基于UHPLC-Q-Exactive-MS技術的短序蒲桃葉巖白菜素新衍生物的快速發(fā)現(xiàn)

涂海聲，邱嘉琦，徐 雅，張 靖，3，丘小惠，3，黃志海，3，李 鐘，徐 文，3*，韓 彬*

（1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510006；3.廣州市中藥活性成分手性研究重點實驗室，廣東 廣州 510006）

桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃屬（Syzygium）植物具有重要的藥用和食用價值，代表性植物如蒲桃［1］、丁香［2］、海南蒲桃、烏墨［3］、滇南蒲桃等，其根皮莖葉果均可入藥或食用。已有研究表明，蒲桃屬植物中含有豐富的化學成分，如黃酮類［4］、萜類［5］、酚酸類［6］、間苯三酚類［7-8］等，且具有抗炎［9］、抗氧化［10］、抗菌［11］、降血糖［12-13］等廣泛的生物活性和藥理作用。

本屬植物短序蒲桃（Syzygium brachythyrsumMerr.et Perry），又名野冬青果、山蒲桃、麻栗果等，分布于云南、廣東、廣西等地［14］。其果實與莖葉以“野冬青果”之名收載于《云南中草藥》，具有止咳平喘的功效，主要用于寒性哮喘、哮喘等［15-16］，其作為特色民族中草藥在西南地區(qū)有廣泛的應用。然而，目前尚未見短序蒲桃藥學相關的系統(tǒng)報道，其化學成分、生物活性、藥理作用等方面的研究仍為空白。

本課題組前期首次開展了短序蒲桃葉的化學成分和生物活性研究［17］，分離得到2 種新巖白菜素衍生物（圖1）和一系列巖白菜素衍生物，首次證實了蒲桃屬植物中富含大量的巖白菜素類衍生物。巖白菜素因具有良好的止咳作用，已作為上市藥物收錄于《中國藥典》［18］。近年來大量研究表明巖白菜素具有降糖、保肝等多種潛在的治療作用，以及抗炎、抗腫瘤、抗心律失常、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理活性［19-21］。但巖白菜素的生物利用度較低，為充分發(fā)揮其藥用價值，提高其生物利用度及生物活性，從天然來源或人工合成手段發(fā)現(xiàn)活性更高的巖白菜素衍生物成為新的研究熱點。

圖1 新化合物短序蒲桃酚A（化合物19，A）及短序蒲桃酚B（化合物18，B）的結構圖［17］Fig.1 Structures of brachythol A（compound 19，A）and brachythol B（compound 18，B）［17］

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS）已逐步發(fā)展成為一項常規(guī)分析技術，將LC-MS 尤其是高分辨質(zhì)譜技術應用于天然藥物化學研究，是對傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物分離技術的有力支撐。結合高效液相色譜強大的分離能力與質(zhì)譜技術的高靈敏度、高選擇性以及準確性的特點，可實現(xiàn)中藥復雜化學成分導向分離和鑒定，有助于快速發(fā)現(xiàn)新穎和感興趣的天然產(chǎn)物。在課題組前期研究基礎上，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive-MS）技術［22-24］，通過采集模式化合物的高分辨質(zhì)譜信息，結合特征碎片離子信息和化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律，并與前期分離的實體成分和SciFinder Scholar 文獻數(shù)據(jù)庫進行對比，對短序蒲桃葉中巖白菜素類等具有沒食子酸糖苷結構的類似成分進行快速分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)潛在新穎的巖白菜素衍生物成分，為短序蒲桃葉的物質(zhì)基礎研究和后續(xù)開發(fā)奠定化學基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Q-Exactive Plus hybrid Orbitrap 質(zhì)譜儀與Accela 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific）。LK/CSJ-20型超聲波清洗機（成都老肯科技股份有限公司），BT-125D 型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），Eppendorf-5424高速離心機（艾本德中國有限公司）。HPLC級甲醇、乙腈和甲酸（默克公司），實驗用水為Millipore超純水（Millipore公司，18.2 MΩ·cm）。

