HPLC 法同時測定山慈菇中3 種成分

謝典朱聰潘紅波李曉靜徐步斌*周斌*

（1.江西科技師范大學藥學院，江西 南昌330013； 2.海軍勤務學院，天津300450）

山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭Cremastra appendiculata（D.Don）Makino、獨蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franch）Rolef、云南獨蒜蘭Pleione yunnanensisRolfe 的假鱗莖，秋季采摘，摘棄莖葉洗凈泥沙，經曬干或烘干后加工而成。山慈菇分布廣泛，在長江以南、西北、西南等地區(qū)均有種植。山慈菇具有悠久的應用歷史，最初記載于唐代《本草拾遺》，藥性甘、微辛、涼，歸肝、脾經，有清熱解毒、化痰祛瘀的功效，可用于癰腫疔毒、瘰疬痰核等由皮膚炎癥或感染引發(fā)的外科疾病，蛇蟲咬傷等［1］。

從山慈菇中分離得到菲類、聯芐類、糖及糖苷類、萜類、甾體類［2-10］等成分。山慈菇具有抗腫瘤［11-17］、降壓［18-19］、抗菌［20-23］、抗痛風［24-25］等藥理活性。在我國，山慈菇常與其他中藥配伍治療肺癌、肝癌、大腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤以及抗痛風治療。dactylorhin A、militarine、秋水仙堿是山慈菇中主要的活性成分，其中，dactylorhin A、militarine 屬于丁二酸芐酯苷類成分，能夠提高由于用藥導致缺損的老鼠記憶，降低腦部神經損傷，具有延緩衰老和抗老年癡呆的作用［26-28］，秋水仙堿則具有良好的抗痛風、抗腫瘤作用。

近年來，山慈菇的研究聚焦于抗腫瘤作用機制，同時dactylorhin A、militarine 和秋水仙堿的含量測定也分別有報道［29-32］。本研究首次建立HPLC 法同時測定山慈菇中dactylorhin A、militarine、秋水仙堿的含量，以期為山慈菇藥材的質量控制與評價提供依據。

1 材料

1.1 儀器 KQ-3200DB 型超聲波清洗器（江西贛儀科技有限公司）；LR4000 型旋轉蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；2550 型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；CP225D 型電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 dactylorhin A 對照品（批號256459-34-4，純度≥98%，成都植標化純生物技術有限公司）；militarine（批號DST190724-025，純度≥98%）、秋水仙堿（批號DST190527-052，純度≥98%）對照品（成都德思特生物技術有限公司）。山慈菇購自云南省麗江市，由江西中醫(yī)藥大學藥學院鄧可眾副教授鑒定為正品。甲醇（上海晶純生化科技股份有限公司）；乙腈（汕頭市西隴科學股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 稱取dactylorhin A、militarine、秋水仙堿對照品適量，置于量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度分別為0.097、1.006、0.541 mg／mL 溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 將藥材粉碎，過30 號篩，稱取粉末0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入70% 甲醇50 mL，靜置1 h，超聲（100 W，45 kHz）處理1 h，濾過，將濾液濃縮轉移至10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2 檢測波長選擇 將“2.1.1”項下對照品溶液于200～600 nm 波長范圍內掃描，發(fā)現dactylorhin A、militarine 最大吸收波長均為224 nm，秋水仙堿最大吸收波長為242 nm，但在224 nm 處也有較好吸收。因此，選擇224 nm作為檢測波長。

2.3 色譜條件 DIKMA Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，10% A；10～40 min，10%～40% A；40～45 min，40%～10% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長224 nm；進樣量10 μL。

2.4 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分分離度理想，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.5 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液適量，甲醇定容至刻度，制成系列質量濃度對照品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，并分別以S／N＝3、S／N＝10 計算檢測限、定量限，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.6 精密度試驗 吸取“2.1.1”項下對照品溶液適量（質量濃度分別為dactylorhin A 29.9 μg／mL、militarine 83.5 μg／mL、秋水仙堿34.6 μg／mL），在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得dactylorhin A、militarine、秋水仙堿峰面積RSD 分別為0.64%、0.28%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取藥材粉末0.5 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、24 h 在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得dactylorhin A、militarine、秋水仙堿峰面積RSD 分別為0.62%、0.80%、1.04%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗 精密稱取藥材粉末0.5 g，共6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項下色譜條件進樣測定，測得dactylorhin A、militarine、秋水仙峰面積RSD 分別為0.66%、0.79%、0.37%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取藥材粉末0.25 g，平行6份，按100%水平精密加入對照品溶液適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。2.10 樣品含量測定 精密稱取藥材粉末3份，每份0.5 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）

表3 各成分含量測定結果（mg／g）

3 討論

本實驗考察不同流動相體系（乙腈-水、甲醇-水）的分離效果，比較超聲法、回流法對于成分提取的效果。結果，以甲醇-水為流動相體系所得的目標峰理論塔板數低，militarine、秋水仙堿色譜峰分離度差，且基線不平穩(wěn)，而乙腈洗脫能力強、黏度低，可以提高色譜峰理論塔板數，使出峰提前，有效縮短進樣檢測時間，故選擇以乙腈-水為流動相，經過不斷調整洗脫梯度，使得3 個目標峰有較好的分離度。同時，進行超聲和回流提取方式的比較，測得兩者相差不大，超聲提取簡便、易操作、適用于多批次樣品提取，故選取超聲為提取方法。以乙腈-水為流動相對3 種成分進行分離和含量測定，表明該方法具有較好的準確性、精密度和重復性。

4 結論

山慈菇有著悠久的藥用歷史，具有抗腫瘤、降壓、抗菌、抗痛風等作用，開發(fā)潛力較大。本研究首次建立HPLC法對山慈菇中dactylorhin A、militarine、秋水仙堿進行含量測定，該方法準確、重復性好，可為山慈菇的質量控制提供參考。