狀。研究顯示，ASIT 使用貓過敏原Feld1 和高劑量的CpG-ODN 可以不同程度減少過敏性哮喘小鼠模型中的癥狀。

5.2 CpG-ODN 誘導Tregs 和Bregs

CpG-ODN 能夠減少由氫氧化鋁觸發(fā)的Th2反應，這種作用取決于MyD88 和IL-10 的活性［22］。CpG-ODN 能夠誘導免疫調(diào)節(jié)反應。早在1997 年，含有未甲基化CG 基序的細菌DNA 就被證明可以在黏附的小鼠脾細胞中誘導IL10 的產(chǎn)生。CpGODN 也被證明可以促進其他調(diào)節(jié)性細胞因子（如TGF-b）的產(chǎn)生。 TGF-b 對免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，是誘導Tregs 分化的3 個關(guān)鍵信號之一。 此外，TGFb 在炎癥后組織修復中發(fā)揮作用［23］。 幾個小組已經(jīng)研究了CpG-ODN 的不同給藥途徑在過敏性呼吸道疾病中的治療機理。在第一項研究中，研究人員用CpG-ODN ［中高劑量：0.15 mg/（kg·BW）］在小鼠模型中預防蟑螂誘發(fā)的過敏性哮喘， 研究發(fā)現(xiàn)，肺裂解物中IL-10 的水平增加，這歸因于CD4+FoxP3+Tregs 群體的增加。 在第二項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)通過鼻腔吸入（nasal inhalation，NI）途徑給予CpG-ODN［高劑量：2.5 mg/（kg·BW）］，可通過分泌IL-10 顯著緩解過敏性氣道炎癥。 在這種情況下，Tregs 不是IL-10 的來源， 但抗炎細胞因子是由CpG-ODN NI 治療后募集的調(diào)節(jié)性巨噬細胞分泌的。這兩個結(jié)果并不排斥，可以通過調(diào)節(jié)性巨噬細胞最初產(chǎn)生IL-10 解釋，然后是Tregs 的連續(xù)分化和IL-10 的產(chǎn)生。 此外，在完成基于CpGODN 的ASIT 后， 在CpG-ODN/ASIT 處理的小鼠脾臟中發(fā)現(xiàn)了差異調(diào)節(jié)和從頭表達的Tregs，包括已知特異性抑制Th2 反應的Tregs 亞型［24］。 除了Tregs，Bregs 對ASIT 的效果也至關(guān)重要。與其他免疫細胞相比，B 細胞表達更高水平的TLR9，因此，它們對CpG-ODN 更敏感。 研究發(fā)現(xiàn)，過敏反應的減少取決于產(chǎn)生IL-10 的濾泡B 細胞 （B220+CD19+CD23+IgM+CD40+MHCⅡ），表明被CpG-ODN刺激的B 細胞在過敏情況下具有促進免疫耐受的作用。CpG-ODN 誘導的產(chǎn)生IL-10 的B 細胞具有明顯的腫瘤壞死因子受體2 （tumor necrosis factor receptor type 2，TNFR2）表達，這可以在基于CpGODN 的小鼠ASIT 模型中得到證實，B 細胞在注射部位表達更高水平的TNFR2。

5.3 CpG-ODN 誘導保護性免疫球蛋白產(chǎn)生并改善上皮細胞完整性

ASIT 減輕過敏癥狀的重要機制之一是B 細胞產(chǎn)生保護性免疫球蛋白，如IgG 和IgA。用CpGODN 刺激B 細胞會誘導小鼠產(chǎn)生免疫球蛋白，如IgG2a、IgG2b、IgG3 和IgA。 此外，CpG-ODN 可抑制體內(nèi)IgE 的產(chǎn)生。CpG-ODN 還被證明可以通過非免疫細胞的共激活加強對過敏性疾病的保護。例如，CpG-ODN 可改善氣道上皮細胞的緊密連接（tight junction，TJ），這種細胞在維持肺的穩(wěn)態(tài)和預防過敏原引起的氣道過敏方面起著至關(guān)重要的作用［25-27］。

5.4 CpG-ODN 誘導Th1 反應

CpG-ODN 已被用作ASIT 中的佐劑， 靶向先天免疫系統(tǒng)，提升ASIT 的治療效果。CpG-ODN 已被證明可以誘導Th1 免疫反應。在體外使用CpGODN 可以促進IFN-g 和IL-12 的產(chǎn)生， 二者是在Th1 環(huán)境中產(chǎn)生的典型細胞因子。 在體內(nèi)預防性過敏治療中，CpG-ODN 能夠誘導不可變的IFN-g依賴性Th1 反應，阻止隨后Th2 過敏反應的建立。相比之下，將氫氧化鋁作為佐劑，用于治療小鼠乙型肝炎主要表面抗原（HBsAg）致敏時，會誘導Th2反應， 但用CpG-ODN 和HBsAg 處理時，CpGODN 能夠誘導Th1 反應，覆蓋預先建立的Th2 反應，因此，有學者曾提出誘導Th1 反應是治療過敏性疾病的一種可能的細胞免疫機制。