短序蒲桃葉（PT，采自云南省西雙版納傣族自治州勐?？h），經(jīng)暨南大學周光雄教授鑒定為桃金娘科蒲桃屬短序蒲桃（S. brachythyrsum）的莖和葉，樣本（編號：201903S）保存于廣東省中醫(yī)院中藥制劑室標本庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 參考前期［25］的樣品處理方法，取少量短序蒲桃葉乙酸乙酯提取物浸膏100 mg，采用10 mL 80%甲醇超聲10 min，15 000 r/min 離心10 min，取上清液適量，過0.22 μm 微孔濾膜，待分析。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取本實驗室前期分離得到的對照品巖白菜素、去甲巖白菜素、短序蒲桃酚A、短序蒲桃酚B適量，加適量甲醇溶解稀釋后制得20μg/mL的單一對照品儲備液。

1.2.3 色譜參數(shù) 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；流速為200 μL/min。梯度洗脫：0～2 min，17% A；2～3.5 min，17%～23% A；3.5～6 min，23%～45% A；6～13 min，45%～90% A；13～15 min，90% A；15～16 min，90%～17%A；16～19 min，17%A。

1.2.4 質(zhì)譜參數(shù) 采用電噴霧離子源（ESI）負離子模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。噴霧電壓為-3 700 V；鞘氣為40 arb，輔助氣為15 arb，探針及毛細管溫度均為350 ℃，一級掃描分辨率為35 000，質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍為m/z130～2 000，二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA），分辨率為17 500，碰撞能量（NCE）為30%。質(zhì)譜采集為Xcalbur軟件（美國Thermo Fisher Scientific），用于記錄和整合色譜圖。質(zhì)譜裂解規(guī)律參考模擬軟件Mass Frontier 6.0（美國Thermo Fisher Science）。

2 結果與討論

2.1 短序蒲桃葉酚酸類成分的LC-MS分析

采用UHPLC-Q-Exactive-MS 負離子模式對短序蒲桃葉酚酸類部位進行分析，其LCMS 總離子流圖如圖2。對圖2 中主要色譜峰進行LC-MS鑒定，策略為：①根據(jù)前期化學成分研究獲取的主要模式成分進行質(zhì)譜裂解規(guī)律研究，按照質(zhì)譜學一般規(guī)律結合Mass Frontier 6.0模擬軟件推測模式成分母核的裂解規(guī)律并總結特征碎片離子；②根據(jù)母離子Orbitrap 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)結合N 規(guī)律、同位素峰規(guī)律確定未知成分的元素組成；③根據(jù)母離子、多級質(zhì)譜信息和精確相對分子質(zhì)量，對短序蒲桃葉中的酚酸類成分進行鑒定、歸類與分析；④將部分已知成分與前期已分離得到的實體化合物或文獻進行對照。從短序蒲桃葉中共鑒定出54 種酚酸類成分，其保留時間、高分辨母離子信息、質(zhì)量偏差、多級質(zhì)譜信息及可能的結構信息見表1。結果表明，短序蒲桃葉中巖白菜素衍生物等酚酸類成分主要在保留時間1～10 min范圍內(nèi)出峰。

表1 短序蒲桃葉中酚酸類成分的UHPLC-Q-Exactive-MS鑒定結果Table 1 Identified results of phenolic acids in PT by UHPLC-Q-Exactive-MS

（續(xù)表1）

圖2 短序蒲桃葉酚酸類提取物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of PT phenolics extract the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 巖白菜素模式成分的Orbitrap質(zhì)譜特征裂解規(guī)律研究

采用LC-Orbitrap MS 對特征碎片離子初步提取和分析，結果表明短序蒲桃葉中的酚酸類成分以巖白菜素、去甲巖白菜素和課題組分離得到的新化合物短序蒲桃酚B（Brachythol B）的衍生物為主，為此本研究對上述3 種模式成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律進行歸納，并總結其特征碎片和關鍵的中性丟失，為未知成分的快速發(fā)現(xiàn)奠定基礎。

2.2.1 巖白菜素類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 巖白菜素為沒食子酰葡萄糖類化合物，在Orbitrap 質(zhì)譜中形成m/z327.070 5（C14H15O9）的［M-H］-準分子離子峰，其在二級質(zhì)譜中主要碎裂成m/z312.046 6、249.038 8、234.015 2、207.028 1、192.004 5 等碎片。根據(jù)其元素組成及相關文獻［26-27］，推測巖白菜素的質(zhì)譜裂解主要為發(fā)生在C環(huán)的內(nèi)部裂解，其中m/z249.038 8推測為發(fā)生在3，4位逆狄爾斯-阿爾德裂解（retro-Diels-Alder fragmentation，RDA）形成的3，4A 碎片離子（圖3），并進一步在A 環(huán)的甲基發(fā)生均裂形成m/z234.015 2的自由基離子。由C環(huán)10b，4a位發(fā)生非典型RDA裂解導致C4H8O4（120 Da）殘基的中性丟失，形成m/z207.028 1 的10b，4aA 特征離子（圖3）。10b，4aA 特征離子在A 環(huán)進一步均裂失去甲基形成m/z192.004 5的自由基離子。通過與前期分離的實體化合物進行保留時間及質(zhì)譜信息比對，確定峰11為巖白菜素，峰5為其異構體。

圖3 對照品巖白菜素的色譜圖（A）、二級質(zhì)譜（B）及其特征質(zhì)譜裂解規(guī)律（C）Fig.3 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of bergenin

以巖白菜素的上述5 個特征碎片離子為依據(jù)，可快速獲得具有巖白菜素相同母核的衍生物成分。經(jīng)對主要色譜峰的精確母離子和多級質(zhì)譜信息進行分析，發(fā)現(xiàn)化合物5、19、24、31、35、37、39、41 和43～52 均具有與巖白菜素相同的特征離子峰及相似的質(zhì)譜裂解途徑，關鍵的中性丟失和精確的元素組學信息表明它們?yōu)槎喾N酚酸取代的巖白菜素衍生物。以19 號峰為例，說明化合物的鑒定過程及其裂解規(guī)律。化合物19 的保留時間為4.6 min，在負離子模式下形成［M-H］-的準分子離子峰m/z479.083 2，推測分子式為C21H20O13。其在二級質(zhì)譜中進一步碎裂形成特征碎片離子m/z327.070 3、312.047 2、271.044 9、249.039 2、234.015 4、207.027 9、169.012 4。其中m/z327 為失去沒食子酰取代基生成的巖白菜素母核碎片，m/z312 為進一步均裂脫去8 位甲氧基形成的碎片的碎片，3，4A 碎片以及巖白菜素特征碎片離子3，4A、10b，4aA 等。其主要碎裂途徑與上述巖白菜素基本一致，可判斷其為巖白菜素類衍生物。根據(jù)其元素組成及m/z169.012 4取代基碎片離子，可推測化合物19為沒食子酰取代的巖白菜素衍生物。通過與前期分離的實體化合物進行保留時間及質(zhì)譜信息比對，確定其為新化合物短序蒲桃酚A。

通過對Orbitrap 負離子質(zhì)譜信息分析及與巖白菜素特征離子峰比對及篩選，發(fā)現(xiàn)潛在的巖白菜素類異構體及衍生物共19 種，主要為沒食子酰（化合物19、31、37、39）、香豆酰（化合物45、46、49）、阿魏酰（化合物50、52）等取代的巖白菜素類衍生物。均為在蒲桃屬植物中首次發(fā)現(xiàn)。

2.2.2 去甲巖白菜素類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 去甲巖白菜素（Norbergenin，峰7）為巖白菜素巖A 環(huán)上的甲氧基被羥基取代而成，因此兩者裂解方式相似。去甲巖白菜素在Orbitrap 質(zhì)譜中形成m/z313.055 2（C13H13O9）的［M-H］-峰，在二級質(zhì)譜中主要碎裂成m/z235.024 0、207.028 9、193.013 1特征離子。其中m/z235.024 0 和193.013 1 碎片的裂解途徑與巖白菜素一致，均為分別發(fā)生在C 環(huán)3，4 位和10b，4a位的RDA裂解形成3，4A碎片離子和10b，4aA特征離子（圖4）。此外，C環(huán)3，4位發(fā)生裂解后進一步重排，形成m/z207.028 9 的特征離子。上述3 個特征碎片離子峰可作為去甲巖白菜素類衍生物的診斷離子，用于相關色譜峰的鑒定。

圖4 對照品去甲巖白菜素的色譜圖（A）、二級質(zhì)譜（B）及其特征質(zhì)譜裂解規(guī)律（C）Fig.4 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of norbergenin

以化合物30 為例，其保留時間為6.4 min。在負離子模式下，其準分子離子峰［M-H］-為m/z433.076 0，通過精確質(zhì)譜測定推測其分子式為C20H18O11。分析二級質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)其主要碎片離子為m/z313.055 9、235.022 9、193.012 4，推測其分別為準分子離子峰失去取代基生成的去甲巖白菜素母核碎片、3，4A 碎片及10b，4aA 碎片，初步判斷其為去甲巖白菜素類衍生物。根據(jù)元素組成推測其取代基為水楊酸基團，該化合物為水楊酸去甲巖白菜素，通過SciFinder Scholar 數(shù)據(jù)庫搜索，推測其為潛在的新成分。

基于上述策略，發(fā)現(xiàn)潛在的去甲巖白菜素類異構體（化合物3）及衍生物共11 種，主要為沒食子酰（化合物4、12、14、22）、阿魏酰（化合物40、42）及咖啡酰（化合物28）取代的去甲巖白菜素。均為從蒲桃屬植物中首次發(fā)現(xiàn)，其中化合物30（水楊酸去甲巖白菜素）為潛在的新化合物。

2.2.3 新型巖白菜素衍生物短序蒲桃酚B類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 短序蒲桃酚B（Brachythol B，峰18）為本實驗室前期［17］首次從短序蒲桃葉酚酸類成分中發(fā)現(xiàn)并分離得到的新型巖白菜素類衍生物。短序蒲桃酚B 在結構上為巖白菜素C 環(huán)2，3 位上羥基被六羥基聯(lián)苯甲酰基團（HHDP）取代形成的新衍生物。在Orbitrap 一級質(zhì)譜中，短序蒲桃酚B 形成m/z629.076 7（C28H21O17）的［M-H］-峰，其進一步碎裂成m/z300.997 6、275.018 8 2 個特征碎片離子。推測其質(zhì)譜裂解途徑主要為C 環(huán)內(nèi)部發(fā)生斷裂并重排，形成與HHDP 基團相關的碎片離子（圖5），其中特征離子m/z275.018 8 為HHDP 基團7'，7''位上酯基裂解后重排形成的碎片離子，而m/z300.997 6 為HHDP 殘基經(jīng)脫氫重排后形成的鞣花酸特征碎片離子，該碎片離子因具有高度的共軛而較為穩(wěn)定，故離子豐度最強。此外，C 環(huán)上的內(nèi)部裂解還形成了巖白菜素殘基碎片如m/z249.038 8和207.028 0，但離子豐度較低，可用于佐證巖白菜素的存在。而HHDP殘基碎片m/z300.997 6和275.018 8具有較高的離子豐度，且具有特異性，因此可作為短序蒲桃酚B 母核的特征碎片離子。由此將上述兩種離子作為短序蒲桃酚B 的診斷離子對其衍生物進行篩選和鑒定分析。

圖5 對照品短序蒲桃酚B的色譜圖（A）、二級質(zhì)譜（B）及其特征質(zhì)譜裂解規(guī)律（C）Fig.5 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of brachythol B

化合物38 的保留時間為7.6 min。在負離子模式下，其準分子離子峰為m/z659.086 6［M-H］-，分子式為C29H24O18。通過分析二級質(zhì)譜碎片發(fā)現(xiàn)其主要碎片離子m/z300.997 7、275.018 6 與上述短序蒲桃酚B 的母核特征峰一致，可初步判斷其為短序蒲桃酚B 類衍生物。根據(jù)其元素組成可確定化合物38為甲氧基短序蒲桃酚B，為潛在的新成分。

同理可推斷出峰26 和33 分別為短序蒲桃酚B 同分異構體HHDP-巖白菜素和沒食子酰短序蒲桃酚B。同時篩選出3 個具有HHDP 結構的沒食子酰-HHDP-葡萄糖苷衍生物（化合物2、9、10）。短序蒲桃酚B及其衍生物均為潛在的新化合物。

綜上所述，通過對Orbitrap 負離子質(zhì)譜信息進行分析及與特征離子峰比對和篩選，從短序蒲桃葉酚酸類成分中推測出巖白菜素類衍生物34 種，非巖白菜素類化合物4 種，均為首次在蒲桃屬植物中發(fā)現(xiàn)。其中9種巖白菜素類衍生物為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物，1種為以短序蒲桃酚B為代表的新型巖白菜素類衍生物構型。

2.3 其他成分

除巖白菜素類化合物外，本研究還從短序蒲桃葉酚酸類成分中鑒定出17 種黃酮及其他酚酸類成分，并發(fā)現(xiàn)1種新化合物沒食子酰二甲基沒食子酸（Galloyl-O-di-methylgallate）。

2.4 討 論

本文采用UHPLC-Q-Exactive-MS技術對短序蒲桃葉中巖白菜素類化合物進行快速分析，從中發(fā)現(xiàn)或推測出30余種巖白菜素及其衍生物，包括多種潛在的新型巖白菜素類衍生物構型，并總結了巖白菜素類、去甲巖白菜素類及新構型短序蒲桃酚B類3種巖白菜素化合物構型的質(zhì)譜裂解規(guī)律，豐富了巖白菜素類化合物的天然來源，為其快速鑒定及進一步的成分分離、結構修飾及活性篩選提供了參考。化合物生物活性與其取代基團息息相關，Kashima等［19］研究表明，當巖白菜素取代基中含有苯甲?；虮郊柞；Y構時具有較強的生物活性。本研究首次發(fā)現(xiàn)的多種短序蒲桃酚B衍生物具有六羥基聯(lián)苯甲酰基團（HHDP），且前期研究［17］也證實短序蒲桃酚B具有較強的抗炎及抗氧化活性，推測這些成分具有良好的生物活性，對其進行深入的化學成分研究、活性評價和構型關系研究具有重要意義。

本研究僅對少數(shù)推測出的化合物進行標準品比對，大量的異構體成分無法獲得結構確證，存在一定的局限性?；赨HPLC-Q-Exactive-MS 技術，后續(xù)擬開展短序蒲桃葉的導向分離，進一步明確短序蒲桃葉的物質(zhì)基礎，為該民族中草藥的開發(fā)和藥理藥效學評價奠定基礎。

3 結 論

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿軌道阱質(zhì)譜分析了特色民族藥物短序蒲桃葉中的酚酸類成分，通過條件優(yōu)化，短序蒲桃葉中的巖白菜素類成分得到較好的分離和質(zhì)譜響應。實驗發(fā)現(xiàn)，短序蒲桃葉中巖白菜素類成分在負離子模式下易形成［M-H］-母離子峰。根據(jù)獲得的母離子、多級質(zhì)譜信息和精確分子量，對比對照品的質(zhì)譜信息，并參考已有文獻，從短序蒲桃葉酚酸類成分中推測出54種成分，其中38個成分為首次從蒲桃屬植物中發(fā)現(xiàn)（包括34種巖白菜素類化合物、4種非巖白菜素類化合物），除已報道的巖白菜素類成分外，還發(fā)現(xiàn)了7 個以短序蒲桃酚B 為基本母核的潛在新巖白菜素衍生物。上述發(fā)現(xiàn)為短序蒲桃葉的化學成分及其藥效物質(zhì)基礎研究奠定了基礎，同時為進一步研究巖白菜素類化合物的生物活性及其構效關系提供了新的依據(jù)。